蚓激酶用于治疗颈动脉粥样硬化的应用的制作方法

专利名称：：蚓激酶用于治疗颈动脉粥样硬化的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体地涉及蚓激酶用于制备治疗颈动脉粥样硬化药物的应用。
背景技术：
：动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是动脉壁变厚并失去弹性的几种疾病的统称，是动脉硬化中最常见而重要的类型。动脉粥样硬化的主要病变特征为动脉某些部位的内膜下脂质沉积，并伴有平滑肌细胞和纤维基质成分的增殖，逐步发展形成动脉粥样硬化性斑块(atheroscleroticplaque)。它是一种以中等和大动脉斑片状内膜下增厚(动脉粥样化)为特征的病变，可以减少或阻断血流，斑块部位的动脉壁增厚、变硬，斑块内部组织坏死后与沉积的脂质结合，形成粥样物质，称为粥样硬化。源于动脉粥样硬化的心脑血管疾病，是导致发病和死亡的主要因素。颈动脉作为脑动脉的上游血管，其硬化程度与脑血流供应直接相关。有报道[1]证实颈动脉斑块预测脑血管病变的敏感性为84%，特异性为79%。颈动脉粥样硬化引起脑梗死的机制有多种(l)动脉粥样硬化斑块不稳定、破裂、脱落的小斑块栓塞远端血管；(2)动脉粥样硬化斑块表面粗糙，血小板和凝血因子被激活，形成血栓；(3)动脉粥样硬化斑块不断增大，导致颈动脉狭窄，使远端的灌注压下降，分水岭区供血不足，形成低灌注性脑梗死。蚓激酶是一种多组分酶制剂，其包含纤维蛋白溶酶(plasmin)和纤维蛋白溶酶原激活剂(plasminogenActivator)成分，具有直接溶解纤维蛋白和激活酶原间接溶解蛋白的作用。适用于治疗心、脑血管栓塞性疾病以及预防纤维蛋白原增高和血小板聚集率增高的疾病。临床试验证明，本药的胶囊剂对缺血性脑血管病、中风瘫痪肢体及语言障碍的恢复效果显著，是一种安全的纤溶药物。目前的基础研究已经证实纤维蛋白原及其降解产物参与了血栓形成和动脉粥样硬化的发展过程，流行病学研究证实纤维蛋白原是动脉粥样硬化的独立危险因素。近年来研究发现纤维蛋白原(Fg)及其降解产物(Fb和FDPs)可能是通过介导炎症反应，在AS发生发展中起了非常重要的作用。目前临床还未有从降低纤维蛋白原的角度对AS进行治疗的方法和药物应用。发明概述在一个方面中，本发明提供一种蚓激酶，所述蚓激酶是应用包括下列步骤的方法进行制备的1)蚯蚓清洗将活蚯蚓用水清洗后，加入白砂糖，或氯化钠，在室温下搅拌均匀，静置，剌激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用温水将蚯蚓身上的糖或氯化钠及污物洗去；2)制浆加入蚯蚓体积的18倍的水，将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆；43)除渣除去步骤2)得到的匀浆中的粗渣；4)澄清处理经步骤3)除渣后的匀浆液，得到澄清液；5)分离采用阴离子交换层析柱或亲和层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，收集活性峰部分的层析流出液；6)浓縮脱盐过滤步骤5)收集的层析液，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，得到除盐浓縮液；7)澄清过滤滤除步骤6)得到的除盐浓縮液中的悬浮颗粒，得到澄清液；8)除菌处理步骤7)的澄清液，除去菌体，达到药典质量标准。在一个实施方案中，所述制备蚓激酶的方法还包括9)干燥将步骤8)除菌后的澄清液进行干燥，得到蚓激酶干粉。在一个实施方案中，在步骤1)中将活露天红赤子爱胜蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓加入0.10.3公斤白砂糖，或0.20.4公斤氯化钠，在室温下搅拌均匀，静置2040分钟，剌激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用305(TC的温水将蚯蚓身上的糖或氯化钠及污物洗去。在一个实施方案中，在步骤2)中，用珠磨、胶体磨机或高压匀浆机将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆。在一个实施方案中，在步骤3)中，将步骤2)得到的匀桨用滤网孔径为520mm的不锈钢过滤器过滤，或使用离心机，除去匀浆中的粗渣。在一个实施方案中，在步骤4)中，经步骤3)除渣后的匀浆液，采用高速离心机或微孔膜过滤器处理，得到澄清液。在一个实施方案中，在步骤5)中，采用阴离子交换层析柱或亲和层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，用0.010.8M的醋酸盐洗脱，收集活性峰部分的层析流出液。在一个实施方案中，在步骤6)中，采用标准截流分子量为0.550K的平板膜、巻式膜或中空纤维超滤装置过滤步骤5)收集的层析液。在一个实施方案中，在步骤7)中，采用孔径为0.452ym的深层微孔膜或折叠式膜微孔膜过滤装置，滤除步骤6)得到的除盐浓縮液中的悬浮颗粒，得到澄清液。在一个实施方案中，在步骤8)中，采用0.22ym的除菌滤膜过滤装置及辐照装置处理步骤7)的澄清液。在一个实施方案中，在步骤9)中，在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液于-30-4(TC下冷冻812小时；然后在0.2mmHg的真空度下，升温至253(TC，干燥10小时；继续升温至363『C，真空干燥1415小时，得到蚓激酶干粉；或是在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液用泵打入喷雾干燥机内，经压縮空气雾化后在15025(TC热风中脱水，得到蚓激酶干粉。在一个实施方案中，所述蚓激酶包含下列组分EFE-a(分子量24663，N端序列VallieGlyGlyThrAsnAlaSerProGlyGluPheProTrpGinLeuGln;等电点3.46);EFE-b(分子量29515，N端序歹lJ:IleValGlyGlyIleGluAlaArgProTyrGluPheProProGinValSerValArg，等电点3.50)，EFE-c(分子量29690，N端序歹lJ:IleValGlyGlylieGluAlaArgProTyrGluPheProProGinValSerValArg，等电点3.50)，EFE-d(29595，N端序列:IleValGlyGlylieGluAlaArgProTyrGluPheProProGinValSerValArg，等电点3.46)，EFE-e(分子量24201，N端序列IlelieGlyGlySerAsnAlaSerProGlyGluPheProTrpGinLeu，等电点:3.68)，EFE-f(分子量:24170，N端序列IlelieGlyGlySerAsnAlaSerProGlyGluPheProTrpGlnLeu，等电点3.62)，EFE-g(分子量23028，N端序列:ValValGlyGlySerAspThrThrLysGlyGinTyrPro，等电点3.94)。在一个实施方案中，所用的蚯蚓为露天红赤子爱蚯蚓。在第二方面中，本发明提供由第一方面获得的蚓激酶用于制备治疗颈动脉粥样硬化药物的应用。在第三方面中，本发明提供一种药物，所述药物包含由第一方面获得的蚓激酶作为活性成分。顿激酶的效价测定步骤如下—、蚓激酶标准液的配制取蚓激酶标准品万IU蚓激酶IU/ml标准液；8000蚓激酶IU/ml标准液氯化钠生理盐水0.2ml;6000蚓激酶IU/ml标准液氯化钠生理盐水0.4ml;4000蚓激酶IU/ml标准液氯化钠生理盐水0.6ml;2000蚓激酶IU/ml标准液氯化钠生理盐水O.8ml。二、样品配制精密称取蚓激酶或蚓激酶胶囊(粉)适量，加0.9%生理盐水至50ml容量瓶溶解，待用。三、滴盘(—)取配好的纤维蛋白原_琼脂糖盘；(二)取顿激酶标准液10000IU/ml、8000IU/ml、6000IU/ml、4000IU/ml、2000IU/ml各10iil，滴于盘中；(三)取lOiU样品滴于盘中，37t:，培养18小时测量溶圈直径，每个样品作两个平行。四、结果以标准样品浓度对数(Y)及直径乘积对数(X)分别为横纵坐标得回归方程，样品测定的结果带入回归方程得相对应的样品浓度对数，按公式计算得样品效价。每毫克顿激酶效价单位大概在12000IU/mg蚓激酶经临床实验验证并报国家食品药品监督管理局批准，治疗剂量为饭前半小时口服60万IU/次，一日3次。详见药品说明书。本发明包括一个临床实施方案，具体的实施方案流程如下—、病例筛选一支，用0.9X氯化钠生理盐水^ml溶解，即为10000:取10000蚓激酶IU/ml蚓激酶标准液0.8ml，加0.9%:取10000蚓激酶IU/ml蚓激酶标准液0.6ml，加0.9%:取10000蚓激酶IU/ml蚓激酶标准液0.4ml，加0.9%:取10000蚓激酶IU/ml蚓激酶标准液0.2ml，加0.9%筛选标准纳入标准1)年龄在40-80岁，男女均可；2)近6个月内有前循环缺血性脑卒中或TIA病史①缺血性脑卒中或TIA符合第四届全国脑血管病会议制定的诊断标准；②缺血性脑卒中患者有颈内动脉供血区(包括皮质或白质)异常的局灶性神经功能缺失体经征，持续24h以上；③缺血性脑卒中患者发病72h内行头颅CT或MRI检查，显示相应大脑半球皮质或皮质下低密度梗死灶；3)经彩超确定双侧颈动脉任一条内膜中层厚度^1.2mm。4)纤维蛋白原>2.0g/L者。5)能够并愿意签署知情同意。排除标准1)房颤、感染性心内膜炎等引起的脑栓塞患者；2)有出血倾向者(包括有自发性脑出血史者)；凝血酶时间、凝血酶原时间、部分凝血活化酶时间延长超过正常范围1倍；3)需长期服用华发令等药物抗凝治疗的；4)合并有肝、肾等重要脏器严重器质性疾病(Cr>正常值；ALT、BUN>正常值1.2倍)及造血系统、内分泌系统等严重原发性疾病患者。5)妊娠或哺乳期妇女；6)既往对蚓激酶有过敏史者；7)纤维蛋白原<1.Og/L;8)正在接受其他临床实验者或其他药物观察2周内者；9)计划进行大手术、颈动脉血管成形术的患者。最终纳入310例患者。二、病例分组开放式随机分为试验组和对照组试验组192例，对照组118例。两组患者的年龄、性别、血压、合并用药史、既往史等基线水平经检验无统计学差异。三、给药方法试验组口服百奥蚓激酶肠溶胶囊，60万IU/次，一日3次，饭前半小时服用，疗程12个月；(根据患者自身病情需求可合并应用降脂药、降压药、以及抗血小板药。)对照组除百奥蚓激酶肠溶胶囊，针对病情指标可以应用降脂药、降压药、以及抗血小板药。四、观察指标颈动脉彩色超声检查；①颈动脉粥样硬化检测方法采用彩色多普勒超声诊断仪，由超声科主治以上专门医师操作。7②检测部位以及要求分别检测双侧颈总动脉(CCA)、颈总动脉分叉处(BIF)及颈内动脉(ICA)颅外段，并在距分叉处1CM处测量并记录颈动脉BIF、CCA、ICA内膜中层厚度(IMT)和管壁内径，粥样斑块回声强度、数量、部位。③粥样斑块的诊断标准为IMT>1.2mm为斑块形成，颈动脉内膜光滑完整者为正常；斑块质地与周围组织相比呈低回声并表面粗糙不平为软斑，强回声且表面光滑者为硬斑，两者兼而有之为混合斑块。五、试验结果试验组左右颈动脉MT在治疗1年与入院时比较有显著变薄(p=0.000)，与对照组治疗1年比较显著变薄(P=0.000)。颈动脉易损斑块检出率在治疗1年与入院时以及与对照组治疗1年比较均有下降。左右颈动脉斑块数量与对照组比较治疗1年有下降(P=0.000);左右斑块体积在治疗1年与入院时相比较有减少(p=0.021)，与对照组比较治疗1年有显著减少(P=0.000)。具体实施例方式实施例1蚓激酶干粉的制备方法(1)1)蚯蚓清洗将10公斤活露天红赤子爱胜蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓加入0.2公斤棉白糖，在室温下搅拌均匀，静置40分钟，剌激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用3(TC的温水将蚯蚓身上的糖及污物洗去；2)制浆加入蚯蚓体积的1倍的水，用高压匀浆机将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆；3)除渣将步骤2)得到的匀桨用滤网孔径为5mm的不锈钢过滤器过滤，除去匀桨中的粗渣；4)澄清经步骤3)除渣后的匀浆液，采用高速离心机处理，得到澄清液；5)分离采用阴离子交换层析柱或亲和层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，用0.01M的醋酸盐洗脱，收集活性峰部分的层析流出液；6)浓縮脱盐采用标准截流分子量为0.5K的平板膜超滤装置过滤步骤5)收集的层析液，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，得到除盐浓縮液；7)澄清过滤采用孔径为2iim的深层微孔膜过滤装置，滤除步骤6)得到的除盐浓縮液中的悬浮颗粒，得到澄清液；8)除菌采用0.22iim的除菌滤膜过滤装置及辐照装置处理步骤7)的澄清液，除去菌体，达到药典质量标准；9)干燥在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液于-3(TC下冷冻8小时；然后在0.2mmHg的真空度下，升温至25"，干燥10小时；继续升温至36"，真空干燥15小时，得到65g蚓激酶干粉。实施例2蚓激酶干粉的制备方法(2)清洗将10公斤活露天红赤子爱胜蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓氯化钠0.3公斤的比例加入氯化钠，在室温下搅拌均匀后静置40分钟，剌激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用4(TC的温水将蚯蚓身上的糖及污物洗去。制浆用珠磨将蚯蚓破碎，加水(加水量为蚯蚓体积的8倍)制成匀浆；制成匀浆。除渣应用离心机除去匀浆中的粗渣，然后将除渣后的匀浆液用高速离心机处理获取澄清液。分离采用离子交换层析柱分离蚯蚓澄清液，用0.01M的醋酸盐洗脱，收集层析流出液的活性峰部分，浓縮脱盐采用标准截流分子量为50K的中空纤维膜超滤装置，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，得到除盐浓縮液。澄清过滤采用采用孔径为0.45i！m折叠式微孔滤膜过滤器滤除浓縮液中的悬浮颗粒得到澄清液。除菌采用0.22iim除菌滤膜过滤装置处理澄清液，除去菌体。干燥在无菌条件下将除菌后的澄清液放入盘中于_401:下冷冻12小时，然后在0.2mmHg的真空度下，将盘子底部的盘架升温至3(TC真空干燥10小时，稍后继续将盘架升温至3『C真空干燥14小时得到65g顿激酶干粉。实施例3蚓激酶干粉的制备方法(3)清洗将10公斤活露天红赤子爱胜蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓加糖0.1公斤的比例加入棉白糖，在室温下搅拌均匀后静置40分钟，剌激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用3(TC的温水将蚯蚓身上的糖及污物洗去。制浆用高压匀浆机将蚯蚓破碎，加水制成匀浆。除渣应用孔径为2mm不锈钢过滤器滤除匀浆中的粗渣，然后将除渣后的匀浆液用高速离心机处理获取澄清液。分离采用亲和层析柱分离蚯蚓澄清液，用0.5M的醋酸盐洗脱，收集层析流出液的活性峰部分，浓縮脱盐采用采用标准截流分子量为20K的巻式膜超滤装置，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，得到除盐浓縮液。澄清过滤采用采用孔径为lym深层微孔膜滤除浓縮液中的悬浮颗粒得到澄清液。除菌采用0.22iim除菌滤膜过滤装置处理澄清液，除去菌体。干燥在无菌条件下将除菌后的澄清液放入盘中于-3(TC下冷冻8小时，然后在0.2mmHg的真空度下，将盘子底部的盘架升温至25。C真空干燥10小时，稍后继续将盘架升温至36t:真空干燥15小时得到65g顿激酶干粉。实施例4蚓激酶干粉的制备方法(4)清洗将10公斤活露天红赤子爱胜蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓加糖0.3公斤的比例加入棉白糖，在室温下搅拌均匀后静置20分钟，剌激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用3(TC的温水将蚯蚓身上的糖及污物洗去。制浆用高压匀浆机将蚯蚓破碎，加水(加水量为蚯蚓体积的5倍)制成匀浆。除渣应用孔径为5mm不锈钢过滤器滤除匀浆中的粗渣，然后将除渣后的匀浆液用高速离心机处理获取澄清液。分离采用亲和层析柱分离蚯蚓澄清液，收集层析流出液的活性峰部分，浓縮脱盐采用平板膜超滤装置，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，得到除盐浓縮液。澄清过滤采用深层微孔膜滤除浓縮液中的悬浮颗粒得到澄清液。除菌采用0.22m除菌滤膜过滤装置处理澄清液，除去菌体。干燥在无菌条件下将除菌后的澄清液放入盘中于_301:下冷冻8小时，然后在0.2mmHg的真空度下，将盘子底部的盘架升温至25。C真空干燥10小时，稍后继续将盘架升温至36t:真空干燥15小时得到65g顿激酶干粉。实施例5蚓激酶干粉的制备方法(5)清洗将10公斤活露天红赤子爱胜蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓加糖0.3公斤的比例加入棉白糖，在室温下搅拌均匀后静置20分钟，剌激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用5(TC的温水将蚯蚓身上的糖及污物洗去。制浆用高压匀浆机将蚯蚓破碎，加水制成匀浆。除渣应用孔径为5mm不锈钢过滤器滤除匀浆中的粗渣，然后将除渣后的匀浆液用高速离心机处理获取澄清液。分离采用亲和层析柱分离蚯蚓澄清液，用0.8M的醋酸盐洗脱，收集层析流出液的活性峰部分，浓縮脱盐采用平板膜超滤装置，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，得到除盐浓縮液。澄清过滤采用深层微孔膜滤除浓縮液中的悬浮颗粒得到澄清液。除菌采用0.22iim除菌滤膜过滤装置处理澄清液，除去菌体。干燥在无菌条件下将除菌后的澄清液放入盘中于-301:下冷冻8小时，然后在0.2mmHg的真空度下，将盘子底部的盘架升温至25。C真空干燥10小时，稍后继续将盘架升温至36t:真空干燥15小时得到65g顿激酶干粉。实施例6蚓激酶干粉的制备方法(6)清洗将10公斤活露天红赤子爱胜蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓加糖0.3公斤的比例加入棉白糖，在室温下搅拌均匀后静置20分钟，剌激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用5(TC的温水将蚯蚓身上的糖及污物洗去。制浆用胶体磨机将蚯蚓破碎，加水制成匀浆。除渣应用孔径为5mm不锈钢过滤器滤除匀浆中的粗渣，然后将除渣后的匀浆液用微孔膜过滤器处理获取澄清液。分离采用亲和层析柱分离蚯蚓澄清液，收集层析流出液的活性峰部分，浓縮脱盐采用平板膜超滤装置，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，得到除盐浓縮液。澄清过滤采用深层微孔膜滤除浓縮液中的悬浮颗粒得到澄清液。除菌采用0.22iim除菌滤膜过滤装置处理澄清液，除去菌体。干燥在无菌条件下将除菌后的澄清液放入盘中于_301:下冷冻8小时，然后在0.2mmHg的真空度下，将盘子底部的盘架升温至25。C真空干燥10小时，稍后继续将盘架升温至36t:真空干燥15小时得到65g顿激酶干粉。实施例7.纤维蛋白原与颈动脉粥样硬化关系以及百奥蚓激酶干预的临床研究目的调查缺血性脑卒中患者纤维蛋白原水平以及其与颈动脉粥样硬化的关系；观察长期口服降纤干预后纤维蛋白原的变化以及对颈动脉粥样硬化的影响。方法采用多中心、开放、平行、对照临床试验研究，选取苏州地区11家医院20072009年入院的短暂性脑缺血发作和脑梗死患者，采用随机方法将入选患者分为两组，对照组给予常规的神经内科治疗，试验组在此基础上加用百奥蚓激酶60万单位(相当于O.05g在实施例1中制备的蚓激酶干粉)/次，口服，一日3次，随访观察时间为l年，分别检测入院及治疗1年的颈动脉彩色超声检查颈内动脉内膜中层厚度(MT)、根据斑块回声强度和分布位置计算易损斑块检出率、测量颈动脉斑块数量并计算斑块体积等指标[2—4]。FoUrcelot[5]等认为，低回声、易出血、变化快、体积短期内增大的斑块引发卒中的危险性高。结果最终纳入310例患者试验组192例；对照组118例。两组患者的基线水平无统计学差异。左右颈动脉IMT(颈内动脉内膜中层厚度)(见附表1)治疗l年与入院时比较有显著变薄(P=0.000)，与对照组治疗1年比较有显著变薄(p=0.000)。颈动脉易损斑块检出率(见附表2)在治疗l年与入院时以及与对照组治疗l年比较均有下降；左右斑块体积(见附表3)在治疗1年与入院时相比较有减少(p=0.021)，与对照组治疗1年比较有显著减少(均P=0.000)。结论缺血性脑卒中患者长期口服降纤治疗，可明显改善患者神经功能预后，降低血浆纤维蛋白原、提高血纤溶活性，改善颈动脉粥样硬化。表1颈内动脉内膜中层厚度(MT)组别nIMT均值(mm)P值试验组入组l卯1.26±0.49(T)一年1611.03土0.40'0.001左IMT对照组入组1131.38±0.52(S)一年1081.62士0.56'o扁试验组入组1881.25±0.51(T)一年1601.06土0.35'0.001右IMT对照组入组1121.40±0.79(S)一年1081.59士0.69'0，表2据斑块回声强度和分布位置计算易损斑块检出率统计11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例8蚯蚓纤溶酶多种组分的分离、提纯、制备工艺—、材料1、蚓激酶粗粉2、层析柱Hipr印16/10DEAE柱，阴离子交换层析柱，RESOURCEQ(6ml)，阴离子交换层析柱MonoQHR5/5，阴离子交换层析柱RESOURCEIS0，疏水层析柱RESOURCEPHE，疏水层析柱以上层析柱均购自PharmaciaBiotech公司。3、溶液(l)20mmol/LTris-HClBuffer,pH7.5;(2)20,1/LTris-HClBuffer,pH8.5;(3)20,1/LTris-HClBuffer,pH8.5，含lmol/LNaCl;(4)0.lmol/LNa-PiBuffer,pH7.0;含3.Omol/L(NH4)2S04;(5)50,1/LNa-PiBuffer,pH7.0;含1.5mol/L(NH4)2S04;(6)50,1/LNa-PiBuffer,pH7.0;二、方法1、样品的准备蚓激酶干粉5g，用20mmol/LpH8.5的Tris-HClBuffer溶解，配成50mg/ml的溶液。2、层析柱的使用以下所用层析柱(均为PharmaciaBiotech公司预装柱)的使用均按照层析柱所附说明书进行。3、粗分离采用Hipr印16/10DEAE柱进行粗分离。每次取上述溶解好的样品4ml(200mg)上样。以20,1/LTris-HClBuffer,pH8.5为初始缓冲液，20mmol/LTris-HClBuffer,pH8.5，含lmol/LNaCl为洗脱缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为3ml/min，温度为19。C，得到三个活性峰，Dl，D2，D3。4、精细纯化(l)Dl浓縮后换缓冲液至20mmol/LpH8.5Tris-HClBuffer(总体积26ml)，每次取750ul，过RESOURCEQ(6ml)柱，以20mmol/LTris-HClBuffer，pH8.5为初始缓冲液，20mmol/LTris-HClBuffer,pH8.5，含lmol/LNaCl为洗脱缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为3ml/min，温度为19。C，得到三个活性峰D1RQ1，D1RQ2，D1RQ3;每个活性峰浓縮、换缓冲液至20mmol/LTris-HClBuffer,pH8.5后与含有3.0mol/L(NH4)2S0j々0.lmol/LNa-PiBuffer,pH7.0等体积混合，然后过RESOURCEIS0柱，以50mmol/LNa-PiBuffer,pH7.0;含1.5mol/L(NH4)2S04为初始缓冲液，50mmol/LNa-PiBuffer，pH7.0为洗脱缓冲液进行(NH4)2S04梯度洗脱，流速为lml/min，温度为23°C，得到纯品:D1RQ1H(即EFE-f)，D1RQ2H(即EFE-e)，D1RQ3H(即EFE-d);(2)D2浓縮后对50mmol/LNH4HC03透析，然后冻干。每次取冻干产物3mg溶解在50mmol/LNa-PiBuffer,pH7.O，含1.5mol/L(NH4)2S04中过RESOURCEISO柱，以50mmol/LNa-PiBuffer,pH7.O，含1.5mol/L(NH4)2S04为初始缓冲液，50mmol/LNa-PiBuffer，pH7.0为洗脱缓冲液进行(NH》^(^梯度洗脱，流速为lml/min，温度为23°C，收集活性峰，浓縮、换缓冲液至20mmol/LTris-HClBuffer，pH7.5后过MonoQHR5/5纯化，以20mmol/LTris-HClBuffer,pH7.5为初始缓冲液，20mmol/LTris-HClBuffer,pH7.5，含lmol/LNaCl为洗脱缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为0.5ml/min，温度为19°C，得到一活性组分纯品，即EFE-a;(3)将D3浓縮、换缓冲液至20,1/LTris-HClBuffer,pH7.5后(总体积80ml)与含有3.0mol/L(NH4)2S04的0.lmol/LNa-PiBuffer,pH7.0等体积混合。每次取混合好的样品溶液lml，上RESOURCEISO柱，初始缓冲液为50mmol/LNa-PiBuffer,含1.5mo1/L(NH4)2S04，pH7.0，洗脱缓冲液为50mmol/LNa-PiBuffer,pH7.0，采用(NH4)2S04梯度洗脱，流速为lml/min，温度为23。C，得到两个活性峰D3H1，D3H2;将D3H1浓縮、换缓冲液至20mmol/LTris-HClBuffer,pH8.5后过MonoQHR5/5纯化，以20mmol/LTris-HClBuffer,pH8.5为初始缓冲液，20mmol/LTris-HClBuffer,pH8.5，含lmol/LNaCl为洗脱缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为0.5ml/min，温度为19°C，得到两个活性组分纯品D3H1M1(即EFE-b)，D3H1M2(即EFE-c);将D3H2浓縮、换缓冲液至50mmol/LNa-PiBuffer,pH7.0后与含有3.Omol/L(NH4)2S04的0.lmol/LNa-PiBuffer,pH7.0等体积混合过RESOURCEPHE，初始缓冲液为50mmol/LNa-PiBuffer,1.5mol/L(NH4)2S04，pH7.0，洗脱缓冲液为50mmol/LNa-PiBuffer,pH7.O，采用(NH4)2S04梯度洗脱，流速为lml/min，温度为23°C，收集活性峰，得到一活性组分的纯品D3H2P1(即EFE-g)5、其中组分的鉴定通过以上流程制备的七种组分(EFE-a、EFE-b、EFE-c、EFE-d、EFE-e、EFE-f、EFE-g)的精确分子量(MOLDI-TOFMS测定值)、N端序列和等电点(见下表1):表1蚓激酶干粉分离、纯化得到的组分<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>参考文献[1]李莉，姜玉新，乌正赉，等.高血压及心脑血管疾病与颈动脉粥样硬化[J].中华心血管病杂志，1996,24:126-129.[2]刘勇，李自成.颈动脉超声在动脉粥样硬化性疾病中的应用[J].中国医学影像技术，2003，19(1):117-119.[3]袁桂莉，王义成.颈动脉超声在动脉粥样硬化性疾病检测中的应用[J].中华老年心脑血管病杂志，2005，7(5):349-350.[4]罗俊，燕纯伯.颈动脉超声对动脉粥样硬化性疾病的研究进展[J].心血管病学进展，2005，1:1-4.[5]FourcelotL，TranqimrtF，BrayJM，etal.Ultrasoundcharacterizationandqimntificationofcarotidatherosclerosislesions[J]MinervaCardioangiol，1999,47(1):15-24.序列表〈110〉北京百奥药业有限责任公司<120>顿激酶用于治疗颈动脉粥样硬化的应用〈130〉IB096344〈160>7〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>17〈212>PRT〈213〉赤子爱蚯蚓〈400〉1VallieGlyGlyThrAsnAlaSerProGlyGluPheProTrpGinLeu151015Gin〈210>2〈211>19〈212>PRT〈213〉赤子爱蚯蚓〈400>2lieValGlyGlylieGluAlaArgProTyrGluPheProProGinVal151015SerValArg〈210>3<211>19<212>PRT〈213〉赤子爱蚯蚓〈400>3lieValGlyGlylieGluAlaArgProTyrGluPheProProGinVal151015SerValArg〈210>4〈211>1915〈212>PRT〈213〉赤子爱蚯蚓〈400>4lieValGlyGlylieGluAlaArgProTyrGluPheProProGinVal151015SerValArg〈210>5〈211>16〈212>PRT〈213〉赤子爱蚯蚓〈400>5lielieGlyGlySerAsnAlaSerProGlyGluPheProTrpGinLeu151015〈210>6〈211>16〈212>PRT〈213〉赤子爱蚯蚓〈400>6lielieGlyGlySerAsnAlaSerProGlyGluPheProTrpGinLeu151015〈210>7〈211〉13〈212>PRT〈213〉赤子爱蚯蚓〈400>7ValValGlyGlySerAspThrThrLysGlyGinTyrPro1510权利要求一种蚓激酶，所述蚓激酶是应用包括下列步骤的方法进行制备的1)蚯蚓清洗将活蚯蚓用水清洗后，加入白砂糖，或氯化钠，在室温下搅拌均匀，静置，刺激蚯蚓将其消化道内的分泌物吐尽，然后用温水将蚯蚓身上的糖或氯化钠及污物洗去；2)制浆加入蚯蚓体积的1～8倍的水，将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆；3)除渣除去步骤2)得到的匀浆中的粗渣；4)澄清处理经步骤3)除渣后的匀浆液，得到澄清液；5)分离采用阴离子交换层析柱或亲和层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，收集活性峰部分的层析流出液；6)浓缩脱盐过滤步骤5)收集的层析液，滤除无机盐和小分子物质，脱去大部分水，得到除盐浓缩液；7)澄清过滤滤除步骤6)得到的除盐浓缩液中的悬浮颗粒，得到澄清液；8)除菌处理步骤7)的澄清液，除去菌体，达到药典质量标准。2.权利要求1的蚓激酶，其还包括9)干燥将步骤8)除菌后的澄清液进行干燥，得到蚓激酶干粉。3.权利要求1或2的蚓激酶，在步骤1)中将活露天红赤子爱胜蚓用水清洗后，按每公斤蚯蚓加入0.10.3公斤白砂糖，或0.20.4公斤氯化钠，在室温下搅拌均匀，静置2040分钟，剌激蚯顿将其消化道内的分泌物吐尽，然后用305(TC的温水将蚯顿身上的糖或氯化钠及污物洗去。4.权利要求1或2的蚓激酶，在步骤2)中，用珠磨、胶体磨机或高压匀浆机将经步骤1)清洗过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆。5.权利要求1或2的蚓激酶，在步骤3)中，将步骤2)得到的匀浆用滤网孔径为520mm的不锈钢过滤器过滤，或使用离心机，除去匀桨中的粗渣。6.权利要求1或2的蚓激酶，在步骤4)中，经步骤3)除渣后的匀浆液，采用高速离心机或微孔膜过滤器处理，得到澄清液。7.权利要求1或2的蚓激酶，在步骤5)中，采用阴离子交换层析柱或亲和层析柱分离步骤4)得到的蚯蚓澄清液，用0.010.8M的醋酸盐洗脱，收集活性峰部分的层析流出液。8.权利要求1或2的蚓激酶，在步骤6)中，采用标准截流分子量为0.550K的平板膜、巻式膜或中空纤维超滤装置过滤步骤5)收集的层析液。9.权利要求1或2的蚓激酶，在步骤7)中，采用孔径为0.452ym的深层微孔膜或折叠式膜微孔膜过滤装置，滤除步骤6)得到的除盐浓縮液中的悬浮颗粒，得到澄清液。10.权利要求1或2的蚓激酶，在步骤8)中，采用O.22ym的除菌滤膜过滤装置及辐照装置处理步骤7)的澄清液。11.权利要求2的蚓激酶，在步骤9)中，在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液于-30-4(TC下冷冻812小时；然后在0.2mmHg的真空度下，升温至253(TC，干燥10小时；继续升温至363『C，真空干燥1415小时，得到蚓激酶干粉；或是在无菌条件下将步骤8)除菌后的澄清液用泵打入喷雾干燥机内，经压縮空气雾化后在15025(TC热风中脱水，得到蚓激酶干粉。12.权利要求1或2的蚓激酶，其包含下列组分EFE-a(分子量24663，N端序列VallieGlyGlyThrAsnAlaSerProGlyGluPheProTrpGinLeuGln;等电点3.46);EFE-b(分子量29515，N端序列:IleValGlyGlyIleGluAlaArgProTyrGluPheProProGinValSerValArg，等电点3.50)，EFE-c(分子量29690，N端序列IleValGlyGlylieGluAlaArgProTyrGluPheProProGinValSerValArg，等电点3.50)，EFE-d(29595，N端序列:IleValGlyGlylieGluAlaArgProTyrGluPheProProGinValSerValArg，等电点3.46)，EFE-e(分子量24201，N端序列IlelieGlyGlySerAsnAlaSerProGlyGluPheProTrpGinLeu，等电点:3.68)，EFE-f(分子量24170，N端序列IlelieGlyGlySerAsnAlaSerProGlyGluPheProTrpGlnLeu，等电点3.62)，EFE-g(分子量23028，N端序歹lj:ValValGlyGlySerAspThrThrLysGlyGinTyrPro，等电点3.94)。13.权利要求1-12中任一项的蚓激酶用于制备治疗颈动脉粥样硬化药物的应用。14.一种药物，所述药物包含权利要求1-12任一项的蚓激酶作为活性成分。全文摘要本发明提供一种蚓激酶及其用于制备治疗颈动脉粥样硬化的药物的应用，以及包含所述蚓激酶作为活性成分的药物。文档编号A61K38/43GK101717761SQ200910238770公开日2010年6月2日申请日期2009年11月24日优先权日2009年11月24日发明者李昕,王砺,高毓涛申请人:北京百奥药业有限责任公司