组织蛋白酶s抑制剂的制作方法

专利名称：：组织蛋白酶s抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及作为组织蛋白酶S(一种半胱氨酸蛋白酶)抑制剂具有活性的肽基化合物。所述的化合物是组织蛋白酶S的选择性可逆抑制剂。因此用于治疗自身免疫以及其它疾病。本发明还涉及这些化合物的制备方法以及包含它们的药物组合物。
背景技术：
：组织蛋白酶S是木瓜蛋白酶家族的一个成员，在半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族内。木瓜蛋白酶家族是半胱氨酸蛋白酶的最大组并且包括蛋白酶如组织蛋白酶B、H、K、L、O和S。(A.J.Barrett等人，1996，PerspectivesinDrugDiscoveryandDesign，6，1)。半胱氨酸蛋白酶在人类生物学及疾病中具有重要作用，包括动脉粥样硬化、肺气肿、骨质疏松症、慢性炎症和免疫疾病(H.A.Chapman等人，1997，Ann.Rev.Physiol.，59，63)。组织蛋白酶S在调节抗原呈递和免疫性中起关键作用(H.A.Chapman，1998，CurrentOpinioninImmunology，10，93；R.J.Riese等人，1998，J.Clin.Invest.，101，2351；R.J.Riese等人，1996，Immunity，4，357)。组织蛋白酶S缺乏的小鼠具有受损的不变链降解，其导致抗原呈递降低及生发中心的形成，以及减小胶原蛋白引起的关节炎的敏感性，显示对组织蛋白酶S抑制剂治疗的潜在性(G.Shi等人，1999，Immunity，10，197；T.Y.Nakagawa等人，1999，Immunity，10，207)。免疫反应的特异性取决于外源蛋白的加工以及在细胞表面处抗原肽的呈递。抗原肽与MHC类别II结合存在，一种在某些造血细胞系的抗原呈递细胞(例如B细胞、巨噬细胞和树突状细胞)中表达的异二聚糖蛋白。效应细胞如T-细胞的抗原呈递在非自我识别中是基本步骤并因此引发免疫反应。最近表明，MHC类别II异二聚体与称为不变链的第三分子在细胞内结合。不变链促进II型运输至内体结构并在用抗原装填前稳定II型蛋白。不变链在抗原结合槽中直接与II型二聚物相互作用，因此必须进行蛋白水解和去除，或者不能装填或存在抗原。当前研究表明，不变链被组织蛋白酶S选择性地蛋白水解，其在细胞内与MHC类别II络合物区分。组织蛋白酶S将不变链降解成小肽(称为CLIP)，其占据抗原-结合槽。通过MHC类别II与HLA-DM的相互作用，从MHC类别II中释放出CLIP，由此从MHC类别II中释放出的类MHC分子与抗原肽结合。然后，MHC类别II-抗原络合物运输至细胞表面，以呈递至T-细胞并引发免疫反应。通过不变链的蛋白降解成CLIP，组织蛋白酶S提供产生免疫反应的基本步骤。从而通过组织蛋白酶S阻止不变链降解来抑制抗原呈递，可以提供一种免疫调节机理。已经长时间希望通过控制抗原特异性免疫反应作为自身免疫疾病的有用的和安全的治疗。这些疾病包括克罗恩病和关节炎，以及其它T-细胞介导的免疫反应(C.JanewayandP.Travers，1996，Immunobiology，TheImmuneSysteminHealthandDisease，Chapter12)。此外，组织蛋白酶S，其具有宽的pH特异性，已经与涉及胞外蛋白水解的各种其它疾病有关，例如阿尔茨海默氏病(U.Muller-Ladner等人，1996，PerspectivesinDrugDiscoveryandDesign，6，87)、动脉粥样硬化(G.K.Sukhova等人，1998，J.Clin.Invest.，102，576)和子宫内膜异位(WO9963115，1999)。现已发现，组织蛋白酶S抑制剂阻断IgE值上升和肺过敏症的小鼠模型的肺中的嗜曙红细胞渗入，表明组织蛋白酶S可能与哮喘有关(R.J.Riese等人，J.Clin.Investigation，1998，101，2351)。半胱氨酸蛋白酶的特点在于在活性位点处具有半胱氨酸残基其起亲核基团的作用。该活性位点还含有组氨酸残基。组氨酸上的咪唑环起碱的作用，在活性位点半胱氨酸上生成硫醇盐阴离子，以增加它的亲核性。当底物被蛋白酶识别时，待裂解的酰胺键指向该活性位点，其中此硫醇盐进攻羰基碳，形成酰基酶-中间体并裂解该酰胺键，释放出胺。接着，水裂解该酰基-酶物质，生成该酶并释放出该底物的其它裂解产物，一种羧酸。半胱氨酸蛋白酶抑制剂含有可以与该活性位点半胱氨酸可逆或不可逆反应的官能度。在半胱氨酸蛋白酶抑制剂上，已经描述(D.Rasnick，1996，PerspectivesinDrugDiscoveryandDesign，6，47)的活性官能度的例子包括肽基重氮甲烷、环氧化物、单氟烷烃和酰氧基甲烷，其不可逆地烷基化该半胱氨酸硫醇。其它不可逆抑制剂包括Michael受体例如肽基乙烯基酯以及其它羧酸衍生物(S.Liu等人，J.MedChem.，1992，35，1067)和乙烯基砜(J.T.Palmer等人，1995，J.MedChem.，38，3193)。与所述的活性位点半胱氨酸形成可逆络合物的活性官能度包括肽基醛(R.P.Hanzlik等人，1991，Biochim.Biophys.Acta.，1073，33)，其是非选择性的，抑制半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶以及其它亲核物质。肽基腈(R.P.Hanzlik等人，1990，Biochim.Biophys.Acta.，1035，62)比醛活性更低，因此对更大亲核性的半胱氨酸蛋白酶具有更高的选择性。据报道，各种活性酮也是半胱氨酸蛋白酶的可逆抑制剂(D.Rasnick，1996，ibid)。除与活性位点的亲核性半胱氨酸反应外，活性酮可以与水反应，生成一种可以作为过渡态抑制剂的半酮缩醇。已经报道了组织蛋白酶S抑制剂的例子。J.L.Klaus等人(WO96/40737)描述了包括组织蛋白酶S的半胱氨酸蛋白酶的可逆抑制剂，其含有乙二胺。Palmer等人的美国专利号5,776,718在它的最宽的一般方面公开了一种蛋白酶抑制剂，该蛋白酶抑制剂包含通过两碳原子链与吸电子基团(EWG)连接的目标基团。本申请的化合物在结构上是不同的，并因此从所述的5,776,718专利中排除，本发明的具体实施方案具有出乎意料地比现有技术最接近化合物更大的活性。US6,353,017描述了具有作为组织蛋白酶B、K、L和S抑制剂活性的二肽腈。基于二肽腈的组织蛋白酶S抑制剂的例子已经由Novartis申请WO99/24460,1999和有关的美国专利6,353,017报道。一般结构之一描述在下面。公开了R4和R5一起表示低级亚烷基，任选被O、S或NR6间断，以便与它们相连的碳原子一起形成环，R3是低级烷基(定义为支链的或无支链的1-7个碳原子)。然而，在这些文献中，R4和R5的具体例子被限定为氢、甲基或连接在一起形成环丙基。没有描述R4和R5是杂环稠合的例子。WO99/24460举例说明了更大的R4和R5是稠合碳环如环己基，但是没有提供杂环的例子或教导它们将带来任何好处。此外，虽然R3的描述在种属上可能包括烷基P2侧链，但是它没有举例说明提供本发明好处的具体结构。另一类基于二肽腈的组织蛋白酶S抑制剂描述在美国专利6,492,362中。在本专利中要求的一个具体实例是具有N-甲基哌啶P1杂环。然而，根据US6,492,362所包含的主题的定义，要求下面一般结构所说明的含有P2侧链的磺酰基。美国专利号6,525,052和6,420,364，由本申请的受让人共同拥有，描述了带P1杂环的二肽腈，在此所述的本发明提供一种改善选择性分布的非显而易见的好处。其它的肽基腈已经作为蛋白酶抑制剂被报道。例如，B.A.Rowe等人(US5,714,471)描述了作为蛋白酶抑制剂的腈和酮基杂环，用于治疗神经变性疾病。B.Malcolm等人(WO9222570)报道了肽基腈作为微小RNA病毒蛋白酶的抑制剂。B.J.Gour-Salin(Can.J.Chem.，1991，69，1288)和T.C.Liang(Arch.Biochim.Biophys.，1987，252，626)描述了作为木瓜蛋白酶抑制剂的肽基腈。可逆抑制剂表现出比不可逆抑制剂更吸引人的疗效。即使对特定蛋白酶具有高特异性的化合物也可能结合非靶酶。因此，不可逆化合物可能永久地使非靶酶失活，增加毒性的可能性。此外，由靶酶失活引起的任何毒性作用可以通过可逆抑制剂减轻，并且可能通过修饰或降低剂量很容易补救。最后，通过不可逆抑制剂的酶共价改性可能潜在地发生起半抗原作用的抗体反应。高选择性蛋白酶抑制剂还提供更吸引人的治疗选择。通常，为了避免潜在的与抑制其它靶标有关的毒性，选择性是需要的。组织蛋白酶L是组织蛋白酶S的一种密切相关的家族成员。现已表明，缺乏组织蛋白酶L或具有非功能性组织蛋白酶L的小鼠表现出许多不希望的表型，包括脑萎缩(U.Felbor等人，2002，PNASUSA，99(12)7883)进行性心肌病(J.Stypmann，等人，2002，PNASUSA，99(9)6234)、男性生殖系统损伤(W.W.Wright，等人，2003，BiologyofReproduction，68(2)680)和严重的表皮增生(F.Benavides，等人，2002，AmericanJoumalofPatholog，161(2)693)。综上所述，需要这样的化合物，其可逆地和选择性地抑制组织蛋白酶S，以用于这些蛋白酶使疾病恶化的适应症。发明概述因此，本发明的一个目的是提供如文中所述的可逆地和选择性地抑制半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶S的化合物。本发明的另一目的是提供治疗由这些组织蛋白酶S恶化的疾病和病理状态的方法，例如，但不限于，类风湿性关节炎、多发性硬化和哮喘。本发明的还有另一目的是提供制备上述化合物的方法。发明的详细说明本发明化合物的特征在于特异性的P2侧链3，3-二甲基戊基(I)、2，2，3，3-四甲基丁基(II)和3，3-二甲基丁基(III)，其显著改善了这些抑制剂对组织蛋白酶S超过对它的密切相关的家庭成员组织蛋白酶L的选择性。因此，一方面本发明提供式(I)、(II)的化合物，或其药学上可接受的盐，其对于组织蛋白酶S是选择性的其中X在每种情况下选自和R1选自氢或支链烷基或直链烷基，链中的每个碳原子任选被1-3个选自O、S和N-R2的杂原子所代替其中R2是氢或烷基；以及其中R1任选进一步被一个或多个烷氧基、胺、卤素、碳环、杂芳基或杂环取代。在本发明的另一种实施方案中，本发明提供上述式(I)的化合物其中X选自R1选自氢或支链的C1-10烷基或直链的C1-10烷基，链中的每个碳原子任选被1-3个选自O、S和N-R2的杂原子所代替其中R2是氢或C1-5烷基；以及其中R1任选进一步被一个或多个C-15烷氧基、胺、杂环或卤素取代。R1的一种优选实施方案包括C1-5烷基，优选C1-3烷基，最优选甲基。在R1的另一种优选实施方案中，R1选自和在本发明的一种优选实施方案中，本发明提供根据上述任一种实施方案的式(I)的化合物，以及其中下面所示的手性碳是具有一种天然氨基酸构型的(S)对映异构体本发明的另一方面，提供了对组织蛋白酶S是选择性的下列化合物或其药学上可接受的盐和在本发明的另一种实施方案中，本发明提供了对组织蛋白酶S是选择性的下列化合物或其药学上可接受的盐其中下面所示的手性碳是具有一种天然氨基酸构型的(S)对映异构体。本发明的第二方面，提供了对组织蛋白酶S是选择性的下式(III)的化合物或其药学上可接受的盐和除非另有说明，含有一个或多个不对称碳原子的本发明任何化合物可以以外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单个非对映异构体的形式出现。所有这些化合物的异构形式清楚地包括在本发明内。除非另有说明，每一立体异构碳可以是R或S构型或构型的组合。在优选的本发明的化合物中，P2手性碳是具有一种天然氨基酸构型的(S)对映异构体。本发明的一些化合物可以以不止一种互变异构的形式存在。本发明包括所有这些互变异构体。本领域普通熟练技术人员应该理解，本发明的所有化合物是化学稳定的。本发明包括本发明化合物的药学上可接受的衍生物。″药学上可接受的衍生物″是指本发明化合物的任何药学上可接受的酸、盐或酯，或当给药于患者时能(直接或间接地)提供本发明化合物的任何其它化合物，其药理学活性代谢物或药理学活性残基。此外，本发明的化合物包括前药。前药包括那些化合物，其在经过简单转化后，被修饰生成本发明的化合物。简单化学转化包括发生酶、代谢或其它的水解、氧化和还原。具体地说，当将本发明的前药给予患者时，可将该前药转化为本发明的化合物，由此赋予所需的药理学作用。根据本发明，特别重要的是式(I)、(II)或(III)的化合物，其中X和R1具有所示的含义，用作具有抗组织蛋白酶S活性的药物组合物。本发明还涉及式(I)、(II)或(III)化合物的用途，其中X和R1具有所示的含义，用于制备用于治疗和/或预防与组织蛋白酶S相关的疾病或病症的药物组合物。本发明还涉及药物制剂，含有作为活性物质的一种或多种式(I)、(II)或(III)的化合物，其中X和R1具有所示的含义，或其药学上可接受的衍生物，任选与常规赋形剂和/或载体结合。为了更全面地理解本发明，将进行下列更详细的说明。在此使用以下缩写BOC或t-BOC是叔丁氧羰基；t-Bu是叔丁基；DMF是二甲基甲酰胺；EtOAc是乙酸乙酯；THF是四氢呋喃；NMM是4-甲基吗啉CH2Cl2是二氯甲烷；MgSO4是硫酸镁；Na2SO4是硫酸钠；Ar是氩气；EDC是1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，以及HOBT是1-羟基苯并三唑。同样，在此所使用的每一下列术语，单独使用或与其它术语一起使用，如下面所定义(除非另有与此相反的定义)术语“烷基”是指含有1-10个碳原子的饱和脂肪族基团或含有2-12个碳原子的单-或多不饱和脂肪族烃基。所述的单-或多不饱和脂肪族烃基分别含有至少一个双键或三键。“烷基”是指支链烷基和无支链的烷基。″烷基″的例子包括含有1-8个碳原子的直链烷基和含有3-8个碳原子的支链烷基。其它例子包括低级烷基，其是含有1-6个碳原子的直链烷基和含有3-6个碳原子的支链烷基。应当理解，使用″alk″或″烷基″前缀的任何组合术语是指根据上面定义的″烷基″类似物。例如，术语如″烷氧基″、″烷硫基″是指通过氧或硫原子与第二个基团连接的烷基。″烷酰基″是指与羰基(C＝O)连接的烷基。在此所述的每一烷基或烷基类似物应该理解成任选被部分或全部卤化的。碳环是指芳香族的″芳基″或部分饱和的，或非芳香族的环烷基。术语″环烷基″是指如上所定义的烷基的环状类似物。环烷基的例子是饱和的或不饱和的非芳香族的含有3-8个碳原子的环烷基，以及其它例子包括具有3-6个碳原子的环烷基。在此所述的每一环烷基应该理解成被任选部分或全部卤化的。术语″芳基″是指苯基和萘基。术语″卤素″是指选自氟、氯、溴或碘的卤素基团。本发明的代表性的卤素基团是氟、氯和溴。术语″杂芳基″是指稳定的5-8员(但优选，5或6员)单环或8-11员二环芳香族杂环基团。每一杂环由碳原子和1-4个选自氮、氧和硫的杂原子组成。该杂环可以通过环的任何原子连接，其导致形成一种稳定的结构。″杂芳基″的例子包括基团例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、四唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、中氮茚基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、嘌呤基、喹嗪基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基和吩噁嗪基。术语″杂环″是指稳定的4-8员(但优选，5或6员)单环或8-11员二环杂环基团，其可以是饱和的或不饱和的，以及是非芳香族的。每一杂环由碳原子和1-4个选自氮、氧和硫的杂原子组成。该杂环可以通过环的任何原子连接，其导致形成一种稳定的结构。″杂环″的例子包括基团例如吡咯啉基、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、吡喃基、硫代吡喃基、哌嗪基、二氢吲哚基、氮杂环丁烷基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢呋喃基、六氢嘧啶基、六氢哒嗪基、1，4，5，6-四氢嘧啶-2-基胺、二氢-噁唑基、1，2-噻嗪烷基(thiazinanyl)-1，1-二氧化物、1，2，6-噻二嗪烷基-1，1-二氧化物、异噻唑啉基-1，1-二氧化物和咪唑烷基-2，4-二酮。术语″杂环″、″杂芳基″或″芳基″，当与另一部分相连时，除非另有说明，应该具有上面所给出的相同含义。例如，″芳酰基″是指与羰基(C＝O)相连的苯基或萘基。除非另有说明，每一芳基或杂芳基包括它的部分或全部氢化的衍生物。例如，喹啉基可以包括十氢喹啉基和四氢喹啉基，萘基可以包括它的氢化衍生物例如四氢萘基。在此所述的芳基和杂芳基化合物的其它部分或全部氢化的衍生物对本领域普通熟练技术人员来说是显而易见的。术语″胺″应该理解为是指-NH2基团，其中每一氢原子可以被烷基、碳环、碳环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环、杂环烷基代替，这样该胺的氮可以被所述基团单-或二-取代。如上面和整个本申请所使用的，″氮″和″硫″包括氮和硫的任何氧化形式以及任何碱性氮的季铵化形式。为了更充分地理解本发明，将对下列实施例进行阐述。这些实施例用于说明本发明的优选实施方案，但是并不是以任何方式将其理解为对本发明范围的限制。下面的实施例是说明性的，这一点可以被本领域熟练技术人员认识到，如果需要，对于个别化合物可以改变具体试剂或条件。在方案中所使用的初始原料或者是市场上可买到的，或者容易地由本领域熟练技术人员从市场上可买到的原料进行制备。一般合成方法本发明还提供在此所述的本发明化合物的制备方法。本发明的化合物可以通过美国专利号6,420,364和6,525,052中所述的方法以及通过本领域熟练技术人员公知的方法进行制备，这两篇文献在此整个引入作为参考。为了更充分地理解本发明，将对下列实施例进行阐述。这些实施例用于说明本发明的优选实施方案，但是并不是以任何方式将其理解为对本发明范围的限制。下面的实施例是说明性的，这一点可以被本领域熟练技术人员认识到，如果需要，在没有过度实验的情况下，对于个别化合物可以改变具体试剂或条件。在方案中所使用的初始原料或者是市场上可买到的，或者容易地由本领域熟练技术人员从市场上可买到的原料进行制备。合成实施例实施例1-4说明用于合成新的式(I)化合物的P2氨基酸中间体的合成。实施例12-叔丁氧基羰基氨基-4，4，5，5-三甲基-己酸的合成在氩气氛中，将二异丙基氨基锂(LDA)(1.5M的环己烷/THF/乙苯溶液)(106mL，160mmol，1.15当量)注射到1000mL圆底烧瓶中。加入干燥THF(150mL)，接着用干冰/丙酮浴将混合物冷却至-78℃。在10分钟内，通过注射器滴加3，3-二甲基-丁酸乙酯(20g，23.3mL，139mmol，1.0当量)，接着在-78℃搅拌1小时。在10分钟内，用注射器滴加碘甲烷(9.5mL，152mmol，1.1当量)，接着将该奶油状混合物在-78℃搅拌1小时，得到一种非常稠的混合物。除去干冰浴，以0℃冰浴代替。加入另外150mL干燥THF，接着加入另外的LDA(106mL，160mmol，1.15当量)。将所得混合物搅拌10分钟，然后将该圆底烧瓶再浸于干冰/丙酮浴中。再继续搅拌50分钟，然后滴加碘甲烷(9.5mL，152mmol，1.1当量)，除去干冰/丙酮浴，然后将所得混合物在环境温度下搅拌14小时。反应混合物用3mL浓HCl淬灭，加入2N的HCl直到pH值调节到＜1为止。混合物进一步用150mL水和500mLEt2O稀释。分离层，有机层用1×100mL2NHCl、1×100mL饱和NaHCO3和1×200mL盐水洗涤。有机层在Na2SO4中干燥，然后在真空中进行浓缩，得到与乙苯混合的橙色油形式的2，2，3，3-三甲基丁酸乙酯，通过NMR分析获知其中19.8g是产品(80％的收率)。该混合物没有进一步提纯就使用。装有搅拌棒的500mL圆底烧瓶用氩气冲洗，接着装入50mL干燥THF和1MLiAlH4在Et2O中的溶液(70.6mL，70.6mmol，0.625当量)。用冰浴将该溶液冷却至0℃，以使该溶液不会回流的速度(需要50分钟)向其中滴加上述乙酯(19.5g，113mmol，1.0当量)(约50％的乙苯溶液)。加入所述的酯后，反应在0℃搅拌2小时，然后在环境温度下搅拌14小时。将该反应溶液再次冷却至0℃，然后通过加入EtOAc小心地淬火反应。加入1NNaOH直到生成粒状沉淀为止(7.5mL)。将该混合物在硅藻土垫上过滤，然后用3×100mLEt2O洗涤。合并有机物并在Na2SO4中干燥。将所述的溶液滗析，接着在真空中进行浓缩，得到几乎无色油形式的2，2，3，3-四甲基-丁醇(12.9g，88％的粗收率，与乙苯的混合物)。该粗产物没有进一步提纯就使用。1000mL圆底烧瓶安装有搅拌棒，用氩气冲洗，然后装入500mL干燥CH2Cl2和2，2，3，3-四甲基-丁醇(12.9g，99.2mmol，1.0当量)。在5分钟内分批加入氯铬酸吡啶鎓(pyridiniumchlorochromate)(PCC)(20.7g，96mmol)。反应混合物迅速变为暗色，接着在室温下搅拌3小时。然后滗析除掉反应溶剂，用1NHCl(1×250mL)洗涤，在旋转蒸发仪上浓缩。所得糊状残余物与己烷(300mL)一起搅拌10分钟，然后过滤。滤液用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，得到8.3g(65％收率)的所需2，2，3，3-四甲基-丁醛，其没有进一步提纯就使用。干燥250mL圆底烧瓶安装有搅拌棒并用氩气冲洗。加入干燥THF(40mL)，接着加入1.0M叔丁醇钾溶液(37.5mL，37.5mmol，1.2当量)。将所述的溶液在干冰/丙酮浴中冷却至-78℃。在10分钟内滴加异氰基乙酸甲酯(3.12mL，34.4mmol，1.0当量)。所得混合物再搅拌5分钟，接着通过注射器加入2，2，3，3-四甲基-丁醛(4.0，31.2mmol，1.0当量)。除去冷却浴，所得混合物在室温下搅拌1小时。通过加入125mLEt2O、20g冰和2mLAcOH的混合物，对反应混合物进行稀释。冰融后，加入50mL水，将所述的层混合，然后分离。有机层用1×50mL饱和NaHCO3洗涤，接着在Na2SO4中干燥。将有机层滗析，浓缩。将该粗烯酰胺(enamide)用硅胶快速色谱法提纯，使用CH2Cl2至含4％MeOH的CH2Cl2洗脱，得到稠的油状物的2-甲酰氨基-4，4，5，5-四甲基-己-2-烯酸乙酯(5.26g，74％)；C12H21NO3的m/z计算值227.3，实测值228.3(M+H)+。在Parr瓶中，将上述甲酯(5.26g，23.2mmol，1.0当量)溶于35MeOH中，接着加入PtO2(1g，4.4mmol，0.2当量)。混合物在Parr氢化装置中摇动4天，在此期间用MS监测起始物料的消耗情况。液体小心地进行滗析，Pt用20mLMeOH洗涤3次，每次进行滗析，注意不要使Pt干燥(如果让Pt干燥，Pt可能会引燃)。合并含还原产物的MeOH溶液，接着浓缩成稠的油状物，然后将该稠的油状物悬浮在25mL6NHCl中，将混合物回流4小时，在第一个3小时结束时加入5mL浓HCl。冷却混合物，在真空中在70℃的浴温下除去水和过量的HCl。约50％浓缩后，形成片状结晶固体。将混合物冷却至0℃，接着通过过滤收集沉淀。滤液再次浓缩约50％，再次冷却至0℃，得到第二次收成的晶体。合并晶体，在高真空中干燥，得到灰白色结晶固体形式的2-氨基-4，4，5，5-四甲基-己酸盐酸盐(1.40g，27％收率)；C10H21NO2的m/z的计算值187.3，实测值188.3(M+H)+。将上述氨基酸盐(1.40g，6.26mmol，1.0当量)溶于100mL50/50二噁烷/4NNaOH中。溶液冷却至0℃，加入Boc酸酐(2.05g，9.39mmol，1.5当量)。除去冷却浴，该反应在环境温度下搅拌16小时。用浓HCl将pH值小心调节到2，接着产物用3×100mLCH2Cl2萃取。合并有机层并在Na2SO4中干燥。溶液进行滗析接着用100mL己烷作为驱逐剂(chaser)进行浓缩，得到一稠玻璃，将其用100mL己烷研磨。剧烈搅拌4小时后，得到蜡状固体，过滤，在空气中干燥，得到标题化合物(1.21g，67％收率)；C15H29NO4的m/z的计算值287.4，实测值286.3(M-H)-。实施例22-叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸的合成将3，3-二甲基-戊-4-烯酸甲酯(20.0mL，126mmol，1.00当量)通过移液管小心加入到含LiAlH4(3.63g，96mmol，0.76当量)的500mL无水乙醚的悬浮液的2L烧瓶中(通过冰水浴冷却)。搅拌下将反应混合物温热至室温过夜，然后通过缓慢加入饱和酒石酸钾钠溶液(150mL)淬火反应。该混合物用醚(200mL)稀释，接着分离有机层，干燥(MgSO4)，浓缩，得到无色液体形式的3，3-二甲基-戊-4-烯-1-醇(11.0g，76％收率)。这种物质没有进一步提纯就使用；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.00(s，6H)，1.58(t，J＝7.3Hz，2H)，2.07(s，1H)，3.59(t，J＝7.3Hz，2H)，4.89-4.94(m，2H)，5.80(dd，J＝17.3，14.1，1H)。将无水DMSO(17.1mL，241mmol，2.5当量)滴加到用干冰/丙酮浴冷却的草酰氯(10.5mL，120mmol，1.25当量)的干燥CH2Cl2(400mL)溶液中。将这种溶液搅拌45分钟，然后通过套管(cannula)加入作为在CH2Cl2(50mL)中溶液形式的3，3-二甲基-戊-4-烯-1-醇(11.0g，96.3mmol，1.00当量)。将所得溶液在-78℃搅拌2小时。加入三乙胺(54mL，385mmol，4.0当量)，接着除去冷却浴。将反应温热至室温并再搅拌1.5小时。然后，将反应混合物用CH2Cl2(100mL)稀释，接着依次用饱和Na2CO3溶液和1NHCl(500mL)洗涤。将有机相进行干燥(MgSO4)，浓缩，将所得残余物放入石油醚(100mL)中，通过硅胶短塞过滤，得到所需的无色液体形式的3，3-二甲基-戊-4-烯-1-醛(5.80g，54％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.14(s，6H)，2.33(d，J＝3.1Hz，2H)，4.98-5.03(m，2H)，5.92(dd，J＝17.0，6.0，1H)，9.71(t，J＝3.1Hz，1H)。将N-(苄氧基羰基)-α-膦酰甘氨酸三甲酯(15.0g，45.3，1.00当量)、3，3-二甲基-4-戊-4-烯-1-醛(5.64g，50.3mmol，1.11当量)和DBU(6.8mL，45.5mmol，1.0当量)在干燥THF(150mL)中的溶液在室温下搅拌16小时。将反应混合物用醚(200mL)稀释，用水(2×100mL)洗涤，然后用盐水(100mL)洗涤。将有机层进行干燥(MgSO4)，浓缩。将所得残余物进行硅胶色谱分离，使用含乙酸乙酯的己烷作为梯度洗脱液，得到黄色油状形式的所需的烯酰胺，该黄色油静置时固化(8.60g，60％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.03(s，6H)，2.21(d，J＝7.3Hz，2H)，3.75(s，3H)，4.94-4.98(m，2H)，5.14(s，2H)，5.78(dd，J＝10.9，10.0Hz，1H)，6.10-6.20(m，1H)，6.65(t，J＝7.3Hz)，7.33-7.38(m，5H)。在40psi氢气下，将10％Pd/C催化剂(1.25g)、(Z)-2-苄氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚-2，6-二烯酸甲酯(8.60g，27mmol，1.0当量)和Boc酸酐(6.48g，29.7mmol，1.1当量)在甲醇(100mL)中的悬浮液在Parr氢化装置上摇动3天。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，浓缩，得到白色固体形式的叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸甲酯(6.10g，79％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ0.77(t，J＝15.1Hz，3H)，0.80(s，6H)，1.1-1.3(m，4H)，1.42(s，9H)，1.55-1.65(m，1H)，1.7-1.8(m，1H)，3.74(s，3H)，4.20-4.35(m，1H)，4.95-5.05m，1H)。在室温下，将上述甲酯(6.10g，21.2mmol，1.00当量)和氢氧化锂一水合物(6.2g，148mmol，6.98当量)在四氢呋喃(20mL)、甲醇(5mL)和水(5mL)中的悬浮液搅拌5小时。将反应混合物用乙醚(100mL)稀释，接着用1NHCl(2×50mL)洗涤。干燥有机层(MgSO4)，浓缩，得到白色固体形式的标题化合物(5.05g，87％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ0.74-0.82(m，9H)，1.10-1.28(m，4H)，1.45(s，9H)，1.52-1.63(m，1H)，1.75-1.90(m，1H)，4.20-4.30(m，1H)，4.94-5.02(m，1H)。实施例3(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸的合成将R，R-DIPAMP环辛二烯Rh(I)四氟硼酸酯(190mg，0.25mmol，0.04当量)加入到在Paar氢化烧瓶中的(Z)-2-苄氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚-2，6-二烯酸甲酯(2.00g，6.30mmol，1.00当量)在干燥甲醇(20mL)中的溶液中。抽空反应器并用氢气冲洗3次，然后在50psi氢气下剧烈摇动过夜。将反应混合物在真空中进行浓缩，然后通过硅胶塞过滤，使用乙酸乙酯的己烷溶液作为梯度洗脱液，得到黄色油状形式的(S)-2-苄氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸甲酯(1.63g，81％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ0.74-0.90(m，9H)，1.10-1.30(m，4H)，1.58-1.70(m，1H)，1.75-1.90(m，1H)，3.75(s，3H)，4.30-4.40(m，1H)，5.14(s，2H)，5.24-5.33(m，1H)，7.30-7.37(m，5H)；[α]20D＝+15.57c＝2.00，CHCl3。在Paar反应器中，将10％Pd/C催化剂(160mg)加入到上述带Cbz保护基的氨基酸(1.63g，5.07mmol，1.00当量)和Boc酸酐(1.16g，5.32mmol，1.05当量)在甲醇(25mL)中的溶液中。将反应混合物在50psi氢气中摇动过夜。通过硅藻土垫过滤反应混合物，浓缩所得滤液，得到1.33g(91％收率)的Boc保护的中间体。这种物质没有进一步提纯就使用。在室温下，将上述Boc保护的中间体(1.33g，4.63mmol，1.00当量)和氢氧化锂一水合物(1.36g，32.4mmol，7.00当量)在四氢呋喃(5mL)、甲醇(2mL)和水(2mL)中的悬浮液搅拌5小时。将反应混合物用乙醚(100mL)稀释，接着用1NHCl(2×50mL)洗涤。干燥有机层(MgSO4)，浓缩，得到白色固体形式的标题化合物(991，78％收率)。1HNMR与外消旋产物(实施例2)相符。实施例4(R)-2-叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸的合成通过它的对映异构体(实施例3)的类似方法制备得到这种化合物，但是使用R，RDuPhos铑三氟甲磺酸酯(R，RDuPhosrhodiumtriflate)作为不对称氢化反应的催化剂。1HNMR与外消旋产物(实施例2)相符。实施例5-8说明上述本发明的新化合物的合成。实施例5吗啉-4-羧酸[(S)-1-(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-4，4-二甲基-己基]-酰胺的合成将氯甲酸异丁酯(0.47mL，3.62mmol，1.00当量)滴加到用冰水浴冷却下的(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸(实施例3)(991mg，3.62mmol，1.00当量)和4-甲基吗啉(1.2mL，10.9mmol，3.00当量)在10.0mL无水THF中的溶液中。将反应混合物温热至室温并搅拌30分钟。然后，加入N-甲基哌啶氨基腈(500mg，3.60，0.99当量)在干燥THF(5.0mL)中的溶液，接着在室温下继续搅拌过夜。然后浓缩反应混合物，在乙酸乙酯(50mL)中吸收，接着用饱和Na2CO3(2×25mL)洗涤。将有机相进行干燥(MgSO4)，浓缩。将所得残余物进行硅胶色谱分离，使用含甲醇的二氯甲烷作为梯度洗脱液，得到415mg(29％收率)所需的[(S)-1-(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-4，4-二甲基-己基]-氨基甲酸叔丁酯；C21H38N4O3的m/z的计算值394.5，实测值395.4(M+H)+。将上述叔丁酯(415mg，1.05mmol，1.00当量)用在二噁烷(10mL)中的4.0NHCl处理，接着将反应混合物在室温下搅拌2小时。浓缩反应混合物，再悬浮在氯仿(50mL)中，浓缩，得到所需的(S)-2-氨基-5，5-二甲基-庚酸(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基)-酰胺盐酸盐(307mg，78％收率)。C16H30N4O的m/z的计算值294.4，实测值295.1(M+H)+。在室温下，将上述盐酸盐(301mg，0.82mmol，1.00当量)、吗啉羰基氯(0.10mL，0.82mmol，1.00当量)和4-甲基吗啉(0.27mL，2.4mmol，2.93当量)在干燥THF(5.0mL)中的悬浮液搅拌过夜。然后浓缩反应混合物，吸收到乙酸乙酯(50mL)中，接着用饱和Na2CO3(2×25mL)洗涤。将有机相进行干燥(MgSO4)，浓缩。所得残余物进行硅胶色谱分离，使用含甲醇的二氯甲烷作为梯度洗脱液，得到白色固体形式的115mg(34％收率)的标题化合物；C21H37N5O3的m/z的计算值407.6，实测值408.6(M+H)+。手性HPLC表明＞97％ee(来自高级分离技术的ChirobioticT柱)。下列化合物通过类似于上面实施例中所述的方法进行制备吗啉-4-羧酸[1-(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-3，3，4，4-四甲基-戊基]-酰胺C24H43N5O3的m/z的计算值449.6，实测值450.6(M+H)+；吗啉-4-羧酸[1-(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-4，4-二甲基-戊基]-酰胺必需的P2氨基酸中间体，2-叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-己酸，通过类似于下面制备2-叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸(实施例2)的方法进行制备，用市场上可买到的3，3-二甲基丁-1-醛代替中间体3，3-二甲基-戊-4-烯-1-醇；C22H39N5O3的m/z的计算值421.6，实测值422.9(M+H)+；吗啉-4-羧酸[1-(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-4，4-二甲基-己基]-酰胺C23H41N5O3的m/z的计算值435.6，实测值436.5(M+H)+。实施例6吗啉-4-羧酸[(S)-1-(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-4，4-二甲基-己基]-酰胺(6)的合成将10％Pd/C(1.5g)加入到用Cbz保护的氨基酸酯(参见实施例2)(27g，84mmol)和乙酸乙酯(135mL)的溶液中。抽空反应器中的空气并用50psi氢气充满。反应混合物剧烈摇动16小时，然后通过大硅藻土垫过滤。滤液用旋转蒸发仪浓缩，得到浅黄色油形式的所需的胺中间体(15.7g，100％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ0.74-0.79(m，9H)，1.14-1.23(m，4H)，1.40-1.80(m，2H)，3.37(t，J＝3.6Hz，1H)，3.69(s，3H)。向上述胺中间体(16.0g，85.4mmol，1.00当量)在干燥THF(300mL)中的溶液中加入4-甲基吗啉(10.4mL，94mmol，1.10当量)，接着滴加吗啉羰基氯(10.0mL，85.7mmol，1.00当量)。所述的反应混合物在室温下搅拌5小时，然后用乙醚(400mL)稀释，接着用1NHCl(2×500mL)洗涤。有机相进行干燥(MgSO4)，浓缩，得到白色固体形式的所需的(S)-5，5-二甲基-2-[(吗啉-4-羰基)-氨基]-庚酸甲酯(22.5g，88％收率)；C15H28N2O4的m/z的计算值300.4，实测值301.1(M+H)+。将上述甲酯(12.9g，42.9，1.00当量)溶于甲醇(60mL)中，然后用1NLiOH(180mL，4.20当量)处理。反应混合物在室温下搅拌2小时，然后用乙醚(200mL)洗涤。然后，用浓HCl将水相酸化至pH＜1并用乙醚(2×200mL)萃取。合并有机相，干燥(MgSO4)，浓缩，得到所需的羧酸(9.0g，73％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ0.79(t，J＝7.5Hz，3H)，0.82(s，6H)，1.60-1.73(m，1H)，1.80-1.95(m，1H)3.37-3.42(m，4H)，3.69-3.72(m，4H)，4.30-4.40(m，1H)，4.96-5.04(m，1H)。将上述羧酸(4.5g，15.7mmol，1.08当量)、HOBT(2.93g，21.7mmol，1.5当量)和EDC(3.06g，16.0mmol，1.10当量)在干燥二氯甲烷中的混合物在0℃搅拌35分钟。一次性加入4-氨基-1-甲基-哌啶-4-腈(2.02g，14.5mmol，1.00当量)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，接着将反应混合物温热至室温过夜。在真空中除去溶剂，将粗产物溶于最少量的甲醇中，然后用水析出，得到白色固体形式的标题化合物(2.70g，42％收率)；C21H37N5O3的m/z的计算值407.6，实测值408.6(M+H)+；手性HPLC分析表明＞99％ee(来自高级分离技术的ChirobioticT柱)。下列化合物通过类似于上面实施例中所述的方法进行制备吗啉-4-羧酸[(R)-1-(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-4，4-二甲基-己基]-酰胺C21H37N5O3的m/z的计算值407.6，实测值408.6(M+H)+；手性HPLC表明＞99％ee(来自高级分离技术的ChirobioticT柱)。实施例75，5-二甲基-2-(2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-庚酸(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基)-酰胺的合成将4-氯-苯并[e][1，3]噁嗪-2-酮(620mg，3.41mmol，2.0当量)、2-氨基-5，5-二甲基-庚酸(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基)-酰胺(675mg，1.71mmol，1.00当量)和4-甲基吗啉(NMM)(0.56mL，5.09mmol，3.00当量)在乙腈(9.0mL)中的悬浮液在室温下搅拌过夜。然后浓缩反应混合物，再悬浮到乙酸乙酯(50mL)中，接着用饱和Na2CO3溶液洗涤。将有机相干燥(MgSO4)，浓缩，然后将所得残余物进行硅胶色谱分离，使用含甲醇的二氯甲烷作为梯度洗脱液，得到124mg(16％收率)的标题化合物；C26H37N5O3的m/z的计算值467.6，实测值468.4(M+H)+。下列化合物通过类似于上面实施例中所述的方法进行制备5，5-二甲基-2-(2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-庚酸(4-氰基-1-(3-吗啉-4-基-丙基)-哌啶-4-基)-酰胺C30H44N6O4的m/z的计算值552.7，实测值553.9(M+H)+；5，5-二甲基-2-(2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-己酸(4-氰基-1-(2-吗啉-4-基-乙基)-哌啶-4-基)-酰胺C28H40N6O4的m/z的计算值524.7，实测值525.5(M+H)+；5，5-二甲基-2-(2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-己酸{4-氰基-1-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基]-哌啶-4-基}-酰胺该标题化合物通过方法3的改进方法进行制备；C27H39N5O5的m/z的计算值513.6，实测值514.5(M+H)+；5，5-二甲基-2-(2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-己酸(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基)-酰胺C23H31N5O3的m/z的计算值425，实测值426(M+H)+。实施例82-(7-氟-2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-5，5-二甲基-庚酸(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基)-酰胺的合成将2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(365mg，1.43mmol，1.00当量)加入到7-氟-4-硫代-3，4-二氢-苯并[e][1，3]噁嗪-2-酮(280mg，1.42mmol，1.00当量)、2-氨基-5，5-二甲基-庚酸(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基)-酰胺(627mg，1.42mmol，1.00当量)和N，N-二异丙基乙胺(1.00mL，5.74mmol，4.04当量)在THF(10.0mL)中的悬浮液中。反应混合物在室温下搅拌过夜，然后浓缩，再悬浮到乙酸乙酯(50mL)中，接着用饱和Na2CO3溶液洗涤。将有机相干燥(MgSO4)，浓缩，然后将所得残余物进行硅胶色谱分离，使用含甲醇的二氯甲烷作为梯度洗脱液，得到324mg(47％收率)的标题化合物；C26H36FN5O3的m/z的计算值485.6，实测值486.5(M+H)+。下列化合物通过类似于上面实施例中所述的方法进行制备2-(7-氟-2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-5，5-二甲基-己酸{4-氰基-1-(2-吗啉-4-基-乙基)-哌啶-4-基}-酰胺C28H39FN6O4的m/z的计算值542.6，实测值543.5(M+H)+；2-(7-氟-2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-5，5-.二甲基-己酸{4-氰基-1-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基]-哌啶-4-基}-酰胺C27H38FN5O5的m/z的计算值531.6，实测值532.4(M+H)+。治疗用途的方法本发明的化合物用于抑制组织蛋白酶S的活性。在这种情况下，这些化合物用于阻断由这些半胱氨酸蛋白酶介导的疾病过程。本发明的化合物有效地阻断不变链通过组织蛋白酶S降解成CLIP，由此抑制抗原呈递和抗原特异性免疫反应。控制抗原特异性免疫反应是治疗自身免疫疾病以及其它不希望的T-细胞介导的免疫反应的吸引人的方法。因此，本发明的化合物可以用于治疗这些病症。这些包括自身免疫疾病以及其它疾病包括不适当的抗原特异性免疫反应，包括但不限于，类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、吉-巴综合征、牛皮癣、格雷夫斯氏疾病、重症肌无力、硬皮病、肾小球肾炎、皮炎包括接触性和特应性皮炎、胰岛素依赖性糖尿病、子宫内膜异位和哮喘包括过敏性哮喘。本发明的化合物还可以用来治疗与胞外蛋白水解有关的其它疾病例如阿尔茨海默氏病和动脉粥样硬化。本发明的化合物还可以用来治疗与不适当自身免疫反应、T-细胞介导的免疫反应或组织蛋白酶S介导的胞外蛋白水解有关的其它疾病，与上面在本发明
背景技术：
部分所列或所讨论的那些没有关系。因此，本发明还提供调节自身免疫性疾病的方法，包括给予需要这种治疗的患者药学有效量的本发明的化合物。对于治疗应用，本发明的化合物可以以任何常规的剂型以任何常规的方式给药。给药途径包括，但不局限于，静脉内、肌内、皮下、滑膜内、输注、舌下、经皮、经口、局部或吸入。优选的给药方式是经口给药和静脉注射。本发明的化合物可以单独给药，或与助剂一同给药，这些助剂用于提高该抑制剂的稳定性、在一些实施方案中促进含它们的药物组合物的给药、增加溶解度或分散度、增加抑制活性、提供辅助治疗等等，包括与其它活性成分联合给药。有利地，这种联合治疗使用了常规治疗的较低剂量，因此避免了当这些药物用作单一疗法时所带来的可能毒性和不良副作用。本发明的化合物实际上可以与常规治疗剂或其它佐剂结合在一起形成单一的药物组合物。有利地，然后可将该化合物以单一剂型给药。在一些实施方案中，包含这些化合物组合的药物组合物含有至少约15％，更优选至少约20％的本发明的化合物(w/w)或其组合。做为选择，所述的化合物可以单独给药(连续或并行)。单独给药考虑到给药方法(dosingregime)的更大适应性。如上所述，本发明化合物的剂型包括本领域熟练技术人员已知的那些药学上可接受的载体和佐剂。这些载体和佐剂例如包括离子交换剂、矾土、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白、缓冲物质、水、盐或电解质以及基于纤维素的物质。优选的剂型包括片剂、胶囊、小胶囊、液体、溶液、悬浮液、乳剂、锭剂、糖浆、可稀释配制的粉剂(reconstitutablepowder)、颗粒剂、栓剂和皮肤贴剂(transdermalpatch)。制备这些剂型的方法是已知的(例如参见，H.C.Ansel和N.G.Popovish，PharmaceuticalDosageFormsandDrμgDeliverySystems，5thed.，LeaandFebiger(1990))。在本领域中，剂量水平和要求是公知的，并且可以由本领域普通技术人员根据适于特定患者的方法和技术进行选择。在一些实施方案中，对于70kg患者，剂量水平的范围在约10-1000mg/剂量之间。虽然每天一个剂量可能已经足够，但是每天最高可以给予5个剂量。对于口服剂量，可能需要高达2000mg/天。本领域熟练技术人员应当理解，根据特定因素可能需要较低的或较高的剂量。例如，具体剂量和治疗方案将取决于因素如患者的一般健康状况、患者疾病的严重程度和进程或对其的处置，以及主治医师的判断。生物学特性的评价重组人组织蛋白酶S的表达和纯化人组织蛋白酶S的克隆使U937RNA与引物A(5’cacaatgaaacggctggtttg3’)及引物B(5’ctagatttctgggtaagaggg3’)进行逆转录酶/聚合酶链式反应，所述引物用来特异地扩增组织蛋白酶ScDNA。将所得的900bpDNA片段亚克隆入pGEM-T(Promega)并进行测序以证实它的同一性(identity)。该构建体用于所有随后的操作中。这种方法是已知基因的常规克隆法并且已经在其领域中确定。通过如下方法从pGem-T载体(Promega，2800WoodsHollowRd，Madison，WI53711)除去人Pre-Pro-CatS限制酶SacII消化，接着用T4DNA聚合酶处理生成钝端，然后用第二种限制酶SalI消化。将它亚克隆入已经用限制酶BamH1切割并钝端化然后用限制酶SalI切割的pFastBac1供体质粒(GibcoBRL，8717GrovemontCr.，Gaithersburg，MD20884)中。将该连接混合物用来转化DH5a感受态细胞(GibcoBRL)，并铺在含100μg/ml氨苄青霉素的LB板上。菌落在含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的过夜培养物中生长，分离质粒DNA，然后通过限制酶消化确认正确的插入子。将重组pFastBac供体质粒转化入DH10Bac感受态细胞(GibcoBRL)。从含50μg/mL卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/mL四环素、100μg/mLBluo-gal和40μg/mlIPTG的LB板中挑取大的白色菌落。分离DNA并使用CellFECTIN试剂(GibcoBRL)转染Sf9昆虫细胞。72小时后收获细胞和上清液。病毒上清液传代两次，通过对上清液进行PCR来证实CatS的存在。SF9细胞用重组体杆状病毒以MOI5感染48-72小时。裂解细胞，在pH4.5的缓冲液中、37℃保温2小时以将CatS从原(pro)-形式激活为活性成熟形式(Bromme，D&McGrath，M.，ProteinScience，1996，5789-791)。使用兔抗人原(pro)CatS进行SDS-PAGE和Western印迹，来证实CatS的存在。组织蛋白酶S的抑制作用在杆状病毒中表达的人重组体组织蛋白酶S以在缓冲液中终浓度10nM来使用。缓冲液是50mM乙酸钠，pH6.5，2.5mMEDTA，2.5mMTCEP。酶与化合物或DMSO在37℃培养10分钟。底物7-氨基-4-甲基香豆素、CBZ-L-缬氨酰-L-缬氨酰-L-精氨酸酰胺(由MolecularProbes依定制合成)在水中稀释至20μM(最终浓度为5M)，加入以进行实验并再在37℃培养10分钟。化合物的活性通过与DMSO对照相比，在360nm激发和460nm发射的荧光减小来测定。上面所列例子用于评价上述实验中组织蛋白酶S的抑制作用。除吗啉-4-羧酸[(R)-1-(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-4，4-二甲基-己基]-酰胺外，所有化合物具有100nM或更低的IC50值。组织蛋白酶L的抑制除人组织蛋白酶L(AthensResearch，Georgia)代替组织蛋白酶S外，这种方案与上述测定组织蛋白酶S抑制作用的方案相同。上面所列例子用于评价上述试验中组织蛋白酶L的抑制作用。所有化合物具有约或大于1000nM的IC50值。除吗啉-4-羧酸[(R)-1-(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-4，4-二甲基-己基]-酰胺外，上面的例子表明，基于这些分子试验，组织蛋白酶S的选择性超过组织蛋白酶L的选择性的50至5000倍(以组织蛋白酶LIC50/组织蛋白酶SIC50计算)。权利要求1.式(I)或(II)的化合物，或其药学上可接受的盐其中X在每种情况下选自和R1选自氢或支链烷基或直链烷基，链中的每个碳原子任选被1-3个选自O、S和N-R2的杂原子所代替，其中R2是氢或烷基；以及其中R1任选进一步被一个或多个烷氧基、胺、卤素、碳环、杂芳基或杂环取代。2.根据权利要求1的化合物，其中在式(I)中X选自R1选自氢或支链的C1-10烷基或直链的C1-10烷基，链中的每个碳原子任选被1-3个选自O、S和N-R2的杂原子所代替，其中R2是氢或C1-5烷基；以及其中R1任选进一步被一个或多个C1-5烷氧基、胺、杂环或卤素取代。3.根据权利要求1或2的化合物，其中R1是C1-5烷基。4.根据权利要求1、2或3中任一项的化合物，其中R1是C1-3烷基，优选甲基。5.根据权利要求1或2的化合物，其中R1选自和6.根据权利要求1-5中任一项的化合物，其中式(I)的化合物是(S)对映异构体，其在下面所示的手性碳处具有天然氨基酸构型7.化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物选自和8.化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是其中所示的手性碳是具有天然氨基酸构型的(S)对映异构体。9.化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物选自和10.权利要求1-9定义的化合物在治疗疾病或病症中的用途，所述疾病或病症选自类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、吉-巴综合征、牛皮癣、格雷夫斯氏疾病、重症肌无力、硬皮病、肾小球肾炎、皮炎，包括接触性和特应性皮炎、胰岛素依赖性糖尿病、子宫内膜异位、哮喘、阿尔茨海默氏病和动脉粥样硬化。11.权利要求1-9定义的化合物的用途，用于制备适于治疗自身免疫性疾病或病症、与不适当自身免疫反应、T-细胞介导的免疫反应或由组织蛋白酶S介导的胞外蛋白水解有关的疾病的药物组合物。全文摘要本发明涉及式(I)和(II)的肽基化合物，作为组织蛋白酶S，一种半胱氨酸蛋白酶，抑制剂具有活性。所述的化合物是组织蛋白酶S的选择性可逆抑制剂，因此用于治疗自身免疫以及其它疾病。本发明还涉及这些化合物的制备方法以及包含它们的药物组合物。文档编号A61P37/00GK1761652SQ200480006887公开日2006年4月19日申请日期2004年3月3日优先权日2003年3月13日发明者尤金·R·希基,刘为民,孙三兴,扬西·D·沃德,埃里克·R·R·扬申请人:贝林格尔·英格海姆药物公司