重组白蛋白在肝衰竭后透析中的用途的制作方法
专利名称：重组白蛋白在肝衰竭后透析中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组人血清白蛋白(HSA)在肝脏透析中的用途。
肝衰竭是一种具有高危险致死后果的严重疾病，通常是由肝炎病毒或中毒引起的。在肝衰竭的情况下，肝脏中白蛋白的再生受到抑制。由于白蛋白是血液中蛋白质结合毒性物质(PBTS)的主要转运系统之一，这导致毒性物质在血液中积累。最终结果将是患者意识丧失及最终死亡，除非找到合适的供体肝脏并及时移植。通过透析从患者的血液中，更准确的说，从血液中的白蛋白中清除这些毒性物质，可有助于延长这个时间，直到找到合适的移植器官。有些情况下透析甚至可以使肝脏有时间自身再生，从而不需要移植。
当前，使用多种系统从白蛋白中清除毒性物质。包括用输入的白蛋白置换患者的白蛋白，或者直接使患者血液在基于活性炭的吸附器上通过——这种方法可能导致不希望的多种血液成分的活化。
另外一种方法是使用透析系统，例如美国专利5,744,042中公开的透析系统。这些系统避免患者血液直接接触纯化物质，使用次级回路，该次级回路中填充有一种能够接收与患者白蛋白结合的毒性物质的物质，例如白蛋白溶液。通过膜界面，毒性物质从患者自身白蛋白向来自次级回路的白蛋白发生转移。后者然后通过位于该次级回路中的一个或几个吸附器得以再生。
迄今为止，在上述透析系统中使用的人血清白蛋白通常还是由天然来源制备的，例如通过分级分离从大量献血者采集、合并的血液而制备的。但是，这种制备方法明显具有污染诸如肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒或新变型克雅氏病病原体等病原体的危险。因此，为了制备非常安全的产品，从人血液中纯化HSA包括对终产品进行巴氏消毒的时间较长的步骤，但是危险仍然不能排除，特别是在考虑到热稳定病原体时。美国专利5,744,042公开了也能够使用重组白蛋白代替来自天然来源的白蛋白。
过去，曾经注意到迄今为止在肝脏透析中使用的白蛋白都具有较低的毒性蛋白质容量。这使得透析过程的效率较低。
因此本发明所针对的问题是需要提供一种改良的白蛋白，它提高了肝衰竭中血液透析的效率，同时应当可以低成本获得。
根据本发明的一个方面，通过在透析中使用重组HSA来解决这一问题，其中该重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
令人惊讶的是，已经发现，在透析中，特别是在肝衰竭后的透析中，在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸的重组HSA比普通白蛋白效率高得多。
根据一个优选实施方案，效率提高至少10％，优选至少25％，更优选至少50％。
根据本发明，术语“透析”是指体液，特别是血液的离体过滤方法。
对于本申请而言，术语“HSA”是指最初在人血液中发现的白蛋白超家族的人蛋白质，及其天然或合成修饰的变体。人白蛋白的大量多态性和突变体为本领域技术人员所公知(T.Peters，All about AlbuminBiochemistry，Genetics and Medical Applications，Academic Press Incl，1996)，并且包括在术语“HSA”的范围之内，以及人蛋白质的片段，包括至少1/3、优选2/3以上的蛋白质序列。
其它变体可以通过向编码HSA的基因中置换、插入或添加核苷酸获得，并且包括在本申请使用的术语“HSA”的范围之内，只要这样获得的HSA核苷酸序列与天然序列有至少75％的同源性，其中至少85％的同源性是优选的，至少90％的同源性是最优选的。
在本发明的优选实施方案中，重组HSA进一步纯化除去其它伴随物质，优选蛋白质，例如激素，或金属，或金属离子。
根据本发明，HSA可以从能够产生重组HSA的任何来源获得。包括在原核或真核细胞系中以及在任何转基因非人类动物、植物或转基因禽类的蛋中产生HSA。真核细胞系也可以是酵母株，但是酵母以外的真核细胞系是优选的。转基因非人类动物是最优选的。
在细胞系中产生HSA的方法包括用编码HSA的核酸转染细胞，在允许HSA表达的条件下培养细胞，以及从细胞中分离HSA。这些方法在本领域公知(T.Peters，All about AlbuminBiochemistry，Genetics andMedical Applications，Academic Press Incl，1996)。从这篇文献中也可以获得关于HSA的一般信息及关于其贮存的进一步的信息。
在转基因动物中产生HSA的方法在本领域也公知。包括用编码HSA的异源DNA和用于在转基因动物中表达该蛋白质的调节序列转化非人类动物的单细胞，以及转基因动物的再生(WO91/08216；Bondioli等人，Biotechnology，vol.16(1961)，265；Ebert等人，Bio/Technology，vol.9(1991)，835；Hammer等人，Nature，vol.315(1985)，680；Houdebine L.M.(编著)，Transgenic Animals-Generation and Use，Harwood AcademicPublishers GmbH(1996)，Amsterdam；Pinkert C.A.(编著)，TransgenicAnimal Technology；A Laboratory Handbook.Academic Press，San Diego(1994)，CA)。
总之，可以利用现有技术中公知的大量方法中的任何一种用核酸转化细胞。例如，转基因非人类动物可以利用一种包括如下步骤的方法获得将编码HSA的核酸导入适当的非人类受体细胞中；由该受体细胞再生转基因非人类动物。
所述受体细胞优选为胚细胞，但是也可以使用其它细胞型。由胚受体细胞再生转基因非人类动物可以包括将该细胞转移到雌性非人类动物中，并且使胚胎在其中生长。
产生转基因非人类动物的方法可以进一步包括动物的克隆。克隆动物的方法是本领域技术人员公知的(Baguisi等人，Nature Biotech.，vol.17(1999)，456-461；Campbell等人，Nature，vol.380(1996)，64-66，Cibelli等人，Science，vol.280(1998)，1256；Kato等人，Science vol.282(1998)，2095-2098；Schnieke等人，Science，vol.278(1997)，2130-2133；Vignon等人，C.R.Acad.Sci.Paris，Sciences de la vie/Life Sciences vol.321(1998)，735-745；Wakayama等人，Nature，vol.394(1998)，369-374；Wells等人，Biol.Reprod.vol.57(1997)，385-393；Wilmut等人，Nature，vol.385(1997)，813)，可以容易地根据本发明应用，来产生大量转基因动物。
在本发明的上下文中，HSA优选从牛、猪、马、啮齿动物或公山羊来源中获得。
在一个优选实施方案中，HSA从转基因非人类动物的奶或血液中获得，优选从哺乳期的牛的奶中获得(参见，例如，WO 96/02573)。
在一个替代实施方案中，HSA从转基因禽类的蛋中获得。所述转基因禽类优选地是鸡。在转基因母鸡中表达蛋白质以使该蛋白质转运到该母鸡的鸡蛋中的方法在本领域公知(参见，例如，Morrison等人，Immunotechnology，vol.4(1998)，115-125)。
根据本发明，使用的重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸，优选除去其它伴随物质。在本发明的上下文中，表述“伴随的脂肪酸或物质”是指在细胞系或转基因动物或植物中合成过程中与HSA附着的脂肪酸或物质。因此，所述细胞系或转基因动物或植物也产生这些脂肪酸或物质。而且，表述“伴随的脂肪酸或物质”也指在提取或纯化过程中，例如在除去细胞碎片或其它成分(例如从贮存含HSA溶液的容器中释放的金属离子)的过程中，与HSA附着的脂肪酸或物质。
在本发明的上下文中，表述“纯化除去”是指从HSA中一定程度地除去脂肪酸，而使HSA的结合能力提高。在本发明的一个优选实施方案中，除去至少50％、优选70％、更优选90％、最优选95％的脂肪酸。
脂肪酸程度的检测在本领域公知，例如可获自WAKO。一种合适的试剂盒是来自WAKO的Nefa-C-试剂盒。
本领域公知许多纯化HAS除去伴随脂肪酸的方法(参见，例如，WO 96/02573)。例如从转基因非人类动物中获得的HSA通常需要高程度地纯化除去副产物，否则在使用时会导致免疫或其它副作用。
纯化HAS除去伴随脂肪酸(优选地也除去其它物质)的一种适当方法，包括以优选1∶2、最优选至少1∶1的活性炭∶HSA比混合含有重组HSA的溶液与活性炭。但是，也可以使用其它浓度，例如2∶1或更高。
活性炭可以是粉末、颗粒、胶囊或压块(briquette)的形式。
纯化优选在pH低于3.5、更优选低于3.0的缓冲液中进行。
缓冲液优选地是磷酸盐缓冲液。但是也可以使用碳酸盐缓冲液或其它缓冲液，只要它们具有适当的缓冲容量和pH范围即可。
纯化优选地在室温下进行，优选进行至少30分钟。
在本发明的一个优选实施方案中，利用活性炭纯化重组HAS除去伴随的脂肪酸。
根据一个优选实施方案，重组HSA的制备包括一个澄清步骤。
优选地，通过过滤进行澄清。
作为一种不同的方法或合并使用的方法，重组HSA的制备可以包括从含有重组HSA的溶液中沉淀重组HSA。例如，通过一步沉淀步骤，可以从转基因非人类哺乳动物的奶或血液中高纯度地获得HSA。能够沉淀HSA的合适的试剂在本领域公知，可以由本领域技术人员利用简单的实验确定。然后，可以利用公知的方法将HSA重悬浮于希望的溶剂中。优选地，使用用于HSA的溶剂以简化HSA的进一步纯化(pH，离子的选择)。
此外，重组HSA的制备也可以包括从含有重组HSA的溶液中沉淀污染的蛋白质。
分离HSA的方法可以进一步包括一个或多个层析纯化步骤，该步骤可以按照本领域公知的大量层析方法中的任何一种来进行。优选使用亲和层析和/或离子交换层析(T.Peters，All about AlbuminBiochemistry，Genetics and Medical Applications，Academic Press Incl，1996)。
根据一个优选实施方案，重组HSA存在于透析液中。根据一个优选实施方案，重组HSA以占组合物的约1％-约40％、优选约5％-约30％w/vol、最优选20％的浓度存在于透析液中。关于在透析液中的使用，使用与本发明下文描述的透析液相同的实施方案。
在透析中，重组HSA将以充分或有效透析的量使用。这取决于例如患者的体重或疾病的严重程度，或者可以由肝脏透析领域的医学技术人员调整。
HSA优选地在充分适合贮存大量HSA的塑料容器中提供。优选地，但不是唯一地，可以是含有20％重组白蛋白溶液(w/vol)的600ml包装。可以使用标准玻璃容器，但是也可以使用任何类型的合适的塑料容器或低透气性袋子，例如，用于采集和贮存献血者血液的袋子。
根据一个进一步优选的实施方案，重组HSA存在于透析膜上。以下公开的关于本发明的透析膜的实施方案在这里也适用。
在整个本发明中，包括重组HSA在纯化除去伴随脂肪酸后与一定量的其它脂肪酸或相关物质如N-乙酰色氨酸、辛酸盐(octanoate或caprylate)组合，以便例如提高HSA的溶解度。优选地，在不超过20％w/w的HSA溶液中包含总共不超过32mM的这些物质，或者在不超过25％w/w的HSA溶液中包含不超过40mM的这些物质。优选地，只有一种物质与HSA组合。此外，也可以等量添加两种物质。
本发明进一步涉及透析患者血液的方法，其中使用如上所述定义、合成、制备和/或纯化的重组HSA。
本发明进一步涉及含有重组HSA的透析液，其中重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
在一个优选实施方案中，HSA具有如上所述的特征，或者如上所述合成、制备和/或纯化。
透析液含有在制备过程中已经纯化除去伴随脂肪酸的重组HSA。它用作蛋白质结合物质(PBS)以及可能具有结合白蛋白能力的游离物质的接纳体，这些物质将从液体(A)中除去。重组HSA的浓度优选地为约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，最优选约8-约20g/100ml。
透析液可以含有其它的盐，如NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、乳酸钠和一水合葡萄糖，其含量取决于特定患者血液中的电解质组成。例如，在低钾血症患者的透析中，需要较高浓度的钾离子。
碳酸氢盐缓冲的透析液中优选的离子浓度如下钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，碳酸氢根约30-约40mmol/1000ml，乙酸根约2-约10mmol/1000ml，人血清白蛋白约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，最优选约8-约20g/100ml。
碳酸氢盐缓冲的透析液中更优选的离子浓度如下钠约135-约140mmol/1000ml，钙约1.5-约2.0mmol/1000ml，钾约3.0-约3.5mmol/1000ml，镁约0.4-约0.6mmol/1000ml，氯约104-约108mmol/1000ml，碳酸氢根约34-约38mmol/1000ml，乙酸根约4-约8mmol/1000ml，人血清白蛋白约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，最优选约8-约20g/100ml。
乙酸盐缓冲的透析液中优选的离子浓度如下钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，乙酸根约30-约40mmol/1000ml，人血清白蛋白约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，最优选约8-约20g/100ml。
乙酸盐缓冲的透析液中更优选的离子浓度如下钠约135-约140mmol/1000ml，钙约1.5-约2.0mmol/1000ml，钾约3.0-约3.5mmol/1000ml，镁约0.4-约0.6mmol/1000ml，氯约104-约108mmol/1000ml，乙酸根约33-约38mmol/1000ml，人血清白蛋白约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，最优选约8-约20g/100ml。
透析液的一个实例每升透析液含有约10-约20重量％的人血清白蛋白，约6.1g NaCl，约4.0g乳酸钠，约0.15g KCl，约0.31g CaCl2x H2O，0.15g MgCl2x 6H2O，和1.65g一水合葡萄糖。
如果根据本发明的透析液用在如本发明或EP 615780A所述的透析系统中，可以使用任何适当的膜，例如包被有接纳体物质的膜。此外，也可以使用根据本发明的膜。
本发明进一步涉及一种膜，该膜用于通过对透析液(B)透析，从含有蛋白质结合物质的含蛋白质液体(A)中分离这些物质，其中在制备过程中已经纯化除去伴随脂肪酸的重组HSA附着于该膜的至少一侧，并且该膜孔径尺寸使蛋白质结合物质能够通过该膜。
根据一个优选实施方案，本发明的膜含有如上所述的重组HSA，该重组HSA如上所述合成、制备和/或纯化，以用于本发明。
本发明的膜优选包括两个功能不同的部分。一个部分具有实际的分离膜功能，在本发明方法的条件下允许蛋白质结合物质(PBS)和水溶性物质通过，而排除与液体(A)中的PBS结合的蛋白质和液体(B)中的重组HSA，另一部分具有开口(port)和吸附功能。优选地，该膜包被有如本发明全文所述的重组HSA。在一个优选实施方案中，本发明的膜包含一面向液体(A)侧的隧道样结构的薄层，该隧道的长度小于约10μm，直径小到足以排除液体(A)中的HSA，并且在透析液(B)侧具有开口和吸附结构。优选地，该膜在至少一侧，优选地在透析液(B)侧，包被有一层重组HSA薄膜。
本发明的膜可以具有平膜、大直径薄壁管或者优选地空心细纤维的肉眼可见的形式。膜技术、空心纤维膜和透析在Kirk-Othmer，Encyclopedia of Chemical Technology，第三版，第7卷(1979)，564-579页，特别是574-577页，第12卷(1980)，492-517页和第15卷(1981)，92-131页有描述。而且，膜和膜分离方法在Ullmann′s Encyclopedia of IndustrialChemistry，第五版，Vol A 16(1990)，187-263页有描述。
用于该膜的基质材料可以由多种材料制成，包括陶瓷、石墨、金属、金属氧化物和聚合物，只要它们对液体(A)和透析液(B)侧的蛋白质有亲和力即可。当前最广泛使用的方法有粉末烧结、薄膜拉伸、薄膜照射和蚀刻以及相转化技术。用于本发明的膜的优选材料是选自聚砜、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、丙烯腈聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、异丁烯酸聚合物和乙酸纤维素聚合物的有机聚合物。特别优选的是用例如聚乙烯吡咯烷酮亲水化的聚砜膜。
准确、完全地定义膜是相当困难的；参见Ullmann，同上，190-191页，2.1和2.2。膜在结构上可以是均匀的、多微孔的、或不均匀的、对称或非对称的。它可以是中性的，或者可以包含具有特定结合或复合能力的官能团。当前在分离技术中使用的最重要的膜是非对称膜；参见Ullmann，同上，219页及后文，4.2。已知的非对称膜具有“手指”型结构、具有分级孔径分布的海绵型结构或具有均匀孔径分布的海绵型结构；参见Ullmann，同上，223-224页。
本发明最优选的膜结构是一种非对称膜，它由一高度多孔结构的选择性薄皮肤层组成，具有以手指或通道形式从皮肤向下差不多垂直地穿透膜的孔。极薄的皮肤代表实际的膜，并且可能包含孔。多孔亚结构用作皮肤层的支持，允许重组HSA接近皮肤并接纳从液体(A)侧向透析液(B)侧穿透皮肤的蛋白质结合物质。
在分离程序之前，膜优选地如下处理。膜从液体(A)侧和/或从液体(B)侧用含有浓度约1-约50g/100ml、更优选约5-约20g/100ml的重组人血清白蛋白的液体，优选0.9％NaCl溶液处理。处理时间为约1分钟至约30分钟，优选约10分钟至约20分钟，处理温度为约15℃至约40℃，优选约18℃至约37℃。
本发明的膜的详述本发明的膜优选地包括两个功能不同的部分(区)。一个部分具有实际的分离膜功能，在本发明方法的条件下允许PBS和水溶性物质通过，而排除与液体(A)中的PBS结合的蛋白质和液体(B)中的重组HSA，另一部分具有开口和吸附功能。优选地，该膜包被有重组HSA。在一个优选实施方案中，本发明的膜包含一面朝向液体(A)侧的隧道样结构的薄层，该隧道的长度小于约10μm，优选小于约5μm，更优选小于约0.1μm，最优选为约0.01μm-约0.1μm。该隧道的直径小到足以排除液体(A)中的蛋白质，优选地允许分子量约20,000道尔顿至约66,000道尔顿、更优选约50,000道尔顿至约66,000道尔顿的分子穿过该隧道通过。优选地，该膜相对于液体(A)中蛋白质的筛系数小于0.1，更优选小于0.01。而且，该膜优选地在透析液(B)侧具有开口和吸附结构。这部分提供充分打开的结构，以允许透析液(B)中的重组HSA进入开口和吸附层，以接纳来自该膜液体(A)侧的PBS。而且，该部分的内表面用作PBS的吸附器，通过经下文所述的包被程序吸附的重组HSA吸附，或者被适合结合PBS的其它结构吸附。这种吸附可以是随时间稳定的或是可逆的。优选地，该膜在至少一侧覆盖有重组HSA薄膜。包含本发明的膜的一种商品透析器可以在液体(B)侧含有重组HSA溶液。
本发明的膜可以是具有平膜、大直径薄壁管或者优选地空心细纤维的肉眼可见的形式。
用于该膜的基质材料可以由多种材料制成，包括陶瓷、石墨、金属、金属氧化物和聚合物，只要它们对液体(A)和透析液(B)侧的蛋白质有亲和力即可。当前最广泛使用的方法有粉末烧结、薄膜拉伸、薄膜照射和蚀刻以及相转化技术。用于本发明的膜的优选材料是选自聚砜、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、丙烯腈聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、异丁烯酸聚合物和乙酸纤维素聚合物的有机聚合物。
本发明中使用的优选聚合物膜是例如用聚乙烯吡咯烷酮亲水化的高通透性非对称聚砜膜，例如Fresenius AG的HF 80。
这些膜和膜组件、透析柱、人工肾膜系统例如可从Fresenius AG(例如HF 80)、GAMBRO AB(例如Polyflux)、Baxter Inc.(例如CT190G)购得。
第一部分膜面向液体(A)侧的层或结构提供实际的膜，允许蛋白质结合物质和水溶性物质，即低分子物质和“中等大小分子”，从液体(A)侧向透析溶液(液体(B)侧)选择性转移。于是，顺着不想要的物质从液体(A)侧向透析液(B)侧逐渐降低的浓度梯度，不想要的物质从液体(A)侧向透析液(B)侧发生有效净转移。实际的膜必须满足三个条件1.隧道必须足够短，优选小于约5μm，更优选小于约1μm，最优选小于约0.1μm。
2.隧道直径必须大到足以允许不想要的分子通过，而又小到足以阻止液体(A)中所含的想要的分子向液体(B)通过以及重组HSA从液体(B)向液体(A)通过。在血浆或血液作为液体(A)的情况下，排阻限优选地为约66,000道尔顿。优选地，膜相对于液体(A)中蛋白质的筛系数小于0.1，更优选小于0.01。
3.实际膜面向液体(A)侧的层或结构的化学、物理等结构允许不想要的物质通过，例如，疏水性和亲水性微域。
第二部分膜面向液体(B)侧的层或结构通常以海绵样或手指样方式提供更开放的膜结构。该部分在膜该部分内提供重要的开口和吸附功能1.由于膜的该部分的开放间隔(open-spaced)结构，来自透析液(B)侧的重组HSA可以接近上述该结构面向液体(A)侧的透析液侧孔，并且接纳不想要的物质，例如从液体(A)侧穿过隧道样结构通过的蛋白质结合物质。
2.由于该结构呈现较大的总表面积，它通过附着的分子吸附大量的蛋白质结合物质(PBS)，所述附着分子在这种间接膜吸附中起一种间隔物的作用，或者如果膜由于自身结构而具有吸附PBS的能力，则PBS直接与膜结合。这种吸附可以是可逆的也可以是不可逆的，但是优选的是可逆的。
3.由于膜的透析液(B)侧的开放结构，可能与外膜表面垂直或平行的或者以不同方式的透析液移动既可以将HSA分子转运到开口层内又可以将其转运出开口层。优选地，液体(B)流入开口膜又流出进入液体(B)流的交替流入与流出移动导致了与外膜表面垂直的移动和转运。使用滚子泵获得的脉冲样压力谱或跨膜压的改变可以导致这种流入和流出，跨膜压沿着膜从首先针对液体(B)(正TMP)到最后针对液体(A)(负TMP)改变；TMP＝跨膜压。
因此，本发明的透析膜优选地在功能上分为隧道样部分和手指样或海绵样开口/吸附部分。这两部分都必须满足某些前提条件，以使本发明的方法成为可能。理想的隧道样部分是这样的部分其长度接近于0(0.01-0.1μm)，直径接近于将要纯化并且保留在渗余液中的希望的蛋白质的大小，例如白蛋白的直径。换句话说，隧道样部分的直径应当小到足以将液体(A)中有价值的和想要的物质保留在渗余液中，而允许液体(A)中所含的蛋白质结合物质和其它不想要的物质转移到透析液(B)侧。
本发明透析膜的理想的开口/吸附部分具有极开放的结构，使得重组HSA能够接近及离开紧邻隧道透析液侧的区域。它具有较大的内表面，该内表面直接吸附PBS或者通过附着的重组HSA吸附PBS。该部分的总直径应当尽可能的小，以使向透析液流内的交换更有效。后两点可能走到极端，根据是希望更多的吸附还是希望更多通过膜开口/吸附部分的转运而几乎排除另一点。
用于纯化诸如血浆或血液的常规透析膜可以根据功能或结构标准分类。功能标准有高通量、低通量或高通透性，而结构标准有例如扁平、空心纤维、对称或非对称。这些术语未能充分描述可用于本发明的这类隧道样膜(TM)，因为a)TM是高通量且高通透性的膜，但并非所有被称为“高通透性”的高通量膜都是TM(例如来自HOSPAL的AN69)；b)TM可以是非对称的，但并非所有非对称膜都是TM(例如来自FRESENIUS AG的F8)；c)TM可以非对称且高通透性的，但并非所有非对称且高通透性的膜都是TM(来自Toray的PMMA)；d)TM可以是对称的，但并非所有对称膜都是TM(例如来自AKZO的Cuprophan)。
因此，术语隧道样膜代表可用于本发明的，具有新结构和功能特征性质的透析膜。
使用前，本发明的膜优选地如下所述预处理。将膜的液体(A)侧和液体(B)侧的至少一侧，优选两侧，浸渍重组HSA溶液。用于浸渍步骤的一种优选溶液是含有HSA的0.9％NaCl溶液，其中HSA的浓度为约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，最优选约8-约20g/100ml。浸渍溶液沿膜的液体(A)侧和液体(B)侧通过，通过时间足以允许重组HSA渗透并吸附到膜的两个部分上，通常为约1分钟至约120分钟，优选约10分钟至约60分钟，温度约15℃至约40℃，优选约18℃至约37℃，pH值约5至约9，优选约7。可以在进行预处理后立即使用膜，但是预处理的膜也可以在可达24℃的温度和无菌条件下贮存达2年。
优选地，在包被过程中，浸渍溶液用显示“脉冲样压力谱”的滚子泵来泵送，例如使用两个滚子泵，一个在透析器的透析液侧区室上，另一个在血液侧区室上。优选地，两个泵的压力谱之间存在相延迟，以确保溶液在膜两侧的有效流入和流出。
本发明还涉及用于从含有蛋白质结合物质的血浆或血液中分离这些物质的一次性装置，包括包含如上所述的根据本发明的膜的透析器。
根据一个优选实施方案，透析器在透析液(B)侧含有含人血清白蛋白的液体。
本发明进一步涉及用于从含有蛋白质结合物质的血浆或血液中分离这些物质的一次性装置，包括包含根据本发明的膜的透析器，用于血液透析的第二常规透析器，用于血液灌注的常规炭吸附单元，通过管互相连接的用于血液灌注的常规离子交换树脂单元，和含有重组人血清白蛋白的透析液(B)单元，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
本发明进一步涉及用于从含有蛋白质结合物质的血浆或血液中分离这些物质的一次性装置，包括包含根据本发明的膜并在透析液(B)侧充满含人血清白蛋白的液体的透析器，用于血液透析的第二常规透析器，用于血液灌注的常规炭吸附单元，通过管互相连接的用于血液灌注的常规离子交换树脂单元，和含有重组人血清白蛋白的透析液(B)单元，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
本发明进一步涉及一种从含有蛋白质结合物质的含蛋白质液体(A)中分离这些物质的方法，包括利用膜并且利用重组HSA对透析液(B)透析所述液体(A)，所述膜允许蛋白质结合物质向透析液(B)侧通过，所述HSA以游离形式存在于透析液(B)中，和/或附着于膜的至少一侧上。
本发明进一步涉及一种从含有蛋白质结合物质的含蛋白质液体(A)中分离这些物质的方法，包括利用膜对含有重组HSA的透析液(B)透析所述液体(A)，其中重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸，所述膜包括两个功能不同的部分，一个部分具有实际的分离膜的功能，允许蛋白质结合物质和水溶性物质通过，而排除与液体(A)中的蛋白质结合物质结合的蛋白质和液体(B)中的重组HSA，另一个部分具有开口和吸附功能，并且所述膜包被有重组HSA。
用于从含蛋白质液体(A)中分离蛋白质结合物质和(当然)可能存在的普通水溶性物质的本发明的方法如下进行待纯化的液体(A)通过含有膜的透析器，沿膜的液体(A)侧通过，流速为液体(A)侧每平方米膜面积约50-约500ml/min，优选约100-约200ml/min。透析液(B)沿膜的透析液(B)侧通过，流速为每平方米膜面积约50-约500ml/min，优选约100-约200ml/min，优选与液体(A)的流速相同。
然后，获得的含有蛋白质结合物质并且可能含有来自液体(A)的水溶性物质的透析液(B)优选地通过与常规透析机连接的第二常规透析器。对标准水透析液进行透析。通过这样透析，水溶性物质在透析液(B)与标准透析液之间交换。于是，水溶性毒素，如尿素或肌酸酐，可以从透析液(B)中分离出来，而电解质、葡萄糖和pH在透析液(B)中可以平衡，因而在液体(A)中也可以平衡。然后，获得的不含水溶性物质的透析液(B)优选地通过炭吸附剂，例如来自GAMBRO AB的Adsorba 300C或来自ASAHI的N350，和阴离子交换柱，例如来自ASAHI的BR350，以便从透析液(B)中的HSA上除去蛋白质结合物质。然后，获得的纯化的透析液(B)返回本发明的膜的透析液(B)侧，重新使用。
详细地，本发明的方法可以如下进行待纯化的液体(A)沿本发明的透析膜的液体(A)侧通过，流速为每平方米透析膜约50-约300ml/min，优选约100-约200ml/min。透析液(B)沿膜的透析液侧(B)通过，流速为每平方米透析膜约50-约1000ml/min，优选约100-约500ml/min。液体(A)和液体(B)的流速优选为同一数量级。液体(A)与液体(B)的流速之比为约1∶0.1至约1∶10，优选约1∶1至约1∶5。渗余液是纯化的含蛋白质液体(A)，其中蛋白质结合物质和其它不想要的物质已经除去。
在本发明的方法的一个优选实施方案中，液体(A)的第一步透析步骤与获得的透析液(B)的两步后处理步骤相结合。
首先，获得的透析液(B)通过与常规透析机相连的第二常规透析器。对标准水透析液进行透析。通过这样透析，水溶性物质在透析液(B)与标准透析液之间交换。水溶性毒素、尿素和/或肌酸酐从透析液(B)中清除，电解质、葡萄糖和pH值在渗余的透析液(B)中可以平衡。然后，透析液(B)通过炭吸附剂，例如来自GAMBRO AB的Adsorba 300C或来自ASAHI的N350，然后通过阴离子交换柱，例如来自ASAHI的BR350，以便从透析液(B)中的HSA上除去蛋白质结合物质。然后，纯化的含HSA的透析液(B)返回本发明的膜的液体(B)侧。
该方法已经在用于分离含蛋白质液体中的白蛋白结合物质和毒素的临床实验设备上进行了检测，使得液体中的这些化合物明显减少。
本发明方法的其它可能的简化实施方案包括如下改变。来自透析器的透析液(B)可以通过另外一个透析器而不通过任何吸附剂。来自透析器的透析液(B)可以通过一种或两种吸附剂而不通过另外一个透析器。可以将来自透析器的透析液(B)直接(例如通过滚子泵)泵送回透析器的透析液室的进口内，从而实现透析液(B)的充分移动和ABT的充分去除。另外一个简单的改变是透析液室充满透析液(B)、透析液进口和出口封闭的透析器，该透析液(B)中含有重组人血清白蛋白，浓度为约1-约50g/dl，优选约6-约40g/dl，更优选8-30g/dl，最优选约8-约20g/dl，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。整个透析器可以移动，例如通过摇动或滚动。
概括起来，本发明具有如下优点在整个发明中使用在制备过程中已经纯化除去伴随脂肪酸的重组HSA。这使得透析过程的效率高得惊人。
权利要求
1.重组HSA在透析中的用途，其中，所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
2.根据权利要求1的用途，其中，所述重组HSA进一步纯化除去了其它伴随物质，优选蛋白质或金属离子。
3.根据权利要求1或2任一项的用途，其中，所述重组HSA是从转基因非人类动物或从转基因植物中获得的。
4.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中，所述HSA是从牛、绵羊、猪、马、啮齿动物或公山羊来源中获得的。
5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中，所述HSA是从转基因非人类动物的乳液或血液中获得的。
6.根据权利要求5的用途，其中，所述HSA是从哺乳期的牛的乳液中获得的。
7.根据权利要求3的用途，其中，所述HSA是从转基因禽类的蛋中获得的。
8.根据权利要求1-7中任一项的用途，其中，所述重组HSA利用活性炭纯化除去伴随的脂肪酸。
9.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中，所述重组HSA的制备包括澄清步骤。
10.根据权利要求9的用途，其中，所述澄清通过过滤进行。
11.根据权利要求1-10中任一项的用途，其中，所述重组HSA的制备包括从含有重组HSA的溶液中沉淀重组HSA。
12.根据权利要求1-11中任一项的用途，其中，所述重组HSA的制备包括从含有重组HSA的溶液中沉淀污染的蛋白质。
13.根据权利要求1-12中任一项的用途，其中，所述重组HSA的制备包括层析纯化步骤。
14.根据权利要求13的用途，其中，所述层析步骤包括亲和层析或离子交换层析步骤。
15.根据权利要求1-14中任一项的用途，其中，所述重组HSA存在于透析液中。
16.根据权利要求15的用途，其中，所述HSA存在于透析液中，浓度范围为组合物的约1-约40重量％。
17.根据权利要求16的用途，其中，所述范围为组合物的约5-约30重量。
18.根据权利要求1-14中任一项的用途，其中，所述重组HSA存在于透析膜上。
19.一种含有重组HSA的透析液，其中，所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
20.根据权利要求19的透析液，其中，所述重组HSA进一步纯化除去了其它伴随的物质，优选蛋白质或金属离子。
21.根据权利要求19或20的透析液，它是碳酸氢盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，碳酸氢根约30-约40mmol/1000ml，乙酸根约2-约10mmol/1000ml，人血清白蛋白约1-约50g/100ml。
22.根据权利要求19或20的透析液，它是碳酸氢盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100。约110mmol/1000ml，碳酸氢根约30-约40mmol/1000ml，乙酸根约2-约10mmol/1000ml，人血清白蛋白约6-约40g/100ml。
23.根据权利要求19或20的透析液，它是碳酸氢盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0。约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，碳酸氢根约30-约40mmol/1000ml，乙酸根约2-约10mmol/1000ml，人血清白蛋白约8-约30g/100ml。
24.根据权利要求19或20的透析液，它是碳酸氢盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，碳酸氢根约30-约40mmol/1000ml，乙酸根约2-约10mmol/1000ml，人血清白蛋白约8-约20g/100ml。
25.根据权利要求19或20的透析液，它是乙酸盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，乙酸根约30-约40mmol/1000ml，人血清白蛋白约1-约50g/100ml。
26.根据权利要求19或20的透析液，它是乙酸盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，乙酸根约30-约40mmol/1000ml，人血清白蛋白约6-约40g/100ml。
27.根据权利要求19或20的透析液，它是乙酸盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，乙酸根约30-约40mmol/1000ml，人血清白蛋白约8-约30g/100ml。
28.根据权利要求19或20的透析液，它是乙酸盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，乙酸根约30-约40mmol/1000ml，人血清白蛋白约8-约20g/100ml。
29.一种膜，其用于通过对透析液(B)透析，从含有蛋白质结合物质的含蛋白质液体(A)中分离这些物质，其中，在制备过程中已经纯化除去伴随脂肪酸的重组HSA附着于该膜的至少一侧上，并且该膜的孔径大小使蛋白质结合物质能够通过该膜。
30.根据权利要求29的膜，其中，所述重组HSA进一步纯化除去了其它伴随物质，优选蛋白质或金属离子。
31.根据权利要求29或30的膜，它包括两个功能不同的部分(区)，一个部分具有实际的分离膜功能，允许蛋白质结合物质通过，而排除与液体(A)中的蛋白质结合物质结合的蛋白质和液体(B)中的重组HSA，另一部分具有开口和吸附功能，并且该膜在至少一侧包被有具有蛋白质结合物质接纳体功能的蛋白质。
32.根据权利要求29-31中任一项的膜，它包括一个具有实际的分离膜功能、在液体(A)侧具有隧道样结构的部分，该隧道的长度小于约10μm，直径小到足以排除液体(A)中的蛋白质和液体(B)中的接纳体蛋白质，该膜还包括一个在透析液(B)侧具有开口和吸附结构的部分。
33.根据权利要求32的膜，其中，所述隧道的长度小于约5μm。
34.根据权利要求32的膜，其中，所述隧道的长度小于约0.1μm。
35.根据权利要求29-34中任一项的膜，其中，膜材料选自聚砜、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、丙烯腈聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、异丁烯酸聚合物和乙酸纤维素聚合物。
36.根据权利要求35的膜，其中，所述膜材料是聚砜。
37.一种一次性装置，用于从含有蛋白质结合物质的血浆或血液中分离这些物质，包括包含根据权利要求29-36中任一项的膜的透析器。
38.根据权利要求37的一次性装置，其中，所述透析器在透析液(B)侧含有含人血清白蛋白的液体。
39.一种一次性装置，用于从含有蛋白质结合物质的血浆或血液中分离这些物质，包括包含根据权利要求29-36中任一项的膜的透析器，用于血液透析的第二常规透析器，用于血液灌注的常规炭吸附单元，通过管互相连接的用于血液灌注的常规离子交换树脂单元，和含有重组人血清白蛋白的透析液(B)单元，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
40.一种一次性装置，用于从含有蛋白质结合物质的血浆或血液中分离这些物质，包括包含根据权利要求29-36中任一项的膜并在透析液(B)侧充满含人血清白蛋白的液体的透析器，用于血液透析的第二常规透析器，用于血液灌注的常规炭吸附单元，通过管互相连接的用于血液灌注的常规离子交换树脂单元，和含有重组人血清白蛋白的透析液单元，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
41.一种从含有蛋白质结合物质的含蛋白质液体(A)中分离这些物质的方法，包括利用膜并且利用重组HSA对透析液(B)透析所述液体(A)，所述膜允许蛋白质结合物质向透析液(B)侧通过，所述HSA以游离形式存在于透析液(B)中，和/或附着于膜的至少一侧上，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
42.根据权利要求41的方法，其中，所述重组HSA进一步纯化除去了其它伴随的物质，优选蛋白质或金属离子。
43.一种从含有蛋白质结合物质的含蛋白质液体(A)中分离这些物质的方法，包括利用膜对含有重组HSA的透析液(B)透析所述液体(A)，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸，所述膜包括两个功能不同的部分，一个部分具有实际的分离膜的功能，允许蛋白质结合物质和水溶性物质通过，而排除与液体(A)中的蛋白质结合物质结合的蛋白质和液体(B)中的重组HSA，另一个部分具有开口和吸附功能，并且所述膜包被有重组HSA。
44.根据权利要求43的方法，其中，所述重组HSA进一步纯化除去了其它伴随的物质，优选蛋白质或金属离子。
45.根据权利要求41-44中任一项的方法，其中，所述膜包括一个具有实际的分离膜功能、在液体(A)侧具有隧道样结构的部分，该隧道的长度小于约10μm，直径小到足以排除液体(A)中的蛋白质和液体(B)中的重组HSA，该膜还包括一个在透析液(B)侧具有开口和吸附结构的部分。
46.根据权利要求45的方法，其中，所述膜的隧道的长度小于约5μm。
47.根据权利要求46的方法，其中，所述膜的隧道的长度小于约0.1μm。
48.根据权利要求41-47中任一项的方法，其中，膜材料选自聚砜、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、丙烯腈聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、异丁烯酸聚合物和乙酸纤维素聚合物。
49.根据权利要求48的方法，其中，所述膜材料是聚砜。
50.根据权利要求41-49中任一项的方法，其中，所述含蛋白质液体(A)选自血浆和血液。
51.根据权利要求41-50中任一项的方法，其中，所述膜包被有含有重组HSA的溶液，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
52.根据权利要求41-51中任一项的方法，其中，所述透析液(B)含有浓度为约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，更优选约8-约20g/100ml的重组人血清白蛋白。
53.重组人血清白蛋白(HSA)在制备治疗肝衰竭的药物组合物中的用途，其中，所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去脂肪酸。
全文摘要
本发明涉及重组HSA在透析中的用途，其中重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
文档编号A61M1/16GK1756587SQ200480005581
公开日2006年4月5日 申请日期2004年3月10日 优先权日2003年3月12日
发明者埃尔马·克劳斯, 沃尔弗拉姆·艾希纳 申请人:弗雷泽纽斯卡比德国有限公司
技术领域：
本发明涉及重组人血清白蛋白(HSA)在肝脏透析中的用途。
肝衰竭是一种具有高危险致死后果的严重疾病，通常是由肝炎病毒或中毒引起的。在肝衰竭的情况下，肝脏中白蛋白的再生受到抑制。由于白蛋白是血液中蛋白质结合毒性物质(PBTS)的主要转运系统之一，这导致毒性物质在血液中积累。最终结果将是患者意识丧失及最终死亡，除非找到合适的供体肝脏并及时移植。通过透析从患者的血液中，更准确的说，从血液中的白蛋白中清除这些毒性物质，可有助于延长这个时间，直到找到合适的移植器官。有些情况下透析甚至可以使肝脏有时间自身再生，从而不需要移植。
当前，使用多种系统从白蛋白中清除毒性物质。包括用输入的白蛋白置换患者的白蛋白，或者直接使患者血液在基于活性炭的吸附器上通过——这种方法可能导致不希望的多种血液成分的活化。
另外一种方法是使用透析系统，例如美国专利5,744,042中公开的透析系统。这些系统避免患者血液直接接触纯化物质，使用次级回路，该次级回路中填充有一种能够接收与患者白蛋白结合的毒性物质的物质，例如白蛋白溶液。通过膜界面，毒性物质从患者自身白蛋白向来自次级回路的白蛋白发生转移。后者然后通过位于该次级回路中的一个或几个吸附器得以再生。
迄今为止，在上述透析系统中使用的人血清白蛋白通常还是由天然来源制备的，例如通过分级分离从大量献血者采集、合并的血液而制备的。但是，这种制备方法明显具有污染诸如肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒或新变型克雅氏病病原体等病原体的危险。因此，为了制备非常安全的产品，从人血液中纯化HSA包括对终产品进行巴氏消毒的时间较长的步骤，但是危险仍然不能排除，特别是在考虑到热稳定病原体时。美国专利5,744,042公开了也能够使用重组白蛋白代替来自天然来源的白蛋白。
过去，曾经注意到迄今为止在肝脏透析中使用的白蛋白都具有较低的毒性蛋白质容量。这使得透析过程的效率较低。
因此本发明所针对的问题是需要提供一种改良的白蛋白，它提高了肝衰竭中血液透析的效率，同时应当可以低成本获得。
根据本发明的一个方面，通过在透析中使用重组HSA来解决这一问题，其中该重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
令人惊讶的是，已经发现，在透析中，特别是在肝衰竭后的透析中，在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸的重组HSA比普通白蛋白效率高得多。
根据一个优选实施方案，效率提高至少10％，优选至少25％，更优选至少50％。
根据本发明，术语“透析”是指体液，特别是血液的离体过滤方法。
对于本申请而言，术语“HSA”是指最初在人血液中发现的白蛋白超家族的人蛋白质，及其天然或合成修饰的变体。人白蛋白的大量多态性和突变体为本领域技术人员所公知(T.Peters，All about AlbuminBiochemistry，Genetics and Medical Applications，Academic Press Incl，1996)，并且包括在术语“HSA”的范围之内，以及人蛋白质的片段，包括至少1/3、优选2/3以上的蛋白质序列。
其它变体可以通过向编码HSA的基因中置换、插入或添加核苷酸获得，并且包括在本申请使用的术语“HSA”的范围之内，只要这样获得的HSA核苷酸序列与天然序列有至少75％的同源性，其中至少85％的同源性是优选的，至少90％的同源性是最优选的。
在本发明的优选实施方案中，重组HSA进一步纯化除去其它伴随物质，优选蛋白质，例如激素，或金属，或金属离子。
根据本发明，HSA可以从能够产生重组HSA的任何来源获得。包括在原核或真核细胞系中以及在任何转基因非人类动物、植物或转基因禽类的蛋中产生HSA。真核细胞系也可以是酵母株，但是酵母以外的真核细胞系是优选的。转基因非人类动物是最优选的。
在细胞系中产生HSA的方法包括用编码HSA的核酸转染细胞，在允许HSA表达的条件下培养细胞，以及从细胞中分离HSA。这些方法在本领域公知(T.Peters，All about AlbuminBiochemistry，Genetics andMedical Applications，Academic Press Incl，1996)。从这篇文献中也可以获得关于HSA的一般信息及关于其贮存的进一步的信息。
在转基因动物中产生HSA的方法在本领域也公知。包括用编码HSA的异源DNA和用于在转基因动物中表达该蛋白质的调节序列转化非人类动物的单细胞，以及转基因动物的再生(WO91/08216；Bondioli等人，Biotechnology，vol.16(1961)，265；Ebert等人，Bio/Technology，vol.9(1991)，835；Hammer等人，Nature，vol.315(1985)，680；Houdebine L.M.(编著)，Transgenic Animals-Generation and Use，Harwood AcademicPublishers GmbH(1996)，Amsterdam；Pinkert C.A.(编著)，TransgenicAnimal Technology；A Laboratory Handbook.Academic Press，San Diego(1994)，CA)。
总之，可以利用现有技术中公知的大量方法中的任何一种用核酸转化细胞。例如，转基因非人类动物可以利用一种包括如下步骤的方法获得将编码HSA的核酸导入适当的非人类受体细胞中；由该受体细胞再生转基因非人类动物。
所述受体细胞优选为胚细胞，但是也可以使用其它细胞型。由胚受体细胞再生转基因非人类动物可以包括将该细胞转移到雌性非人类动物中，并且使胚胎在其中生长。
产生转基因非人类动物的方法可以进一步包括动物的克隆。克隆动物的方法是本领域技术人员公知的(Baguisi等人，Nature Biotech.，vol.17(1999)，456-461；Campbell等人，Nature，vol.380(1996)，64-66，Cibelli等人，Science，vol.280(1998)，1256；Kato等人，Science vol.282(1998)，2095-2098；Schnieke等人，Science，vol.278(1997)，2130-2133；Vignon等人，C.R.Acad.Sci.Paris，Sciences de la vie/Life Sciences vol.321(1998)，735-745；Wakayama等人，Nature，vol.394(1998)，369-374；Wells等人，Biol.Reprod.vol.57(1997)，385-393；Wilmut等人，Nature，vol.385(1997)，813)，可以容易地根据本发明应用，来产生大量转基因动物。
在本发明的上下文中，HSA优选从牛、猪、马、啮齿动物或公山羊来源中获得。
在一个优选实施方案中，HSA从转基因非人类动物的奶或血液中获得，优选从哺乳期的牛的奶中获得(参见，例如，WO 96/02573)。
在一个替代实施方案中，HSA从转基因禽类的蛋中获得。所述转基因禽类优选地是鸡。在转基因母鸡中表达蛋白质以使该蛋白质转运到该母鸡的鸡蛋中的方法在本领域公知(参见，例如，Morrison等人，Immunotechnology，vol.4(1998)，115-125)。
根据本发明，使用的重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸，优选除去其它伴随物质。在本发明的上下文中，表述“伴随的脂肪酸或物质”是指在细胞系或转基因动物或植物中合成过程中与HSA附着的脂肪酸或物质。因此，所述细胞系或转基因动物或植物也产生这些脂肪酸或物质。而且，表述“伴随的脂肪酸或物质”也指在提取或纯化过程中，例如在除去细胞碎片或其它成分(例如从贮存含HSA溶液的容器中释放的金属离子)的过程中，与HSA附着的脂肪酸或物质。
在本发明的上下文中，表述“纯化除去”是指从HSA中一定程度地除去脂肪酸，而使HSA的结合能力提高。在本发明的一个优选实施方案中，除去至少50％、优选70％、更优选90％、最优选95％的脂肪酸。
脂肪酸程度的检测在本领域公知，例如可获自WAKO。一种合适的试剂盒是来自WAKO的Nefa-C-试剂盒。
本领域公知许多纯化HAS除去伴随脂肪酸的方法(参见，例如，WO 96/02573)。例如从转基因非人类动物中获得的HSA通常需要高程度地纯化除去副产物，否则在使用时会导致免疫或其它副作用。
纯化HAS除去伴随脂肪酸(优选地也除去其它物质)的一种适当方法，包括以优选1∶2、最优选至少1∶1的活性炭∶HSA比混合含有重组HSA的溶液与活性炭。但是，也可以使用其它浓度，例如2∶1或更高。
活性炭可以是粉末、颗粒、胶囊或压块(briquette)的形式。
纯化优选在pH低于3.5、更优选低于3.0的缓冲液中进行。
缓冲液优选地是磷酸盐缓冲液。但是也可以使用碳酸盐缓冲液或其它缓冲液，只要它们具有适当的缓冲容量和pH范围即可。
纯化优选地在室温下进行，优选进行至少30分钟。
在本发明的一个优选实施方案中，利用活性炭纯化重组HAS除去伴随的脂肪酸。
根据一个优选实施方案，重组HSA的制备包括一个澄清步骤。
优选地，通过过滤进行澄清。
作为一种不同的方法或合并使用的方法，重组HSA的制备可以包括从含有重组HSA的溶液中沉淀重组HSA。例如，通过一步沉淀步骤，可以从转基因非人类哺乳动物的奶或血液中高纯度地获得HSA。能够沉淀HSA的合适的试剂在本领域公知，可以由本领域技术人员利用简单的实验确定。然后，可以利用公知的方法将HSA重悬浮于希望的溶剂中。优选地，使用用于HSA的溶剂以简化HSA的进一步纯化(pH，离子的选择)。
此外，重组HSA的制备也可以包括从含有重组HSA的溶液中沉淀污染的蛋白质。
分离HSA的方法可以进一步包括一个或多个层析纯化步骤，该步骤可以按照本领域公知的大量层析方法中的任何一种来进行。优选使用亲和层析和/或离子交换层析(T.Peters，All about AlbuminBiochemistry，Genetics and Medical Applications，Academic Press Incl，1996)。
根据一个优选实施方案，重组HSA存在于透析液中。根据一个优选实施方案，重组HSA以占组合物的约1％-约40％、优选约5％-约30％w/vol、最优选20％的浓度存在于透析液中。关于在透析液中的使用，使用与本发明下文描述的透析液相同的实施方案。
在透析中，重组HSA将以充分或有效透析的量使用。这取决于例如患者的体重或疾病的严重程度，或者可以由肝脏透析领域的医学技术人员调整。
HSA优选地在充分适合贮存大量HSA的塑料容器中提供。优选地，但不是唯一地，可以是含有20％重组白蛋白溶液(w/vol)的600ml包装。可以使用标准玻璃容器，但是也可以使用任何类型的合适的塑料容器或低透气性袋子，例如，用于采集和贮存献血者血液的袋子。
根据一个进一步优选的实施方案，重组HSA存在于透析膜上。以下公开的关于本发明的透析膜的实施方案在这里也适用。
在整个本发明中，包括重组HSA在纯化除去伴随脂肪酸后与一定量的其它脂肪酸或相关物质如N-乙酰色氨酸、辛酸盐(octanoate或caprylate)组合，以便例如提高HSA的溶解度。优选地，在不超过20％w/w的HSA溶液中包含总共不超过32mM的这些物质，或者在不超过25％w/w的HSA溶液中包含不超过40mM的这些物质。优选地，只有一种物质与HSA组合。此外，也可以等量添加两种物质。
本发明进一步涉及透析患者血液的方法，其中使用如上所述定义、合成、制备和/或纯化的重组HSA。
本发明进一步涉及含有重组HSA的透析液，其中重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
在一个优选实施方案中，HSA具有如上所述的特征，或者如上所述合成、制备和/或纯化。
透析液含有在制备过程中已经纯化除去伴随脂肪酸的重组HSA。它用作蛋白质结合物质(PBS)以及可能具有结合白蛋白能力的游离物质的接纳体，这些物质将从液体(A)中除去。重组HSA的浓度优选地为约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，最优选约8-约20g/100ml。
透析液可以含有其它的盐，如NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、乳酸钠和一水合葡萄糖，其含量取决于特定患者血液中的电解质组成。例如，在低钾血症患者的透析中，需要较高浓度的钾离子。
碳酸氢盐缓冲的透析液中优选的离子浓度如下钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，碳酸氢根约30-约40mmol/1000ml，乙酸根约2-约10mmol/1000ml，人血清白蛋白约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，最优选约8-约20g/100ml。
碳酸氢盐缓冲的透析液中更优选的离子浓度如下钠约135-约140mmol/1000ml，钙约1.5-约2.0mmol/1000ml，钾约3.0-约3.5mmol/1000ml，镁约0.4-约0.6mmol/1000ml，氯约104-约108mmol/1000ml，碳酸氢根约34-约38mmol/1000ml，乙酸根约4-约8mmol/1000ml，人血清白蛋白约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，最优选约8-约20g/100ml。
乙酸盐缓冲的透析液中优选的离子浓度如下钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，乙酸根约30-约40mmol/1000ml，人血清白蛋白约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，最优选约8-约20g/100ml。
乙酸盐缓冲的透析液中更优选的离子浓度如下钠约135-约140mmol/1000ml，钙约1.5-约2.0mmol/1000ml，钾约3.0-约3.5mmol/1000ml，镁约0.4-约0.6mmol/1000ml，氯约104-约108mmol/1000ml，乙酸根约33-约38mmol/1000ml，人血清白蛋白约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，最优选约8-约20g/100ml。
透析液的一个实例每升透析液含有约10-约20重量％的人血清白蛋白，约6.1g NaCl，约4.0g乳酸钠，约0.15g KCl，约0.31g CaCl2x H2O，0.15g MgCl2x 6H2O，和1.65g一水合葡萄糖。
如果根据本发明的透析液用在如本发明或EP 615780A所述的透析系统中，可以使用任何适当的膜，例如包被有接纳体物质的膜。此外，也可以使用根据本发明的膜。
本发明进一步涉及一种膜，该膜用于通过对透析液(B)透析，从含有蛋白质结合物质的含蛋白质液体(A)中分离这些物质，其中在制备过程中已经纯化除去伴随脂肪酸的重组HSA附着于该膜的至少一侧，并且该膜孔径尺寸使蛋白质结合物质能够通过该膜。
根据一个优选实施方案，本发明的膜含有如上所述的重组HSA，该重组HSA如上所述合成、制备和/或纯化，以用于本发明。
本发明的膜优选包括两个功能不同的部分。一个部分具有实际的分离膜功能，在本发明方法的条件下允许蛋白质结合物质(PBS)和水溶性物质通过，而排除与液体(A)中的PBS结合的蛋白质和液体(B)中的重组HSA，另一部分具有开口(port)和吸附功能。优选地，该膜包被有如本发明全文所述的重组HSA。在一个优选实施方案中，本发明的膜包含一面向液体(A)侧的隧道样结构的薄层，该隧道的长度小于约10μm，直径小到足以排除液体(A)中的HSA，并且在透析液(B)侧具有开口和吸附结构。优选地，该膜在至少一侧，优选地在透析液(B)侧，包被有一层重组HSA薄膜。
本发明的膜可以具有平膜、大直径薄壁管或者优选地空心细纤维的肉眼可见的形式。膜技术、空心纤维膜和透析在Kirk-Othmer，Encyclopedia of Chemical Technology，第三版，第7卷(1979)，564-579页，特别是574-577页，第12卷(1980)，492-517页和第15卷(1981)，92-131页有描述。而且，膜和膜分离方法在Ullmann′s Encyclopedia of IndustrialChemistry，第五版，Vol A 16(1990)，187-263页有描述。
用于该膜的基质材料可以由多种材料制成，包括陶瓷、石墨、金属、金属氧化物和聚合物，只要它们对液体(A)和透析液(B)侧的蛋白质有亲和力即可。当前最广泛使用的方法有粉末烧结、薄膜拉伸、薄膜照射和蚀刻以及相转化技术。用于本发明的膜的优选材料是选自聚砜、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、丙烯腈聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、异丁烯酸聚合物和乙酸纤维素聚合物的有机聚合物。特别优选的是用例如聚乙烯吡咯烷酮亲水化的聚砜膜。
准确、完全地定义膜是相当困难的；参见Ullmann，同上，190-191页，2.1和2.2。膜在结构上可以是均匀的、多微孔的、或不均匀的、对称或非对称的。它可以是中性的，或者可以包含具有特定结合或复合能力的官能团。当前在分离技术中使用的最重要的膜是非对称膜；参见Ullmann，同上，219页及后文，4.2。已知的非对称膜具有“手指”型结构、具有分级孔径分布的海绵型结构或具有均匀孔径分布的海绵型结构；参见Ullmann，同上，223-224页。
本发明最优选的膜结构是一种非对称膜，它由一高度多孔结构的选择性薄皮肤层组成，具有以手指或通道形式从皮肤向下差不多垂直地穿透膜的孔。极薄的皮肤代表实际的膜，并且可能包含孔。多孔亚结构用作皮肤层的支持，允许重组HSA接近皮肤并接纳从液体(A)侧向透析液(B)侧穿透皮肤的蛋白质结合物质。
在分离程序之前，膜优选地如下处理。膜从液体(A)侧和/或从液体(B)侧用含有浓度约1-约50g/100ml、更优选约5-约20g/100ml的重组人血清白蛋白的液体，优选0.9％NaCl溶液处理。处理时间为约1分钟至约30分钟，优选约10分钟至约20分钟，处理温度为约15℃至约40℃，优选约18℃至约37℃。
本发明的膜的详述本发明的膜优选地包括两个功能不同的部分(区)。一个部分具有实际的分离膜功能，在本发明方法的条件下允许PBS和水溶性物质通过，而排除与液体(A)中的PBS结合的蛋白质和液体(B)中的重组HSA，另一部分具有开口和吸附功能。优选地，该膜包被有重组HSA。在一个优选实施方案中，本发明的膜包含一面朝向液体(A)侧的隧道样结构的薄层，该隧道的长度小于约10μm，优选小于约5μm，更优选小于约0.1μm，最优选为约0.01μm-约0.1μm。该隧道的直径小到足以排除液体(A)中的蛋白质，优选地允许分子量约20,000道尔顿至约66,000道尔顿、更优选约50,000道尔顿至约66,000道尔顿的分子穿过该隧道通过。优选地，该膜相对于液体(A)中蛋白质的筛系数小于0.1，更优选小于0.01。而且，该膜优选地在透析液(B)侧具有开口和吸附结构。这部分提供充分打开的结构，以允许透析液(B)中的重组HSA进入开口和吸附层，以接纳来自该膜液体(A)侧的PBS。而且，该部分的内表面用作PBS的吸附器，通过经下文所述的包被程序吸附的重组HSA吸附，或者被适合结合PBS的其它结构吸附。这种吸附可以是随时间稳定的或是可逆的。优选地，该膜在至少一侧覆盖有重组HSA薄膜。包含本发明的膜的一种商品透析器可以在液体(B)侧含有重组HSA溶液。
本发明的膜可以是具有平膜、大直径薄壁管或者优选地空心细纤维的肉眼可见的形式。
用于该膜的基质材料可以由多种材料制成，包括陶瓷、石墨、金属、金属氧化物和聚合物，只要它们对液体(A)和透析液(B)侧的蛋白质有亲和力即可。当前最广泛使用的方法有粉末烧结、薄膜拉伸、薄膜照射和蚀刻以及相转化技术。用于本发明的膜的优选材料是选自聚砜、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、丙烯腈聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、异丁烯酸聚合物和乙酸纤维素聚合物的有机聚合物。
本发明中使用的优选聚合物膜是例如用聚乙烯吡咯烷酮亲水化的高通透性非对称聚砜膜，例如Fresenius AG的HF 80。
这些膜和膜组件、透析柱、人工肾膜系统例如可从Fresenius AG(例如HF 80)、GAMBRO AB(例如Polyflux)、Baxter Inc.(例如CT190G)购得。
第一部分膜面向液体(A)侧的层或结构提供实际的膜，允许蛋白质结合物质和水溶性物质，即低分子物质和“中等大小分子”，从液体(A)侧向透析溶液(液体(B)侧)选择性转移。于是，顺着不想要的物质从液体(A)侧向透析液(B)侧逐渐降低的浓度梯度，不想要的物质从液体(A)侧向透析液(B)侧发生有效净转移。实际的膜必须满足三个条件1.隧道必须足够短，优选小于约5μm，更优选小于约1μm，最优选小于约0.1μm。
2.隧道直径必须大到足以允许不想要的分子通过，而又小到足以阻止液体(A)中所含的想要的分子向液体(B)通过以及重组HSA从液体(B)向液体(A)通过。在血浆或血液作为液体(A)的情况下，排阻限优选地为约66,000道尔顿。优选地，膜相对于液体(A)中蛋白质的筛系数小于0.1，更优选小于0.01。
3.实际膜面向液体(A)侧的层或结构的化学、物理等结构允许不想要的物质通过，例如，疏水性和亲水性微域。
第二部分膜面向液体(B)侧的层或结构通常以海绵样或手指样方式提供更开放的膜结构。该部分在膜该部分内提供重要的开口和吸附功能1.由于膜的该部分的开放间隔(open-spaced)结构，来自透析液(B)侧的重组HSA可以接近上述该结构面向液体(A)侧的透析液侧孔，并且接纳不想要的物质，例如从液体(A)侧穿过隧道样结构通过的蛋白质结合物质。
2.由于该结构呈现较大的总表面积，它通过附着的分子吸附大量的蛋白质结合物质(PBS)，所述附着分子在这种间接膜吸附中起一种间隔物的作用，或者如果膜由于自身结构而具有吸附PBS的能力，则PBS直接与膜结合。这种吸附可以是可逆的也可以是不可逆的，但是优选的是可逆的。
3.由于膜的透析液(B)侧的开放结构，可能与外膜表面垂直或平行的或者以不同方式的透析液移动既可以将HSA分子转运到开口层内又可以将其转运出开口层。优选地，液体(B)流入开口膜又流出进入液体(B)流的交替流入与流出移动导致了与外膜表面垂直的移动和转运。使用滚子泵获得的脉冲样压力谱或跨膜压的改变可以导致这种流入和流出，跨膜压沿着膜从首先针对液体(B)(正TMP)到最后针对液体(A)(负TMP)改变；TMP＝跨膜压。
因此，本发明的透析膜优选地在功能上分为隧道样部分和手指样或海绵样开口/吸附部分。这两部分都必须满足某些前提条件，以使本发明的方法成为可能。理想的隧道样部分是这样的部分其长度接近于0(0.01-0.1μm)，直径接近于将要纯化并且保留在渗余液中的希望的蛋白质的大小，例如白蛋白的直径。换句话说，隧道样部分的直径应当小到足以将液体(A)中有价值的和想要的物质保留在渗余液中，而允许液体(A)中所含的蛋白质结合物质和其它不想要的物质转移到透析液(B)侧。
本发明透析膜的理想的开口/吸附部分具有极开放的结构，使得重组HSA能够接近及离开紧邻隧道透析液侧的区域。它具有较大的内表面，该内表面直接吸附PBS或者通过附着的重组HSA吸附PBS。该部分的总直径应当尽可能的小，以使向透析液流内的交换更有效。后两点可能走到极端，根据是希望更多的吸附还是希望更多通过膜开口/吸附部分的转运而几乎排除另一点。
用于纯化诸如血浆或血液的常规透析膜可以根据功能或结构标准分类。功能标准有高通量、低通量或高通透性，而结构标准有例如扁平、空心纤维、对称或非对称。这些术语未能充分描述可用于本发明的这类隧道样膜(TM)，因为a)TM是高通量且高通透性的膜，但并非所有被称为“高通透性”的高通量膜都是TM(例如来自HOSPAL的AN69)；b)TM可以是非对称的，但并非所有非对称膜都是TM(例如来自FRESENIUS AG的F8)；c)TM可以非对称且高通透性的，但并非所有非对称且高通透性的膜都是TM(来自Toray的PMMA)；d)TM可以是对称的，但并非所有对称膜都是TM(例如来自AKZO的Cuprophan)。
因此，术语隧道样膜代表可用于本发明的，具有新结构和功能特征性质的透析膜。
使用前，本发明的膜优选地如下所述预处理。将膜的液体(A)侧和液体(B)侧的至少一侧，优选两侧，浸渍重组HSA溶液。用于浸渍步骤的一种优选溶液是含有HSA的0.9％NaCl溶液，其中HSA的浓度为约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，最优选约8-约20g/100ml。浸渍溶液沿膜的液体(A)侧和液体(B)侧通过，通过时间足以允许重组HSA渗透并吸附到膜的两个部分上，通常为约1分钟至约120分钟，优选约10分钟至约60分钟，温度约15℃至约40℃，优选约18℃至约37℃，pH值约5至约9，优选约7。可以在进行预处理后立即使用膜，但是预处理的膜也可以在可达24℃的温度和无菌条件下贮存达2年。
优选地，在包被过程中，浸渍溶液用显示“脉冲样压力谱”的滚子泵来泵送，例如使用两个滚子泵，一个在透析器的透析液侧区室上，另一个在血液侧区室上。优选地，两个泵的压力谱之间存在相延迟，以确保溶液在膜两侧的有效流入和流出。
本发明还涉及用于从含有蛋白质结合物质的血浆或血液中分离这些物质的一次性装置，包括包含如上所述的根据本发明的膜的透析器。
根据一个优选实施方案，透析器在透析液(B)侧含有含人血清白蛋白的液体。
本发明进一步涉及用于从含有蛋白质结合物质的血浆或血液中分离这些物质的一次性装置，包括包含根据本发明的膜的透析器，用于血液透析的第二常规透析器，用于血液灌注的常规炭吸附单元，通过管互相连接的用于血液灌注的常规离子交换树脂单元，和含有重组人血清白蛋白的透析液(B)单元，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
本发明进一步涉及用于从含有蛋白质结合物质的血浆或血液中分离这些物质的一次性装置，包括包含根据本发明的膜并在透析液(B)侧充满含人血清白蛋白的液体的透析器，用于血液透析的第二常规透析器，用于血液灌注的常规炭吸附单元，通过管互相连接的用于血液灌注的常规离子交换树脂单元，和含有重组人血清白蛋白的透析液(B)单元，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
本发明进一步涉及一种从含有蛋白质结合物质的含蛋白质液体(A)中分离这些物质的方法，包括利用膜并且利用重组HSA对透析液(B)透析所述液体(A)，所述膜允许蛋白质结合物质向透析液(B)侧通过，所述HSA以游离形式存在于透析液(B)中，和/或附着于膜的至少一侧上。
本发明进一步涉及一种从含有蛋白质结合物质的含蛋白质液体(A)中分离这些物质的方法，包括利用膜对含有重组HSA的透析液(B)透析所述液体(A)，其中重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸，所述膜包括两个功能不同的部分，一个部分具有实际的分离膜的功能，允许蛋白质结合物质和水溶性物质通过，而排除与液体(A)中的蛋白质结合物质结合的蛋白质和液体(B)中的重组HSA，另一个部分具有开口和吸附功能，并且所述膜包被有重组HSA。
用于从含蛋白质液体(A)中分离蛋白质结合物质和(当然)可能存在的普通水溶性物质的本发明的方法如下进行待纯化的液体(A)通过含有膜的透析器，沿膜的液体(A)侧通过，流速为液体(A)侧每平方米膜面积约50-约500ml/min，优选约100-约200ml/min。透析液(B)沿膜的透析液(B)侧通过，流速为每平方米膜面积约50-约500ml/min，优选约100-约200ml/min，优选与液体(A)的流速相同。
然后，获得的含有蛋白质结合物质并且可能含有来自液体(A)的水溶性物质的透析液(B)优选地通过与常规透析机连接的第二常规透析器。对标准水透析液进行透析。通过这样透析，水溶性物质在透析液(B)与标准透析液之间交换。于是，水溶性毒素，如尿素或肌酸酐，可以从透析液(B)中分离出来，而电解质、葡萄糖和pH在透析液(B)中可以平衡，因而在液体(A)中也可以平衡。然后，获得的不含水溶性物质的透析液(B)优选地通过炭吸附剂，例如来自GAMBRO AB的Adsorba 300C或来自ASAHI的N350，和阴离子交换柱，例如来自ASAHI的BR350，以便从透析液(B)中的HSA上除去蛋白质结合物质。然后，获得的纯化的透析液(B)返回本发明的膜的透析液(B)侧，重新使用。
详细地，本发明的方法可以如下进行待纯化的液体(A)沿本发明的透析膜的液体(A)侧通过，流速为每平方米透析膜约50-约300ml/min，优选约100-约200ml/min。透析液(B)沿膜的透析液侧(B)通过，流速为每平方米透析膜约50-约1000ml/min，优选约100-约500ml/min。液体(A)和液体(B)的流速优选为同一数量级。液体(A)与液体(B)的流速之比为约1∶0.1至约1∶10，优选约1∶1至约1∶5。渗余液是纯化的含蛋白质液体(A)，其中蛋白质结合物质和其它不想要的物质已经除去。
在本发明的方法的一个优选实施方案中，液体(A)的第一步透析步骤与获得的透析液(B)的两步后处理步骤相结合。
首先，获得的透析液(B)通过与常规透析机相连的第二常规透析器。对标准水透析液进行透析。通过这样透析，水溶性物质在透析液(B)与标准透析液之间交换。水溶性毒素、尿素和/或肌酸酐从透析液(B)中清除，电解质、葡萄糖和pH值在渗余的透析液(B)中可以平衡。然后，透析液(B)通过炭吸附剂，例如来自GAMBRO AB的Adsorba 300C或来自ASAHI的N350，然后通过阴离子交换柱，例如来自ASAHI的BR350，以便从透析液(B)中的HSA上除去蛋白质结合物质。然后，纯化的含HSA的透析液(B)返回本发明的膜的液体(B)侧。
该方法已经在用于分离含蛋白质液体中的白蛋白结合物质和毒素的临床实验设备上进行了检测，使得液体中的这些化合物明显减少。
本发明方法的其它可能的简化实施方案包括如下改变。来自透析器的透析液(B)可以通过另外一个透析器而不通过任何吸附剂。来自透析器的透析液(B)可以通过一种或两种吸附剂而不通过另外一个透析器。可以将来自透析器的透析液(B)直接(例如通过滚子泵)泵送回透析器的透析液室的进口内，从而实现透析液(B)的充分移动和ABT的充分去除。另外一个简单的改变是透析液室充满透析液(B)、透析液进口和出口封闭的透析器，该透析液(B)中含有重组人血清白蛋白，浓度为约1-约50g/dl，优选约6-约40g/dl，更优选8-30g/dl，最优选约8-约20g/dl，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。整个透析器可以移动，例如通过摇动或滚动。
概括起来，本发明具有如下优点在整个发明中使用在制备过程中已经纯化除去伴随脂肪酸的重组HSA。这使得透析过程的效率高得惊人。
权利要求
1.重组HSA在透析中的用途，其中，所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
2.根据权利要求1的用途，其中，所述重组HSA进一步纯化除去了其它伴随物质，优选蛋白质或金属离子。
3.根据权利要求1或2任一项的用途，其中，所述重组HSA是从转基因非人类动物或从转基因植物中获得的。
4.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中，所述HSA是从牛、绵羊、猪、马、啮齿动物或公山羊来源中获得的。
5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中，所述HSA是从转基因非人类动物的乳液或血液中获得的。
6.根据权利要求5的用途，其中，所述HSA是从哺乳期的牛的乳液中获得的。
7.根据权利要求3的用途，其中，所述HSA是从转基因禽类的蛋中获得的。
8.根据权利要求1-7中任一项的用途，其中，所述重组HSA利用活性炭纯化除去伴随的脂肪酸。
9.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中，所述重组HSA的制备包括澄清步骤。
10.根据权利要求9的用途，其中，所述澄清通过过滤进行。
11.根据权利要求1-10中任一项的用途，其中，所述重组HSA的制备包括从含有重组HSA的溶液中沉淀重组HSA。
12.根据权利要求1-11中任一项的用途，其中，所述重组HSA的制备包括从含有重组HSA的溶液中沉淀污染的蛋白质。
13.根据权利要求1-12中任一项的用途，其中，所述重组HSA的制备包括层析纯化步骤。
14.根据权利要求13的用途，其中，所述层析步骤包括亲和层析或离子交换层析步骤。
15.根据权利要求1-14中任一项的用途，其中，所述重组HSA存在于透析液中。
16.根据权利要求15的用途，其中，所述HSA存在于透析液中，浓度范围为组合物的约1-约40重量％。
17.根据权利要求16的用途，其中，所述范围为组合物的约5-约30重量。
18.根据权利要求1-14中任一项的用途，其中，所述重组HSA存在于透析膜上。
19.一种含有重组HSA的透析液，其中，所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
20.根据权利要求19的透析液，其中，所述重组HSA进一步纯化除去了其它伴随的物质，优选蛋白质或金属离子。
21.根据权利要求19或20的透析液，它是碳酸氢盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，碳酸氢根约30-约40mmol/1000ml，乙酸根约2-约10mmol/1000ml，人血清白蛋白约1-约50g/100ml。
22.根据权利要求19或20的透析液，它是碳酸氢盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100。约110mmol/1000ml，碳酸氢根约30-约40mmol/1000ml，乙酸根约2-约10mmol/1000ml，人血清白蛋白约6-约40g/100ml。
23.根据权利要求19或20的透析液，它是碳酸氢盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0。约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，碳酸氢根约30-约40mmol/1000ml，乙酸根约2-约10mmol/1000ml，人血清白蛋白约8-约30g/100ml。
24.根据权利要求19或20的透析液，它是碳酸氢盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，碳酸氢根约30-约40mmol/1000ml，乙酸根约2-约10mmol/1000ml，人血清白蛋白约8-约20g/100ml。
25.根据权利要求19或20的透析液，它是乙酸盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，乙酸根约30-约40mmol/1000ml，人血清白蛋白约1-约50g/100ml。
26.根据权利要求19或20的透析液，它是乙酸盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，乙酸根约30-约40mmol/1000ml，人血清白蛋白约6-约40g/100ml。
27.根据权利要求19或20的透析液，它是乙酸盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，乙酸根约30-约40mmol/1000ml，人血清白蛋白约8-约30g/100ml。
28.根据权利要求19或20的透析液，它是乙酸盐缓冲的，含有离子形式的钠约130-约145mmol/1000ml，钙约1.0-约2.5mmol/1000ml，钾约2.0-约4.0mmol/1000ml，镁约0.2-约0.8mmol/1000ml，氯约100-约110mmol/1000ml，乙酸根约30-约40mmol/1000ml，人血清白蛋白约8-约20g/100ml。
29.一种膜，其用于通过对透析液(B)透析，从含有蛋白质结合物质的含蛋白质液体(A)中分离这些物质，其中，在制备过程中已经纯化除去伴随脂肪酸的重组HSA附着于该膜的至少一侧上，并且该膜的孔径大小使蛋白质结合物质能够通过该膜。
30.根据权利要求29的膜，其中，所述重组HSA进一步纯化除去了其它伴随物质，优选蛋白质或金属离子。
31.根据权利要求29或30的膜，它包括两个功能不同的部分(区)，一个部分具有实际的分离膜功能，允许蛋白质结合物质通过，而排除与液体(A)中的蛋白质结合物质结合的蛋白质和液体(B)中的重组HSA，另一部分具有开口和吸附功能，并且该膜在至少一侧包被有具有蛋白质结合物质接纳体功能的蛋白质。
32.根据权利要求29-31中任一项的膜，它包括一个具有实际的分离膜功能、在液体(A)侧具有隧道样结构的部分，该隧道的长度小于约10μm，直径小到足以排除液体(A)中的蛋白质和液体(B)中的接纳体蛋白质，该膜还包括一个在透析液(B)侧具有开口和吸附结构的部分。
33.根据权利要求32的膜，其中，所述隧道的长度小于约5μm。
34.根据权利要求32的膜，其中，所述隧道的长度小于约0.1μm。
35.根据权利要求29-34中任一项的膜，其中，膜材料选自聚砜、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、丙烯腈聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、异丁烯酸聚合物和乙酸纤维素聚合物。
36.根据权利要求35的膜，其中，所述膜材料是聚砜。
37.一种一次性装置，用于从含有蛋白质结合物质的血浆或血液中分离这些物质，包括包含根据权利要求29-36中任一项的膜的透析器。
38.根据权利要求37的一次性装置，其中，所述透析器在透析液(B)侧含有含人血清白蛋白的液体。
39.一种一次性装置，用于从含有蛋白质结合物质的血浆或血液中分离这些物质，包括包含根据权利要求29-36中任一项的膜的透析器，用于血液透析的第二常规透析器，用于血液灌注的常规炭吸附单元，通过管互相连接的用于血液灌注的常规离子交换树脂单元，和含有重组人血清白蛋白的透析液(B)单元，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
40.一种一次性装置，用于从含有蛋白质结合物质的血浆或血液中分离这些物质，包括包含根据权利要求29-36中任一项的膜并在透析液(B)侧充满含人血清白蛋白的液体的透析器，用于血液透析的第二常规透析器，用于血液灌注的常规炭吸附单元，通过管互相连接的用于血液灌注的常规离子交换树脂单元，和含有重组人血清白蛋白的透析液单元，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
41.一种从含有蛋白质结合物质的含蛋白质液体(A)中分离这些物质的方法，包括利用膜并且利用重组HSA对透析液(B)透析所述液体(A)，所述膜允许蛋白质结合物质向透析液(B)侧通过，所述HSA以游离形式存在于透析液(B)中，和/或附着于膜的至少一侧上，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
42.根据权利要求41的方法，其中，所述重组HSA进一步纯化除去了其它伴随的物质，优选蛋白质或金属离子。
43.一种从含有蛋白质结合物质的含蛋白质液体(A)中分离这些物质的方法，包括利用膜对含有重组HSA的透析液(B)透析所述液体(A)，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸，所述膜包括两个功能不同的部分，一个部分具有实际的分离膜的功能，允许蛋白质结合物质和水溶性物质通过，而排除与液体(A)中的蛋白质结合物质结合的蛋白质和液体(B)中的重组HSA，另一个部分具有开口和吸附功能，并且所述膜包被有重组HSA。
44.根据权利要求43的方法，其中，所述重组HSA进一步纯化除去了其它伴随的物质，优选蛋白质或金属离子。
45.根据权利要求41-44中任一项的方法，其中，所述膜包括一个具有实际的分离膜功能、在液体(A)侧具有隧道样结构的部分，该隧道的长度小于约10μm，直径小到足以排除液体(A)中的蛋白质和液体(B)中的重组HSA，该膜还包括一个在透析液(B)侧具有开口和吸附结构的部分。
46.根据权利要求45的方法，其中，所述膜的隧道的长度小于约5μm。
47.根据权利要求46的方法，其中，所述膜的隧道的长度小于约0.1μm。
48.根据权利要求41-47中任一项的方法，其中，膜材料选自聚砜、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、丙烯腈聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、异丁烯酸聚合物和乙酸纤维素聚合物。
49.根据权利要求48的方法，其中，所述膜材料是聚砜。
50.根据权利要求41-49中任一项的方法，其中，所述含蛋白质液体(A)选自血浆和血液。
51.根据权利要求41-50中任一项的方法，其中，所述膜包被有含有重组HSA的溶液，其中所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
52.根据权利要求41-51中任一项的方法，其中，所述透析液(B)含有浓度为约1-约50g/100ml，优选约6-约40g/100ml，更优选约8-约30g/100ml，更优选约8-约20g/100ml的重组人血清白蛋白。
53.重组人血清白蛋白(HSA)在制备治疗肝衰竭的药物组合物中的用途，其中，所述重组HSA在制备过程中已经纯化除去脂肪酸。
全文摘要
本发明涉及重组HSA在透析中的用途，其中重组HSA在制备过程中已经纯化除去伴随的脂肪酸。
文档编号A61M1/16GK1756587SQ200480005581
公开日2006年4月5日 申请日期2004年3月10日 优先权日2003年3月12日
发明者埃尔马·克劳斯, 沃尔弗拉姆·艾希纳 申请人:弗雷泽纽斯卡比德国有限公司
最新回复(0)