白细胞库的制作方法
专利名称：白细胞库的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的白细胞单采形式(分离的白细胞单采)，实施分离的白细胞单采的方法和装置，由此产生的白细胞库(leukocyte cell bank)以及基于它们进行的各种形式的治疗。
背景技术：
细胞库细胞库行业是一种服务行业，它将活细胞保存起来以备后用。这一行业已有数十年历史，例如贮存牛的精子细胞以便对母牛进行人工受精。
随着生物医学研究和组织工程领域的技术进步，人们正在认识到，用人类干细胞进行多种替代疗法有多种可能性。这些进展导致越来越需要可以对个体的干细胞进行分离并冻存备用(自体应用)的便利方法。例如，越来越多的人意识到了对贮存新生儿脐血干细胞的需求，结果私有细胞库中这类干细胞保存物快速增多。
随着对细胞和组织的需求不断增加，细胞库行业逐渐意识到实际问题。目前已知，旨在提供长期细胞来源的细胞库很容易受随机事件的影响，导致一部分或全部保存物失去活性，而且细胞库越大，贮存时间越长，与这种随机事件有关的风险就越大。保存物的完整性也至关重要保存物的制备、保存、操作和使用方式有可能对细胞库的完整性起到关键的决定作用这一点，对于保存物的交叉污染可以引起疾病的传播或引起不当的或危险的生理后果(如，有可能是由于在自体移植时给予了异源细胞物质)的情况而言尤其重要。对较大的细胞库而言，信息存储、处理和保存物分类编目也是极其重要的。
这类问题使得许多国家出台越来越多的法律法规，来管理细胞库的生成、维持和应用目前在英国，细胞库行业由一个综合管理组织控制。
应急性自体移植(CAT)疗法最近有文献描述了一种疗法(见WO 00/29551和WO 01/88099)，其从健康供血者取出各种组织(包括白细胞)，将它们贮存在组织或细胞库中，将来某一天发生紧急事件需要进行自体移植时，可以用它们进行自体移植。这种疗法在本文中称为应急性自体移植(contingent autologous transplantation，CAT)疗法。
对于任何具体组织或细胞类型而言，仅仅有一部分健康人群可能需要CAT疗法。因此，CAT疗法有效与否，关键取决于是否能产生全面型细胞组织库，所述库中包括来自该群体中大多数人的保存物。
因此有观点认为，通过构建全面的组织库将有利于CAT疗法。但是，CAT疗法本身的性质决定了它对任何这类组织库有其独特而严格的要求。特别是，CAT疗法要求有大量的供血者参与(从而有大量保存物)、有相对较长的保存期、在长时间内良好维持组织的功能以及在最终治疗应用中有很好的适应性。
对白细胞库而言，这些问题尤其急迫，因为白细胞库所能提供的细胞的绝对数量比较少，最终治疗效力有可能关键取决于一小群细胞的功能，而由于不同的细胞以不同方式适应贮存，贮存的白细胞的活性有可能随着时间推移发生变化。迄今为止，尚无人构建出适合CAT的白细胞库。
通过白细胞单采分离可用于CAT疗法的白细胞白细胞单采(Leukapheresis)是一种特殊形式的采血术(apheresis)，涉及从获取的血液中选择性分离并取出白细胞，然后将血液的剩余部分回输给供血者。在白细胞单采过程中，使取出的血液流经细胞分离装置，这种装置在体外将有核白细胞与红细胞和血浆分离。红细胞和血浆被回输给供血者，这也是分离过程的一部分。该过程连续进行，不断地有血液被取出并几乎是同时在进行了各种提取之后返回到体内。因此，白细胞单采使得有可能将供血者的全部血液分多次取出并回输，在不伤害此人的情况下分离出并保存大量的白细胞。该技术因而依赖于能否建立一种静脉到静脉的体外血液循环，并从该循环的血液中提取白细胞。
白细胞单采一般都是自动的，用连续的或间断的流体离心或过滤技术进行，可参见“Leukapheresis and Granulocyte Transfusions”，由AmericanAssociation of Blood Banks，Washington DC(1975)出版。
实施离心式白细胞单采的装置在US 3489145和US 3655123中有所描述，实施过滤式白细胞单采的装置在US 3802432和US 3892236中有所描述。重力式白细胞单采(gravity leukapheresis)仅利用重力实施白细胞分离和收集，这种方法在US 4111199中有所描述。
目前可以商购的自动白细胞单采装置有多种不同类型，包括FenwalCS-3000(Baxter Healthcare，Chicago，IL)，Cobe 2997(Cobe BCT，Lakewood，CO)，Cobe Spectra，Cobe 2991，以及Haemonetics V50(Haemonetics Corp.，Braintree，MA)。这其中任一种都可以用于本发明，但优选Cobe系统(CobeBCT，Lakewood，CO，USA)，它能从流经其分离器的全血中提取到白细胞总数的40％-50％，并且其每分钟的流速可以达到40-60ml或更大。
近期有人提出，用白细胞单采创建CAT疗法所用的淋巴细胞库(见WO00/29551和WO 01/88099)。但用白细胞单采产生商业化的全面型淋巴细胞库受到供血者方便性和舒适性的限制。例如，供血者通常能够到访血液采集机构进行供血的时间是有限的。因此，供血者一旦到达采血机构，其真正在采血室所花的时间是一个重要因素。但是，白细胞单采一般需要2-4小时(比提供一个单位的血液所需的时间长数倍)。由此带来供血者舒适性的问题很多人在看到真实的采血过程时感到很害怕，并且在整个过程中供血者身上至少必须插入一个针头(通常是两个，用于引流和回输血液)，由此带来潜在危险。
因此，需要一种制备白细胞库的方法，它能避免在使用白细胞单采时所出现的问题，还能使供血者更方便(而且不适感较少)，从而有可能创建适用于CAT疗法的全面型白细胞库。
发明概述本发明是基于(至少部分基于)以下发现用常规方法从供血者采集的血样，经过可以商购的白细胞单采装置的处理，可以为白细胞建库提供方便的白细胞来源无需对供血者“连线”使用这些装置。
由这种“分离的白细胞单采”方法制备的白细胞制剂，可以直接用于在各种疾病的治疗中进行自体移植，或者在对白细胞进行各种处理后再用于所述自体移植。
因此，本发明第一方面提供了分离的白细胞单采，其中白细胞单采装置与提供血样的个体之间没有流体联通和/或剩余的血样并未回输至该个体。
白细胞单采装置优选是自动白细胞单采装置。尤其优选使用连续的或间断的流体离心式白细胞单采装置、或者连续的或间断的流体过滤式白细胞单采装置。
白细胞单采装置可以包含(a)分离装置(例如，离心转子或滤器)；(b)白细胞单采管道系统(tubing set)；以及(c)一或多个泵，所述泵用于将血样运输通过所述管道装置和将分离的白细胞运输至收集容器。
所述方法优选还包括以下步骤(a)使采集到的白细胞休眠(例如，通过深低温保存(cryogenicpreservation)使之休眠)；和，可选地(b)使休眠的白细胞复苏(例如，通过解冻和/或稀释使之复苏)。
如果使用深低温保存，为方便起见，该深低温保存包括冷冻至约-160℃或更低温度，这可以用液氮来实现。如果需要长时间保存和/或更好地保留功能，可以用液氦冷冻至约-269℃或更低温度。
广泛多种适当的深低温保存介质中，任何一种都可以用于本发明，优选包含适当的穿透性冷冻保护剂的介质。特别适合用作穿透性冷冻保护剂的是DMSO，它的使用浓度，比如说，可以最高达10％。
深低温保存介质还可以包含抗凝剂(如酸性柠檬酸葡萄糖，EDTA，肝素，或它们的混合物)、核酸酶(例如DNA酶和/或RNA酶)以及生理可接受的介质(例如，磷酸盐缓冲液)。深低温保存介质还可以包含蛋白质性质的组合物，如血清或血清成分和/或糖(sugar)和/或多糖(polysaccharide)(它们在采用潜水式冷冻(plunge freezing)的实施方案中是特别优选的)。
在本发明深低温保存介质中使用的特别优选的蛋白质性质的组合物包含血液白蛋白(例如，牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。尤其方便的是，使用从供血者血样中分离的人血清。它可以作为白细胞分离的副产物与白细胞一起分离。
本发明第二方面提供了用于从血样中选择性分离并取出白细胞的白细胞单采装置的用途，所述血样与提供该血样的个体的血液之间没有流体联通(即，是本文所述的分离的血样)。
本发明第三方面提供了制备用于自体移植的白细胞组合物的方法，包括以下步骤(a)提供来自供血者个体的分离的血样；和(b)用白细胞单采装置从该血样中选择性分离并收集白细胞。
本发明第四方面提供了制备用于恢复性自体移植(restorativeautotransplantation)的白细胞组合物的方法，包括以下步骤(a)提供来自供血者个体的分离的血样；(b)用白细胞单采装置从该血样中选择性分离并收集白细胞；(c)使收集到的白细胞休眠(例如，通过深低温保存(cryogenicpreservation)使之休眠)；和，可选地(d)使休眠的白细胞复苏(例如，通过解冻和/或稀释使之复苏)。
本发明第五方面提供了制备用于治疗性自体移植(remedialautotransplantation)的白细胞组合物的方法，包括以下步骤(a)提供来自供血者个体的分离的血样；(b)用白细胞单采装置从该血样中选择性分离并收集白细胞；(c)处理所收集到的白细胞；和，可选地(d)使经过处理的白细胞休眠(例如，通过深低温保存使之休眠)。
本发明第六方面提供了制备白细胞库的方法，包括以下步骤(a)提供来自供血者个体的分离的血样；(b)用白细胞单采装置从该血样中选择性分离并收集白细胞；和(c)使收集到的白细胞休眠(例如，通过深低温保存使之休眠)，并且将这些步骤重复应用于来自不同供血者个体的一系列血样，从而制备多份休眠(例如深低温保存)的白细胞组合物，所述方法还包括以下步骤(d)将休眠的白细胞以可以复苏的方式保存，以备日后自体移植。
本发明第七方面提供了用于从个体收集分离的血样的系统(例如，封闭系统)，所述系统包含样品容器和白细胞单采管道系统。
因此，本发明提供了用于从个体收集分离的血样的系统(例如，封闭系统或功能性封闭系统)，所述系统包含(a)采样装置(例如，包含针头)，以用于从所述个体收集血样；(b)样品容器，其与所述采样装置之间有流体联通；(c)白细胞单采管道系统，其与所述样品容器之间有流体联通；其中所述管道系统是盲端，不包含用于将经过分级分离的样品的任何一部分重新引回所述个体中的装置。
本发明第八方面提供了用于从来自个体的分离的血样中选择性分离并取出白细胞的装置，所述装置包含带有本发明收集系统的白细胞单采装置。
本发明还涉及可以通过本发明的方法获得(或已经获得)的白细胞组合物和白细胞库。
本发明还涉及本发明所述方法、系统、装置、组合物和细胞库的各种治疗用途。相应地，本发明涉及本发明所述白细胞组合物在治疗中的用途，例如在自体移植(例如恢复性或治疗性自体移植)中的用途。
发明详述
I.定义以下术语在本文中使用时，除了这些术语在本领域可能具有的任何更宽(或更窄)含义以外，除非有特别说明，都意图表示以下含义术语“白细胞单采”是本文使用的本领域术语，用于定义一种方法，其涉及从获自供血者的血液中选择性分离和取出白细胞、再将剩余的血液回输给所述供血者。
术语“白细胞单采装置”是本领域术语，用于定义任何能进行白细胞单采的装置，不管这种装置采用什么方式来分离和取出白细胞。
术语“分离的白细胞单采”用在本文中，是指对分离的血样实施白细胞单采的一种新形式。
类似地，术语“分离的采血术”用在本文中，是指对分离的血样实施采血术的一种新形式。
术语“分离的血样”用在本文中，是指与提供该血样的供血者的血液之间没有流体联通的血样。因此，对分离的血样进行分离的白细胞单采的过程中，白细胞单采装置与提供该血样的个体之间没有流体联通和/或剩余血样未被回输到该个体体内。
术语“自体移植”用在本文中，是指同基因移植或自我移植，其中术语“自体”用于表示，移植是向提供细胞物质(例如白细胞)的相同生物(即相同个体)进行的移植。“移植”是指任何涉及将细胞物质(例如白细胞)引入生物中的过程，因此该术语包括本领域已知的任何形式的移植。
术语“休眠”用在本文中，是指任何暂停活动的状态或静止状态，达到这种状态的方法是本领域已知的，下文中有描述。任何已知的方法，包括深低温保存，都可以使用。因此，白细胞可以维持在静息状态、无活性状态或非增殖状态。
术语“健康”在本文中与供血者个体一起使用，表示该个体不具有白细胞缺陷(按照本文的定义)。因此，术语“健康”在本文包括非疾病状态的供血者个体，且该供血者个体处在未患有任何疾病或失调、或未表现出所述疾病或失调的任何症状(即，为无症状或亚临床表现)的状态。尤其是，术语“健康”在本文中包括，未患有随后想要通过自体移植方法进行治疗的疾病、或未表现出所述疾病的症状的供血者个体。
II.血样本发明可以应用于任何形式的血样，只要(a)该血样是按照上述定义的分离的血样，且(b)该血样包含供血者个体的至少一部分白细胞。
可以在将血样应用于本发明的方法之前，在体外(ex vivo)对其进行各种处理。例如，通常在使用前将血样冷藏(chill)。其它处理可以包括添加保存剂和/或抗凝剂。
也可以在采血前或采血期间，将各种制剂施用于供血者个体，从而在采血前处理血样。
可以在体外和/或在体内应用的处理的实例详见下文中题为“白细胞处理”的章节。
一般优选从供血者个体采集至少450-500ml血，这相当于在英国输血服务中(UK blood transfusion service)一个供血者所提供的一个单位的血量。如有可能，在一段时间内(例如，2-3周内，优选2-3个月内或6个月内或一年内，2年内或3年内或更长时间内)多次采血(例如，多个450-500ml)。可以将这些血样中的一或多个分为或混合为多个白细胞库保存物。仅在英国，每年从供血者采集到超过3百万单位的血，从中取出一个单位的血用于同种异体移植是很平常的。
取出的血很快会被补充(replaced)，因此可以在一年内多次从一个供血者体中采集一单位的血，必要时，采集2-12个单位，且对被采血的个体无害。
III.选择供血者个体一般考虑恢复性自体移植是一种有可能最终适用于任何个体的疗法。因此，本发明可以有效用于制备包括尽可能多的不同个体的完整的白细胞库，以便在有需要时可以对任何指定个体进行恢复性自体移植。
基于上述原因，考虑将本发明尽可能广泛地应用，以便可以建立起完整的白细胞库。但由于每一份保存物的质量取决于(至少在一定程度上取决于)该供血者个体在献血当时的健康状态，故优选用于本发明方法中的血样是从健康供血者个体采集的。
还有其它因素也影响对供血者的选择例如，用于本发明方法中的血样最好是在供血者个体尚年幼时采集较有利，优选在青春期(adolescence)或成年早期(early adulthood)。对人而言，优选在约12-30岁采血(优选多次采血)，优选15-25岁。尤其优选在16或17岁以上时采血，例如，16-30岁，17-30岁，或18-30岁，或可以是18-35或40岁。因此，优选在宿主生物成熟，或接近成熟期(maturity)，但未明显进入老化(ageing)或衰老(senescence)过程之前获得其细胞。尤其是，优选宿主生物的免疫系统成熟或发育完全时较为有利。
但是，本发明也包括在上述年龄段以外的时间获得细胞，可以在刚出生后(post-natal)的任何时间获得细胞，例如从少年时期(juvenile)的宿主生物获得细胞，例如从儿童期的中晚期(mid-to late childhood)、或甚至从婴儿(infant)获得细胞，或从老年(older)的个体获得细胞。
从刚出生后或老年的宿主取样允许收集多份样品，从而增加了积存足够数量的细胞的机会。另外，从少年宿主或老年宿主取样可以越过道德要求(ethical requirements)，如需要告知并经同意才能取样的要求。
优选从青春期或成年宿主生物取样，因为所获取的细胞，尤其是从血液获取的细胞，将包含较大比例的有价值的成熟T细胞，它们能识别异常细胞群体，如癌细胞或被病毒感染的细胞。故而，当使用血样时，从具有成熟免疫系统的个体(即并非胎儿(foetal)或新生儿(neonatal))获取的血样较有利。
因此，本发明涉及从供血者个体收集的血样在将来可能发生或意外发生或仅仅是偶然发生的事件中的用途，所述血样是在供血者个体不存在可能罹患疾病的直接预示、暗示、或怀疑的时候获取的，所述将来事件不是已经预见到或已经怀疑或已经预示的疾病。因此，本发明一些实施方案中，所述供血者个体不对任何具体疾病易感，或者是没有患任何具体疾病的危险，例如不具有任何可预示随后疾病的症状或表现。类似地，宿主生物优选未遭受任何可能引起预知疾病的损伤。
事实上，对于一些应用而言(例如，为了随后进行恢复性自体移植而制备白细胞库)，优选本发明用到的血样是在供血者个体罹患任何疾病或出现相关症状之前从该个体获取的，更优选是在宿主生物处于总体上良好的健康水平、并优选没有任何形式的免疫受损(immunocompromise)时获取的。在这些实施方案中，在供血者个体没有事先出现疾病症状、或存在疾病、或已经被诊断为罹患疾病、而该疾病又是随后将要接受治疗的疾病时，也就是说在该宿主生物处在健康状态、而且不是“病后恢复”状态(例如，不处在从将要被治疗的白细胞缺陷部分地或完全地恢复的状态)时，从该个体获取血样特别有利。
易感的(Predisposed)供血者个体治疗手段不断进步，对疾病过程的理解也越来越深入，这有助于我们调整治疗方向，从而减轻疾病和痛苦。这样的理解由于分子生物学领域的技术进步而被大大推进。我们现在能在分子水平上跟踪疾病的发病机理，并且认识到，个体的基因构造在他们对某些疾病的易感性方面起重要作用。例如，我们已知，一些个体由于他们的基因组成的关系，很容易发生某些疾病。
对一些个体而言易感的疾病多数是白细胞缺陷，该术语在本文中表示需要施用自体白细胞的情况。这类情况因此包括个体已经罹患与白细胞功能失调有关的疾病、感染或生理失调，或者已经罹患需要增强或刺激内源白细胞活性的疾病、感染或生理失调。白细胞缺陷的具体实例可以参见下文中“实例说明(Exemplary indications)”章节。
目前通过基因检测，可以鉴定那些易感于白细胞缺陷(例如癌症、免疫功能失调或感染等各种形式中的任一种)的个体。
此外，我们对于机体免疫系统的认知，以及尤其是对于免疫系统识别并杀伤被病毒感染的细胞和肿瘤细胞的认知，在不断进步。我们现在已知，为了激发细胞介导的免疫，不良细胞(offending cell)(例如被病毒感染的细胞或肿瘤细胞)必须同时呈递HLA I类限制性肿瘤表位或病毒表位以及GM-CSF和/或TNF-α等危险信号，以便使免疫系统的抗原呈递细胞(APC)将B7和IL-12等协同刺激信号与抗原一起呈递给与之相互作用的细胞毒T-淋巴细胞(CTL)群。这种同时呈递导致产生活化细胞克隆和记忆细胞克隆(综述可参见Nature Medicine Vaccine Supplement 4(1998)525)。在缺乏这些额外的信号的情况下，识别不良细胞的HLA-I类抗原-限制性T-细胞经过加工后被破环或脱敏(机体的一种可能用于避免发生诸如自身免疫病等生理失调的过程)。这类耐受的诱导是由于不识别(ignorance)、无反应性(anergy)或生理性缺失(physical deletion)(Cold Spring Harbour Symp Quant Biol 2(1989)807；Nature 342(1989)564；Cell 65(1991)305；Nature Med 4(1998)525)。
目前已清楚，肿瘤细胞并不自动地同时呈递危险信号和/或协同刺激信号。故而，肿瘤的大量繁殖(spawning)可能导致根除那些提供细胞介导的抗肿瘤免疫力的T细胞克隆。因此，表现出癌症、白血病/淋巴瘤或肉瘤等的病人，可能已经通过这个机理失去了他们先天的消灭肿瘤的能力。
但是，如果在病人发生扩散性疾病之前将所需的T淋巴细胞或其样品取出，那么在发病时可以将相关的T细胞群返回给该病人，在经过必须的T细胞协同刺激后，来缓解疾病。协同刺激可以在将细胞返回给病人的同时进行，也可以在通过对病人实施其它治疗而将细胞返回给病人之后进行，或者除了该病人天然产生的刺激以外不再有其它刺激。细胞的活化/刺激也可以是在回输给病人之前在体外诱导。
本发明因此特别适用在易感于白细胞缺陷生长的病例中。它因此代表了一种从健康供血者个体取出白细胞，以便在该个体后来有需要时，通过自体(自基因)移植方法移植给该个体的一种方法(means)。尽管该易感个体有可能因为从来没有出现需要用这种方法进行治疗的疾病而从来没有接受这些细胞，本发明也可以用于提供一种保险形式，为该个体防范白细胞缺乏症的高风险提供保障。
类似地，没有诊断出易感性的个体也可以选择，在他们出国旅行之前，抽取样品，放入本发明的白细胞库，以备后用。这类应用可以包括境外感染的治疗。
除此之外，众所周知，老化过程使个体更易患疾病。这种易感性的根本原因似乎在于老化过程中的T细胞和B细胞的数目/活性显著降低，致使免疫功能丧失(Mech Ageing & Dev 91(1996)219；Science 273(1996)70；Mech Ageing & Dev 96(1997)1)。疾病易感性尤其可见于老年病人在医院内接受诸如外科手术时，在这里，他们很容易发生机会感染，导致严重或者甚至是致命的后果。在这类个体较年轻的时候取血样，按照本发明的方法处理，放入白细胞库中，就可以在上述情况中提供恢复性自体移植的机会。
这种方法可以更广泛地用于在手术后增强病人的免疫系统，从而减少机会感染引起术后并发症的可能性。因此，本发明可以作为预防性治疗，例如，用于当老年病人更易感于疾病之时。
IV.白细胞本发明涉及用分离的白细胞单采术从血样中分离并收集白细胞。可以理解，在白细胞单采过程中并不需要把血样中所有的白细胞都分离和/或取出来。在很多情况下，仅仅取出和/或分离出血样中白细胞总数的一部分就足以。本领域技术人员很容易确定需要取出的白细胞的合适量，它基于所分离出的白细胞的用途、样品量、供血者状态、白细胞的特征以及所采用的具体白细胞单采装置等因素而有不同。
本发明方法中收集到的白细胞在一定程度上是从原始血样中分离得到的。术语“分离的”在本文中用于表示，所分离的白细胞处在不同于它们在人体内环境的一种物理环境，该术语并不表示任何具体的纯度。事实上，纯度绝对值并非关键，本领域技术人员很容易基于白细胞的用途来确定合适的纯度。
本发明方法中对白细胞的分离和收集也并不必然表示，优先分离和收集任何具体类型的白细胞。本发明的白细胞包括任何白细胞，诸如粒细胞，淋巴细胞和单核细胞等。
粒细胞包括髓细胞(myelocyte)，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。淋巴细胞包括B淋巴细胞，T淋巴细胞和自然杀伤细胞。单核细胞包括单核巨噬细胞和其它巨噬细胞。
但在一些实施方案中，所分离并收集的白细胞优选包含一种或多种特定类型的白细胞。优选的细胞类型是淋巴细胞，尤其是T-淋巴细胞(T-细胞)。特别要优选成熟的T-淋巴细胞。
由于每升人血液中成熟T细胞总数为1-2.5×109，因此100ml血样中通常包含1-2.5×108成熟T细胞，一般这就足以提供能代表整个成熟人T细胞群体中产生有益效果所需的量。但是，根据用白细胞单采装置所分离并收集到的白细胞总数的级分，以及所采用的任何复苏技术的效力，优选使用至少100ml，115ml，200ml或300ml血样，更优选超过400或500ml的血样，以便在个体发生疾病时，能获得足够数量的成熟T细胞，在返回该个体后产生有益的治疗效果。
本领域已知有多种标准技术可以从包含混合淋巴细胞群的样品中选出具体的淋巴细胞亚群。这类亚群的实例包括，CD3+，CD8+，CD4+和CD16/56+(自然杀伤)T细胞以及CD19+B细胞。例如，这类T细胞亚群中任何一群或任何混合或任何组合都可以用于本发明的方法、用途和组合物中，它们可以通过多种已知方法很容易地获得，所述方法如FACS(荧光活化细胞分选(Fluorescence Activated Cell Sorting))和血细胞计数系统(haemocytometrysystems)。
本发明还发现了更广泛的应用，并且除了白细胞单采术以外，也可以采用任何其它形式的分离式采血术。因此，本发明涉及用于制备干细胞组合物(并因此产生干细胞库)的分离式采血方法。本发明因此还可以应用于干细胞或始祖细胞(progenitor cell)，包括多能干细胞和已经进入具体分化途径的干细胞或始祖细胞。
V.白细胞处理可以对白细胞进行各种处理。这类处理导致，例如扩增(expansion)一部分或所有代表性细胞亚群，提高白细胞在休眠阶段的长期活力，增强它们的治疗潜力，弥补部分或所有白细胞的缺乏或缺陷(例如，象在治疗性自体移植治疗模式中那样)和/或使它们在随后用于自体移植时更为安全。
所述处理可以在白细胞休眠之前或之后(以及进行自体移植之前或之后)进行。此外，可以在取样之后进行处理(即体外进行)，在使细胞休眠之前或复苏之后都可以处理。例如，对白细胞的处理可以是，在自体移植过程中，将一种另外的组合物与白细胞组合物依次(sequentially)或同时施用。对白细胞的处理可以在即将开始自体移植前进行。
或者(或另外)，可以在取血之前，通过施用生长因子或细胞因子等，对仍然在体内的白细胞进行处理(见下文)。
移植前处理的实例包括各种遗传修饰，如掺入阴性选择标记(例如，参见W096/14401，其引入本文作为参考)。这类处理使得有可能进行移植后的白细胞清除(ablation)或滴定剂量反应曲线。其它遗传干预可以包括，调节或修饰一或多个基因的表达(例如，增加或减少基因表达)，使一或多个基因失活，基因置换和/或使一或多个异源基因表达)。其它遗传修饰包括，定向引导(targeting)具体的T-细胞(见W096/15238，其引入本文作为参考)，以及用抗体修饰T-细胞受体所有组成部分(receptor repertoire)/表达，从而产生T-细胞嵌合体。
本发明的其它处理包括，将白细胞暴露于一或多种刺激分子，例如抗原(如癌症抗原或病毒抗原)、抗体、T细胞识别表位、肽、血液因子、激素、生长因子或细胞因子或其组合。
例如，白细胞可以在体外(或于取血之前在体内)用以下物质进行处理抗原(例如，前列腺特异性抗原1或前列腺特异性抗原2、her-2/new、MAGE-1、p53、Ha-ras和c-myc等癌症抗原，或病毒抗原)、抗体、T细胞识别表位、肽、血液因子、激素、生长因子或细胞因子或其组合。刺激分子可以是合成的分子、重组分子，或者可以是从人体或动物体纯化或分离的分子。这方面特别有用的刺激分子选自IFN-alpha，IFN-beta，IFN-gamma，II-1a，II-1b，II-2，II-3，II-4，II-5，II-6，II-7，II-8，II-9，II-10，II-11，II-12，II-13，II-14，II-15，GM-CSF，M-CSF，G-CSF，LT或上述两种或更多种的组合。这样的处理可以改变白细胞的生长和/或活性和/或分化状态，和/或可以用于区分或选择性分离或富集所需的白细胞类型或清除不想要的细胞。
最近有一些进展使得可以获得用于随后自体移植的细胞。例如，对造血调节因子的研究导致分离出一系列能影响淋巴细胞增殖和分化的因子。这些因子包括，细胞因子(如白细胞介素系列IL-1到IL-18，白三烯，肿瘤特异性抗原如前列腺特异性抗原1或前列腺特异性抗原2、her-2/new、MAGE-1、p53、Ha-ras和c-myc)，生长因子如TNF、TGF、FGF、EGF、GM-CSF、G-CSF，及其它。这其中有多种因子目前可以购买到临床使用的商品，有一些已经显示能大大增加外周血淋巴细胞，尤其是未成熟的T淋巴细胞的数量。将它们在取血前施用于供血者个体，可以控制质量和/或数量(指白细胞亚型的存在数量和特性而言)，并且有可能无需骨髓取样，直接从供血者个体外周血收获大量的所需细胞，如未成熟的T淋巴细胞。
移植前的其它处理包括培养白细胞(或其亚群)。例如，可以培养白细胞使得细胞数增加。例如，可以用本领域已知的方法使细胞传代。这类培养可以在白细胞休眠之前和/或之后进行。
因此，在白细胞包括T细胞的情况下，可以在移植前对T细胞进行协同刺激和/或在自体移植之前使T细胞暴露于肿瘤抗原(任选与协同刺激因子一起)。
VI.白细胞装置目前市面上可以购买到多种不同类型的白细胞单采装置。这类装置通常至少包含三个单独的组件(1)分离装置(例如包含膜或离心转子，它们提供力量使白细胞与血液中其它各种成分分开；(2)一或多个泵，用于将血样运输到上述分离装置，用于取出分离的白细胞以及用于维持灌输(transfusion)和再灌输(retransfusion)所必须的力量，和(3)管道系统(通常是一次性的)，它将血液及其各种级分以特定的几何位置保持在分离装置内，它限定出固定的血液流通通道(常常是从供血者，通过白细胞单采装置又回到该供血者的一个回路)以及用于收集分离的白细胞和/或其它血液级分或流体的容器(一般是袋子)。
广泛多种市售白细胞单采装置中的任一种都可以用于本发明中。白细胞单采装置的具体操作方式取决于多种因素，包括分离装置(例如，离心机，滤器等)的特点、所需的白细胞样品类型、需要处理的血样体积、供血者个体的特征和状态、白细胞组合物的最终用途、以及在进行本发明的处理之前施加于血样的任何处理的特性。因此，本领域技术人员能很容易地确定合适的操作参数。
但是优选地，选择对操作者介入和/或培训的需要最少的白细胞单采装置。对多种市售白细胞单采系统而言，操作者进行准备和操作所需的时间和/或专业技能各不相同。例如，减少操作者装卸管道系统所需的时间、以及降低这些操作的复杂程度，可以提高生产力和/或减少操作者失误的可能性。而且，减少系统对操作者的依赖程度，则可以减少操作失误和/或减少对这些系统的操作者所期望的/必需的资格。
性能-相关因素也是有关联的，可以用白细胞单采系统的“收集效力”来评判。一个系统的“收集效力”当然可以用多种方式来衡量，诸如用所收集到的白细胞部分相对于样品中自细胞总数的大小来衡量。性能也可以基于白细胞单采方法对各种类型血液成分的影响来评价。例如，一般希望减少采血法对至少白细胞的负面影响。可能还希望减弱血小板活化作用，以避免处理过程中样品质量的下降。
特别优选的是Cobe系统(Cobe BCT，Lakewood，CO，USA)。
VII.本发明中用到的收集系统本发明用到的从个体收集分离的血样的系统可以包含样品容器(用于收集和容纳血样)以及白细胞单采管道系统。
术语“白细胞单采管道系统”在本文中用于定义在先章节中描述的管道系统。这种管道系统可以包含血液处理容器，在该容器中，白细胞受到分离装置中的分离力(separation forces)的作用。
在与包含离心型分离装置的白细胞单采装置(见在先章节)一起使用的管道系统中，血液处理容器可以包含离心环(centrifuge loop)，当装备在分离装置的离心转子中时，该离心环限定了使血液受到离心分离力作用的容器空间。
本发明使用的系统可以是封闭系统，功能性封闭系统，或开放系统。
本文中术语“封闭系统”，当应用于白细胞单采管道系统时，是指一种无菌且通过无菌屏障与外界环境隔离的管道系统，在其内部所有组件都充分集成(integral)、相互连接(attached)和/或在生产地点装配好的(assembled atthe manufacturing site)。
本文中术语“功能性封闭系统”，当应用于白细胞单采管道系统时，是指一种在装置生产地点装配好的管道系统，它利用无菌屏障滤器(如0.22微米滤器)由最终用户将其与无菌连接装置进行连接。
本文中术语“开放系统”，当应用于白细胞单采管道系统时，是指仅有一部分在装置生产地点装配、然后由最终用户按照自己需要完成装配的管道系统。
优选地，所述系统还包含一或多个(例如3个)白细胞收集容器。优选3个或更多个收集容器，以便有足够的样品以供取舍并且也有利于用一式双份/一式三份的样品创建细胞库。这允许更灵活的自体移植方案。
所述系统还可以方便地包含能容纳获取白细胞后剩余的血液的容器。这剩余的血液可能在其它治疗方案中有用，例如在异源(allogenous)方案中有用。所述系统还可以包含针头或插管(cannula)，用于将血样从个体导入样品容器。
各种容器都可以方便地采用柔性(flexible)透明袋形式。部分(或全部)管道也可以方便地采用柔性透明材料(例如，塑料)。
VIII.休眠的诱导任何合适的手段都可以用于诱导休眠。
根据一种优选的深低温保存方法，细胞优选在-160℃以下冻存。一种特别优选的休眠手段是，将细胞冻存到氦(He)的沸点，即约-269℃或更低。
根据Freshney的观点(Freshney′s Tissue Culture of Animal Cells(Cultureof Animal CellsA Manual of Basic Technique，Wiley Liss，1994))，可以将细胞悬浮在合适的培养基(例如，包含最高浓度达10％的DMSO)中，以受控制的速率冷却(例如，每分钟1℃，直到-70℃，然后放入液/气N2)。这种方便的法可以适用于将细胞冷却在He/N2混合体或He中。其它实现和/或维持细胞休眠的方法包括冷却到4℃。
IX.复苏休眠之后，在用于移植之前将细胞复苏。同样地，这可以通过本领域已知的任何方便的方式，以及任何使细胞复苏或复活的方法来实现。
方便地讲，这可以通过，例如，将细胞解冻和/或稀释来实现。复苏技术是本领域已知的。细胞解冻可以如下操作将容纳细胞的容器在37℃水浴中温和振荡，然后用诸如培养基或血清将DMSO稀释到1％更低浓度。
细胞可以立刻植入或经过在培养基中恢复的阶段后植入。复苏过程是为重新建立使细胞在诸如预防或治愈性治疗中的用途来设计的。
X.细胞建库本发明的白细胞组合物可以建库，从而产生白细胞库。优选地，所述组合物在使白细胞休眠(如上述)后建库。
任何合适的细胞建库系统都可以采用，只要其中的保存物可以复苏用于自体移植。这意味着使用一些标记形式，但这并不必须是用每份保存物的物理附加物(physical appendage)的形式。
因此，本发明的白细胞库可以包含多组细胞贮存单元以便贮存白细胞组合物。通常，这样的细胞贮存是通过深低温保存法来进行的，但也可以采用其它保存技术。本发明的细胞库还可以包括数字信息单元，用于存储与供血者个体的身份(identity)、所在地(location)和医疗史有关的数字信息，和/或与一份具体的保存物有关的情况(例如，从供血者个体采集血样的日期，对该保存物中所含白细胞进行任何处理的处理条件和细节)。
数字信息单元优选包含至少一个数字计算机，它具有足够的数字存储能力，可以存储可能的与每一份保存物有关的大量信息。
本发明的白细胞库优选还包含数字数据检索(digital data retrieval)装置(arrangement)，它与数字信息单元相接(interfaced with)，可以检索存储在数字信息单元中的指定信息。这种数据检索装置可以整合在数字计算机中。还可以提供通过电话或互联网进行的数字信息远程访问，并且可以在全球范围内快速且方便地访问这些信息。
XI.医学应用本发明可适用在所有希望施用(经处理或未经处理的)自体白细胞的治疗和预防形式中(即，预期有治疗前景)。
为了本发明的目的，在这些适用情况中，认为出现了白细胞缺陷。
因此，可以理解，本发明医疗应用中的白细胞缺陷(leukocyte deficiency)涵盖多种疾病(disease)、综合征(syndrome)、失调(disorder)、生理失调(condition)和感染。例如，可以理解，当个体罹患与白细胞功能失调有关的疾病、综合征、失调、生理失调或感染时，以及当个体罹患内源白细胞成分表面看似乎正常、但正常的内源白细胞活性希望/需要改变、增大、或获得刺激的那些疾病、综合征、失调、生理失调或感染时，可以发生如上述特别广义的白细胞缺陷。具体地说，本文所述白细胞缺陷可以视为T细胞和/或B细胞非特异性损失的结果，或者视为具体的T细胞克隆群和/或B细胞克隆群损失或缺陷的结果。
为方便起见，这些疾病、综合征、失调、生理失调或感染在本文中统称白细胞缺陷。
适用本发明的治疗可以分为两大类。一类是利用本发明的方法从健康个体供血者的血样创建白细胞组合物(即形成白细胞库的一部分)。在这种应用中，本发明被用于创建源自个体供血者的健康白细胞组织的细胞来源，只要该个体在以后发生白细胞缺陷时，可以将细胞返回该供血者个体。
在这种疗法(本文称恢复性自体移植)中，本发明利用了以下事实多种白细胞缺陷的发生是一系列暂时性事件(它们彼此有或没有因果关系)的一部分，故而在发生白细胞缺陷之前的一个时间点创建白细胞库，就构成了后来可以进行恢复性治疗的一个治疗源。
第二大类是利用本发明的方法从罹患白细胞缺陷的个体供血者的血样创建白细胞组合物。然后在体外对白细胞组合物进行处理，将处理过的组合物再移植到该个体体内。对白细胞组合物进行的处理使这些白细胞组合物返回供血者体内后，可以缓解或消除白细胞缺陷。该方法的一个变换方法涉及在采血步骤之前在体内处理个体的白细胞，这些方法可以涉及在采血步骤之后在体外的进一步处理。
在这些治疗(本文中称治疗性自体移植)中，本发明利用了以下事实多种白细胞缺陷可以通过对个体白细胞总群体中一小部分进行处理而克服。这类处理将在下文中详述，包括基因修改，细胞扩增(cellular expansion)，选择性消除具体细胞类型和用具体分子(如细胞因子)进行刺激。
上述恢复性自体移植的概念可以应用于所有个体，不管是否健康，也不管有没有可被疑为白细胞缺陷指标的因素(例如年龄、医疗史、遗传背景和生活方式)。但是，它确实允许鉴别一类特别适于应用本发明方法的具体群体，详见第III节(题为“选择供血者个体”)。而且，由于如上述定义并可以用本发明恢复性或治疗性自体移植进行治疗的白细胞缺陷包括广泛多种已知疾病，因此，它们将在下面的第XII节(题为“实例说明”)中更详细描述。
XII.实例说明(Exemplary indications)如前文中所述，本发明的治疗性应用和预防性应用涉及广泛多种疾病、综合征、失调、生理失调和感染。
感染本发明可以用于治疗各种感染。在这种情况中，内源性白细胞活性可以是正常的(或具有正常反应)，但是仍希望改变、增大或刺激它。在其它情况(如HIV感染)中，内源性白细胞活性因感染直接导致功能失调。
可以根据本发明进行治疗或预防的感染包括，细菌性感染，真菌性感染或病毒性感染，或者由任何其它生物，例如原生动物，线虫、昆虫或其它寄生虫引起的感染。
优选的应用是治疗由HIV感染导致的AIDS。在这种情况中，可以在个体健康或未受感染的时候收集其CD4+细胞并贮存，当该个体出现HIV感染或者当AIDS发病或CD4+细胞计数降低时，将贮存的细胞移植到该个体中。这种方法对于那些生活方式使之面临HIV感染风险的个体具有吸引力。
癌症、白血病和肉瘤本发明还可以用于治疗和预防各种恶性病(malignancies)通常是指，任何恶性或恶性前兆(pre-malignant)，扩散或过度扩散(hyper-proliferative)生理失调或者任何由于机体细胞或组织中的功能失调(disturbance)或异常或者其它失调或异常所引起的疾病或与它们有关的疾病。
治疗或预防各种形式的癌症是本发明优选的实施方案，其包括治疗或预防机体的任何癌性细胞或组织。
因此，本发明不限于任一种扩散性疾病(例如，白血病、淋巴瘤、癌(carcinomas)或肉瘤)，也不限于具体的癌基因或肿瘤抑制基因表位如前列腺特异性抗原1或前列腺特异性抗原2，her-2/new，ras，myc，myb，fos，fas，视网膜母细胞瘤，p53等，或以HLAI类抗原限制性方式或其它类似方式呈递、从而能被白细胞识别的其它肿瘤细胞标志表位。所有癌症，如白血病，淋巴瘤，乳腺癌，胃癌，结肠癌，直肠癌，肺癌，肝癌，子宫癌，睾丸癌，卵巢癌，前列腺癌和脑肿瘤如神经胶质瘤、星形细胞瘤和神经母细胞瘤，肉瘤如横纹肌肉瘤和纤维肉瘤，都可以用本发明进行治疗或预防。
因此，本发明可以用于治疗或预防乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌。本发明还可以用于治疗或预防血液系统和淋巴系统的癌症(包括何杰金氏病(Hodgkin′s Disease)、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrm氏病)，皮肤癌症(包括恶性黑素瘤)，消化道癌症(包括头颈部癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、肛门癌)，泌尿生殖道癌症(包括肾癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌)，女性的癌症(包括乳腺癌、卵巢癌、妇科癌症和绒膜癌)以及脑、骨中的类癌，鼻咽癌，腹膜后腔(retroperitoneal)肿瘤，甲状腺肿瘤，和软组织肿瘤。本发明还可以用于治疗或预防未知的原发部位的癌症。
XIII.剂量学(Posology)本领域技术人员很容易确定本发明医学应用中进行自体移植的白细胞组合物用量。要注意，只要0.01×108(例如，1-10×108)成熟淋巴细胞(可以从单一一份约100ml的正常人血液样品中获得)就足以增强(boost)受试者的免疫系统，并因此具有本发明自体移植方法的有益效果。要注意，仅在英国，每年从供血者采集到超过3百万单位的血，从中取出一个单位的血用于同种异体移植是很平常的。
所施用的白细胞组合物可以来自单一一份血样，或者可以是将同一供血者个体在不同时间点采集的多份不同血样混合而成的白细胞组合物混合群(pool)。所施用的白细胞组合物可以是保存物的全部或一部分，优选是其一部分，以便可以多次(multiple dosing)施用，也可以选择在将剩余的细胞进行扩增后再施用(例如，T细胞数可以用标准方法体外扩增)。
在基于T细胞活性的应用中，成熟T细胞用量是至少0.01×108，更优选至少0.1×108，更优选至少1×108(如至少1-10×108)。优选的范围是0.01×108-1010成熟T淋巴细胞，如0.1×108-1010，1×108-1010或1×109-1010成熟T淋巴细胞。
因此，自体移植所需的成熟T细胞样品是至少0.01×108，通常在108-1010CD3+成熟T细胞的范围，优选2×108-1010，更优选3×108-1010CD3+，还更优选4-5×108-1010CD3+成熟T细胞。
方便地，每份用于自体移植的样品包含3×108CD3+成熟T细胞，更优选5×108，还更优选1×109CD3+成熟T细胞。当个体能提供充足的血液来源时，还更优选使用4-5×109CD3+成熟T细胞或1010CD3+成熟T细胞。
优选地，自体移植所需CD3+和CD8+成熟T细胞亚群的样品是至少0.01×108，通常在0.25×108-0.25×1010的范围，更优选0.5×108-0.25×1010，还更优选0.75×108-0.25×1010，还更优选0.75×108-0.25×1010或1.00-1.25×108-0.25×1010。方便地，用于移植的每份样品中CD3+和CD8+的细胞数是0.2×108的水平，优选0.4×108，或更优选1×108，或还更优选2×108，或更优选3×108，或更优选5×108。当个体能提供充足的血液来源时，可以使用1×109，优选2×109，4×109，或更优选1×1010CD3+和CD8+细胞。
优选地，自体移植所需CD3+和CD4+成熟T细胞亚群的样品是至少0.01×108，通常在0.1×108-0.5×1010的范围，更优选0.65×108-0.5×1010，还更优选0.85×108-0.5×1010，还更优选1×108-0.5×1010或1.8-3.6×108-0.5×1010。方便地，用于移植的每份样品中CD3+和CD4+的细胞数是0.2×1010的水平，优选0.3×108，或更优选0.4×108，0.5×108，1×108，2×108，3×108，4×108，或更优选5×108。当个体能提供充足的血液来源时，可以使用1×109，或更优选2×109，或更优选1×1010CD3+和CD4+细胞。
优选地，自体移植所需CD3+和CD16/56+成熟T细胞自然杀伤细胞亚群的样品是至少0.01×108，通常在0.01×108-0.5×1010的范围，优选0.02×108-0.5×1010，更优选0.03×108-0.5×1010，还更优选0.5×108-0.5×1010或0.5-2×108-0.5×1010。方便地，用于移植的每份样品中CD3+和CD16/56+的细胞数是0.01×108，0.2×108，0.3×108，0.5×108，1×108，2×108，3×108，5×108的水平，或更优选，当个体能提供充足的血液来源时，可以使用1×109，或更优选2×109，或更优选1×1010CD3+和CD16/56+细胞。
此外，成熟淋巴细胞样品优选包括B细胞，如CD19+B淋巴细胞。包括在T细胞样品中的成熟B细胞样品可以是至少107，108或109，通常在107-1010成熟B细胞的水平，优选2×107-1010成熟B细胞，更优选3×107-1010成熟B细胞，还更优选4-5×107-1010成熟B细胞。
方便地，自体移植物中B细胞的具体数目在3×107的水平，优选5×108，更优选1×109成熟B细胞，还更优选4-5×109或1010成熟B细胞。
此外，淋巴细胞样品可以优选包括树突细胞。树突细胞样品可以是至少107，108或109的数量，通常在107-1010树突细胞的范围，优选2×107-1010细胞，更优选3×107-1010细胞，还更优选4-5×107-1010细胞。
自体移植物中树突细胞的具体数目在3×107的水平，优选5×108，更优选1×108，还更优选4-5×109或1010成熟B细胞。
XIV.等效方案上文中详细描述了本发明的优选实施方案，它们因此被视为对本发明各个方面的举例说明而非限制。本领域技术人员了解或者可以认识到，利用常规实验，可以获得本文所述具体实施方案的多种等效方案(equivalent)，改良方案(modification)或变化方案(variation)。这些等效方案，改良方案或变化方案都包括在权利要求所述的发明范围内。
权利要求
1.制备用于自体移植的白细胞组合物的方法，包括以下步骤(a)提供来自供血者个体的分离的血样；(b)用白细胞单采装置从该血样中选择性分离并收集白细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述白细胞单采装置是自动白细胞单采装置。
3.权利要求1或2的方法，其中所述白细胞单采装置包含封闭系统或功能性封闭系统。
4.权利要求2或3的方法，其中所述白细胞单采装置是连续的或间断的流体离心式白细胞单采装置，或者是连续的或间断的流体过滤式白细胞单采装置。
5.在先任一权利要求的方法，其中所述自细胞单采装置包含(a)分离装置(例如，离心转子或滤器)；(b)白细胞单采管道装置；以及(c)一或多个泵，所述泵用于将样品运输通过所述管道装置和将分离的白细胞运输至采集容器。
6.在先任一权利要求的方法，所述方法用于制备恢复性自体移植所用的白细胞组合物，该方法还包括以下步骤(c)使收集到的白细胞休眠(例如，通过深低温保存使之休眠)；和，可选地(d)使休眠的白细胞复苏(例如，通过解冻和/或稀释使之复苏)。
7.权利要求1-5中之任一方法，所述方法用于制备治疗性自体移植所用的白细胞组合物，该方法还包括以下步骤(c)处理所收集到的白细胞；和，可选地(d)使经过处理的白细胞休眠(例如，通过深低温保存使之休眠)。
8.权利要求7的方法，还包括以下步骤(e)使经过处理且已休眠的白细胞复苏(例如，通过解冻和/或稀释使之复苏)。
9.权利要求6的方法，所述方法用于制备白细胞库，其中将所述方法重复应用于来自不同供血者个体的一系列血样，从而制备多份休眠(例如深低温保存)的白细胞组合物，所述方法还包括，将休眠的白细胞以可以复苏的方式保存、以备日后自体移植的步骤。
10.一种用于从个体收集分离的血样的系统(例如，封闭系统或功能性封闭系统)，所述系统包含(a)采样装置(例如，包含针头)，以用于从所述个体收集血样；(b)样品容器，其与所述采样装置之间有流体联通；(c)白细胞单采管道系统，其与所述样品容器之间有流体联通，其中所述管道系统是盲端，它不包含用于将经过分级分离的样品的任何一部分引回所述个体中的装置。
11.权利要求10的系统，其中所述管道系统包含一或多个(例如3个)白细胞收集容器。
12.权利要求10或11的系统，其中所述管道系统还包含血液处理容器(例如，离心环)。
13.权利要求6-8中之任一系统，其中所述管道系统还包含用于容纳获取白细胞以后剩余的血液的容器。
14.权利要求10-13中之任一系统，还包含用于将来自个体的血样导入样品容器的针。
15.用于从来自个体的分离的血样中选择性分离和取出白细胞的装置，所述装置包含带有权利要求10-14中之任一收集系统的白细胞单采装置。
16.权利要求15的装置，其中所述白细胞单采装置是权利要求2-5中之任一所述的装置。
17.白细胞组合物，其可以(或已经)用权利要求1-9中之任一方法获得。
18.白细胞库，其可以(或已经)用权利要求9的方法获得。
19.权利要求17的白细胞组合物，是在治疗或预防中应用的白细胞组合物。
20.权利要求17的白细胞组合物在制备用于自体移植(例如，CAT疗法，或者恢复性或治疗性自体移植)的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及新的白细胞单采形式(分离的白细胞单采)，实施分离的白细胞单采的方法和装置，由此产生的白细胞库以及基于它们进行的各种形式的治疗。
文档编号A61B5/155GK1761475SQ200480007085
公开日2006年4月19日 申请日期2004年6月17日 优先权日2003年6月21日
发明者威廉·A·施皮尔斯 申请人:英国生命力集团公司
技术领域：
本发明涉及新的白细胞单采形式(分离的白细胞单采)，实施分离的白细胞单采的方法和装置，由此产生的白细胞库(leukocyte cell bank)以及基于它们进行的各种形式的治疗。
背景技术：
细胞库细胞库行业是一种服务行业，它将活细胞保存起来以备后用。这一行业已有数十年历史，例如贮存牛的精子细胞以便对母牛进行人工受精。
随着生物医学研究和组织工程领域的技术进步，人们正在认识到，用人类干细胞进行多种替代疗法有多种可能性。这些进展导致越来越需要可以对个体的干细胞进行分离并冻存备用(自体应用)的便利方法。例如，越来越多的人意识到了对贮存新生儿脐血干细胞的需求，结果私有细胞库中这类干细胞保存物快速增多。
随着对细胞和组织的需求不断增加，细胞库行业逐渐意识到实际问题。目前已知，旨在提供长期细胞来源的细胞库很容易受随机事件的影响，导致一部分或全部保存物失去活性，而且细胞库越大，贮存时间越长，与这种随机事件有关的风险就越大。保存物的完整性也至关重要保存物的制备、保存、操作和使用方式有可能对细胞库的完整性起到关键的决定作用这一点，对于保存物的交叉污染可以引起疾病的传播或引起不当的或危险的生理后果(如，有可能是由于在自体移植时给予了异源细胞物质)的情况而言尤其重要。对较大的细胞库而言，信息存储、处理和保存物分类编目也是极其重要的。
这类问题使得许多国家出台越来越多的法律法规，来管理细胞库的生成、维持和应用目前在英国，细胞库行业由一个综合管理组织控制。
应急性自体移植(CAT)疗法最近有文献描述了一种疗法(见WO 00/29551和WO 01/88099)，其从健康供血者取出各种组织(包括白细胞)，将它们贮存在组织或细胞库中，将来某一天发生紧急事件需要进行自体移植时，可以用它们进行自体移植。这种疗法在本文中称为应急性自体移植(contingent autologous transplantation，CAT)疗法。
对于任何具体组织或细胞类型而言，仅仅有一部分健康人群可能需要CAT疗法。因此，CAT疗法有效与否，关键取决于是否能产生全面型细胞组织库，所述库中包括来自该群体中大多数人的保存物。
因此有观点认为，通过构建全面的组织库将有利于CAT疗法。但是，CAT疗法本身的性质决定了它对任何这类组织库有其独特而严格的要求。特别是，CAT疗法要求有大量的供血者参与(从而有大量保存物)、有相对较长的保存期、在长时间内良好维持组织的功能以及在最终治疗应用中有很好的适应性。
对白细胞库而言，这些问题尤其急迫，因为白细胞库所能提供的细胞的绝对数量比较少，最终治疗效力有可能关键取决于一小群细胞的功能，而由于不同的细胞以不同方式适应贮存，贮存的白细胞的活性有可能随着时间推移发生变化。迄今为止，尚无人构建出适合CAT的白细胞库。
通过白细胞单采分离可用于CAT疗法的白细胞白细胞单采(Leukapheresis)是一种特殊形式的采血术(apheresis)，涉及从获取的血液中选择性分离并取出白细胞，然后将血液的剩余部分回输给供血者。在白细胞单采过程中，使取出的血液流经细胞分离装置，这种装置在体外将有核白细胞与红细胞和血浆分离。红细胞和血浆被回输给供血者，这也是分离过程的一部分。该过程连续进行，不断地有血液被取出并几乎是同时在进行了各种提取之后返回到体内。因此，白细胞单采使得有可能将供血者的全部血液分多次取出并回输，在不伤害此人的情况下分离出并保存大量的白细胞。该技术因而依赖于能否建立一种静脉到静脉的体外血液循环，并从该循环的血液中提取白细胞。
白细胞单采一般都是自动的，用连续的或间断的流体离心或过滤技术进行，可参见“Leukapheresis and Granulocyte Transfusions”，由AmericanAssociation of Blood Banks，Washington DC(1975)出版。
实施离心式白细胞单采的装置在US 3489145和US 3655123中有所描述，实施过滤式白细胞单采的装置在US 3802432和US 3892236中有所描述。重力式白细胞单采(gravity leukapheresis)仅利用重力实施白细胞分离和收集，这种方法在US 4111199中有所描述。
目前可以商购的自动白细胞单采装置有多种不同类型，包括FenwalCS-3000(Baxter Healthcare，Chicago，IL)，Cobe 2997(Cobe BCT，Lakewood，CO)，Cobe Spectra，Cobe 2991，以及Haemonetics V50(Haemonetics Corp.，Braintree，MA)。这其中任一种都可以用于本发明，但优选Cobe系统(CobeBCT，Lakewood，CO，USA)，它能从流经其分离器的全血中提取到白细胞总数的40％-50％，并且其每分钟的流速可以达到40-60ml或更大。
近期有人提出，用白细胞单采创建CAT疗法所用的淋巴细胞库(见WO00/29551和WO 01/88099)。但用白细胞单采产生商业化的全面型淋巴细胞库受到供血者方便性和舒适性的限制。例如，供血者通常能够到访血液采集机构进行供血的时间是有限的。因此，供血者一旦到达采血机构，其真正在采血室所花的时间是一个重要因素。但是，白细胞单采一般需要2-4小时(比提供一个单位的血液所需的时间长数倍)。由此带来供血者舒适性的问题很多人在看到真实的采血过程时感到很害怕，并且在整个过程中供血者身上至少必须插入一个针头(通常是两个，用于引流和回输血液)，由此带来潜在危险。
因此，需要一种制备白细胞库的方法，它能避免在使用白细胞单采时所出现的问题，还能使供血者更方便(而且不适感较少)，从而有可能创建适用于CAT疗法的全面型白细胞库。
发明概述本发明是基于(至少部分基于)以下发现用常规方法从供血者采集的血样，经过可以商购的白细胞单采装置的处理，可以为白细胞建库提供方便的白细胞来源无需对供血者“连线”使用这些装置。
由这种“分离的白细胞单采”方法制备的白细胞制剂，可以直接用于在各种疾病的治疗中进行自体移植，或者在对白细胞进行各种处理后再用于所述自体移植。
因此，本发明第一方面提供了分离的白细胞单采，其中白细胞单采装置与提供血样的个体之间没有流体联通和/或剩余的血样并未回输至该个体。
白细胞单采装置优选是自动白细胞单采装置。尤其优选使用连续的或间断的流体离心式白细胞单采装置、或者连续的或间断的流体过滤式白细胞单采装置。
白细胞单采装置可以包含(a)分离装置(例如，离心转子或滤器)；(b)白细胞单采管道系统(tubing set)；以及(c)一或多个泵，所述泵用于将血样运输通过所述管道装置和将分离的白细胞运输至收集容器。
所述方法优选还包括以下步骤(a)使采集到的白细胞休眠(例如，通过深低温保存(cryogenicpreservation)使之休眠)；和，可选地(b)使休眠的白细胞复苏(例如，通过解冻和/或稀释使之复苏)。
如果使用深低温保存，为方便起见，该深低温保存包括冷冻至约-160℃或更低温度，这可以用液氮来实现。如果需要长时间保存和/或更好地保留功能，可以用液氦冷冻至约-269℃或更低温度。
广泛多种适当的深低温保存介质中，任何一种都可以用于本发明，优选包含适当的穿透性冷冻保护剂的介质。特别适合用作穿透性冷冻保护剂的是DMSO，它的使用浓度，比如说，可以最高达10％。
深低温保存介质还可以包含抗凝剂(如酸性柠檬酸葡萄糖，EDTA，肝素，或它们的混合物)、核酸酶(例如DNA酶和/或RNA酶)以及生理可接受的介质(例如，磷酸盐缓冲液)。深低温保存介质还可以包含蛋白质性质的组合物，如血清或血清成分和/或糖(sugar)和/或多糖(polysaccharide)(它们在采用潜水式冷冻(plunge freezing)的实施方案中是特别优选的)。
在本发明深低温保存介质中使用的特别优选的蛋白质性质的组合物包含血液白蛋白(例如，牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。尤其方便的是，使用从供血者血样中分离的人血清。它可以作为白细胞分离的副产物与白细胞一起分离。
本发明第二方面提供了用于从血样中选择性分离并取出白细胞的白细胞单采装置的用途，所述血样与提供该血样的个体的血液之间没有流体联通(即，是本文所述的分离的血样)。
本发明第三方面提供了制备用于自体移植的白细胞组合物的方法，包括以下步骤(a)提供来自供血者个体的分离的血样；和(b)用白细胞单采装置从该血样中选择性分离并收集白细胞。
本发明第四方面提供了制备用于恢复性自体移植(restorativeautotransplantation)的白细胞组合物的方法，包括以下步骤(a)提供来自供血者个体的分离的血样；(b)用白细胞单采装置从该血样中选择性分离并收集白细胞；(c)使收集到的白细胞休眠(例如，通过深低温保存(cryogenicpreservation)使之休眠)；和，可选地(d)使休眠的白细胞复苏(例如，通过解冻和/或稀释使之复苏)。
本发明第五方面提供了制备用于治疗性自体移植(remedialautotransplantation)的白细胞组合物的方法，包括以下步骤(a)提供来自供血者个体的分离的血样；(b)用白细胞单采装置从该血样中选择性分离并收集白细胞；(c)处理所收集到的白细胞；和，可选地(d)使经过处理的白细胞休眠(例如，通过深低温保存使之休眠)。
本发明第六方面提供了制备白细胞库的方法，包括以下步骤(a)提供来自供血者个体的分离的血样；(b)用白细胞单采装置从该血样中选择性分离并收集白细胞；和(c)使收集到的白细胞休眠(例如，通过深低温保存使之休眠)，并且将这些步骤重复应用于来自不同供血者个体的一系列血样，从而制备多份休眠(例如深低温保存)的白细胞组合物，所述方法还包括以下步骤(d)将休眠的白细胞以可以复苏的方式保存，以备日后自体移植。
本发明第七方面提供了用于从个体收集分离的血样的系统(例如，封闭系统)，所述系统包含样品容器和白细胞单采管道系统。
因此，本发明提供了用于从个体收集分离的血样的系统(例如，封闭系统或功能性封闭系统)，所述系统包含(a)采样装置(例如，包含针头)，以用于从所述个体收集血样；(b)样品容器，其与所述采样装置之间有流体联通；(c)白细胞单采管道系统，其与所述样品容器之间有流体联通；其中所述管道系统是盲端，不包含用于将经过分级分离的样品的任何一部分重新引回所述个体中的装置。
本发明第八方面提供了用于从来自个体的分离的血样中选择性分离并取出白细胞的装置，所述装置包含带有本发明收集系统的白细胞单采装置。
本发明还涉及可以通过本发明的方法获得(或已经获得)的白细胞组合物和白细胞库。
本发明还涉及本发明所述方法、系统、装置、组合物和细胞库的各种治疗用途。相应地，本发明涉及本发明所述白细胞组合物在治疗中的用途，例如在自体移植(例如恢复性或治疗性自体移植)中的用途。
发明详述
I.定义以下术语在本文中使用时，除了这些术语在本领域可能具有的任何更宽(或更窄)含义以外，除非有特别说明，都意图表示以下含义术语“白细胞单采”是本文使用的本领域术语，用于定义一种方法，其涉及从获自供血者的血液中选择性分离和取出白细胞、再将剩余的血液回输给所述供血者。
术语“白细胞单采装置”是本领域术语，用于定义任何能进行白细胞单采的装置，不管这种装置采用什么方式来分离和取出白细胞。
术语“分离的白细胞单采”用在本文中，是指对分离的血样实施白细胞单采的一种新形式。
类似地，术语“分离的采血术”用在本文中，是指对分离的血样实施采血术的一种新形式。
术语“分离的血样”用在本文中，是指与提供该血样的供血者的血液之间没有流体联通的血样。因此，对分离的血样进行分离的白细胞单采的过程中，白细胞单采装置与提供该血样的个体之间没有流体联通和/或剩余血样未被回输到该个体体内。
术语“自体移植”用在本文中，是指同基因移植或自我移植，其中术语“自体”用于表示，移植是向提供细胞物质(例如白细胞)的相同生物(即相同个体)进行的移植。“移植”是指任何涉及将细胞物质(例如白细胞)引入生物中的过程，因此该术语包括本领域已知的任何形式的移植。
术语“休眠”用在本文中，是指任何暂停活动的状态或静止状态，达到这种状态的方法是本领域已知的，下文中有描述。任何已知的方法，包括深低温保存，都可以使用。因此，白细胞可以维持在静息状态、无活性状态或非增殖状态。
术语“健康”在本文中与供血者个体一起使用，表示该个体不具有白细胞缺陷(按照本文的定义)。因此，术语“健康”在本文包括非疾病状态的供血者个体，且该供血者个体处在未患有任何疾病或失调、或未表现出所述疾病或失调的任何症状(即，为无症状或亚临床表现)的状态。尤其是，术语“健康”在本文中包括，未患有随后想要通过自体移植方法进行治疗的疾病、或未表现出所述疾病的症状的供血者个体。
II.血样本发明可以应用于任何形式的血样，只要(a)该血样是按照上述定义的分离的血样，且(b)该血样包含供血者个体的至少一部分白细胞。
可以在将血样应用于本发明的方法之前，在体外(ex vivo)对其进行各种处理。例如，通常在使用前将血样冷藏(chill)。其它处理可以包括添加保存剂和/或抗凝剂。
也可以在采血前或采血期间，将各种制剂施用于供血者个体，从而在采血前处理血样。
可以在体外和/或在体内应用的处理的实例详见下文中题为“白细胞处理”的章节。
一般优选从供血者个体采集至少450-500ml血，这相当于在英国输血服务中(UK blood transfusion service)一个供血者所提供的一个单位的血量。如有可能，在一段时间内(例如，2-3周内，优选2-3个月内或6个月内或一年内，2年内或3年内或更长时间内)多次采血(例如，多个450-500ml)。可以将这些血样中的一或多个分为或混合为多个白细胞库保存物。仅在英国，每年从供血者采集到超过3百万单位的血，从中取出一个单位的血用于同种异体移植是很平常的。
取出的血很快会被补充(replaced)，因此可以在一年内多次从一个供血者体中采集一单位的血，必要时，采集2-12个单位，且对被采血的个体无害。
III.选择供血者个体一般考虑恢复性自体移植是一种有可能最终适用于任何个体的疗法。因此，本发明可以有效用于制备包括尽可能多的不同个体的完整的白细胞库，以便在有需要时可以对任何指定个体进行恢复性自体移植。
基于上述原因，考虑将本发明尽可能广泛地应用，以便可以建立起完整的白细胞库。但由于每一份保存物的质量取决于(至少在一定程度上取决于)该供血者个体在献血当时的健康状态，故优选用于本发明方法中的血样是从健康供血者个体采集的。
还有其它因素也影响对供血者的选择例如，用于本发明方法中的血样最好是在供血者个体尚年幼时采集较有利，优选在青春期(adolescence)或成年早期(early adulthood)。对人而言，优选在约12-30岁采血(优选多次采血)，优选15-25岁。尤其优选在16或17岁以上时采血，例如，16-30岁，17-30岁，或18-30岁，或可以是18-35或40岁。因此，优选在宿主生物成熟，或接近成熟期(maturity)，但未明显进入老化(ageing)或衰老(senescence)过程之前获得其细胞。尤其是，优选宿主生物的免疫系统成熟或发育完全时较为有利。
但是，本发明也包括在上述年龄段以外的时间获得细胞，可以在刚出生后(post-natal)的任何时间获得细胞，例如从少年时期(juvenile)的宿主生物获得细胞，例如从儿童期的中晚期(mid-to late childhood)、或甚至从婴儿(infant)获得细胞，或从老年(older)的个体获得细胞。
从刚出生后或老年的宿主取样允许收集多份样品，从而增加了积存足够数量的细胞的机会。另外，从少年宿主或老年宿主取样可以越过道德要求(ethical requirements)，如需要告知并经同意才能取样的要求。
优选从青春期或成年宿主生物取样，因为所获取的细胞，尤其是从血液获取的细胞，将包含较大比例的有价值的成熟T细胞，它们能识别异常细胞群体，如癌细胞或被病毒感染的细胞。故而，当使用血样时，从具有成熟免疫系统的个体(即并非胎儿(foetal)或新生儿(neonatal))获取的血样较有利。
因此，本发明涉及从供血者个体收集的血样在将来可能发生或意外发生或仅仅是偶然发生的事件中的用途，所述血样是在供血者个体不存在可能罹患疾病的直接预示、暗示、或怀疑的时候获取的，所述将来事件不是已经预见到或已经怀疑或已经预示的疾病。因此，本发明一些实施方案中，所述供血者个体不对任何具体疾病易感，或者是没有患任何具体疾病的危险，例如不具有任何可预示随后疾病的症状或表现。类似地，宿主生物优选未遭受任何可能引起预知疾病的损伤。
事实上，对于一些应用而言(例如，为了随后进行恢复性自体移植而制备白细胞库)，优选本发明用到的血样是在供血者个体罹患任何疾病或出现相关症状之前从该个体获取的，更优选是在宿主生物处于总体上良好的健康水平、并优选没有任何形式的免疫受损(immunocompromise)时获取的。在这些实施方案中，在供血者个体没有事先出现疾病症状、或存在疾病、或已经被诊断为罹患疾病、而该疾病又是随后将要接受治疗的疾病时，也就是说在该宿主生物处在健康状态、而且不是“病后恢复”状态(例如，不处在从将要被治疗的白细胞缺陷部分地或完全地恢复的状态)时，从该个体获取血样特别有利。
易感的(Predisposed)供血者个体治疗手段不断进步，对疾病过程的理解也越来越深入，这有助于我们调整治疗方向，从而减轻疾病和痛苦。这样的理解由于分子生物学领域的技术进步而被大大推进。我们现在能在分子水平上跟踪疾病的发病机理，并且认识到，个体的基因构造在他们对某些疾病的易感性方面起重要作用。例如，我们已知，一些个体由于他们的基因组成的关系，很容易发生某些疾病。
对一些个体而言易感的疾病多数是白细胞缺陷，该术语在本文中表示需要施用自体白细胞的情况。这类情况因此包括个体已经罹患与白细胞功能失调有关的疾病、感染或生理失调，或者已经罹患需要增强或刺激内源白细胞活性的疾病、感染或生理失调。白细胞缺陷的具体实例可以参见下文中“实例说明(Exemplary indications)”章节。
目前通过基因检测，可以鉴定那些易感于白细胞缺陷(例如癌症、免疫功能失调或感染等各种形式中的任一种)的个体。
此外，我们对于机体免疫系统的认知，以及尤其是对于免疫系统识别并杀伤被病毒感染的细胞和肿瘤细胞的认知，在不断进步。我们现在已知，为了激发细胞介导的免疫，不良细胞(offending cell)(例如被病毒感染的细胞或肿瘤细胞)必须同时呈递HLA I类限制性肿瘤表位或病毒表位以及GM-CSF和/或TNF-α等危险信号，以便使免疫系统的抗原呈递细胞(APC)将B7和IL-12等协同刺激信号与抗原一起呈递给与之相互作用的细胞毒T-淋巴细胞(CTL)群。这种同时呈递导致产生活化细胞克隆和记忆细胞克隆(综述可参见Nature Medicine Vaccine Supplement 4(1998)525)。在缺乏这些额外的信号的情况下，识别不良细胞的HLA-I类抗原-限制性T-细胞经过加工后被破环或脱敏(机体的一种可能用于避免发生诸如自身免疫病等生理失调的过程)。这类耐受的诱导是由于不识别(ignorance)、无反应性(anergy)或生理性缺失(physical deletion)(Cold Spring Harbour Symp Quant Biol 2(1989)807；Nature 342(1989)564；Cell 65(1991)305；Nature Med 4(1998)525)。
目前已清楚，肿瘤细胞并不自动地同时呈递危险信号和/或协同刺激信号。故而，肿瘤的大量繁殖(spawning)可能导致根除那些提供细胞介导的抗肿瘤免疫力的T细胞克隆。因此，表现出癌症、白血病/淋巴瘤或肉瘤等的病人，可能已经通过这个机理失去了他们先天的消灭肿瘤的能力。
但是，如果在病人发生扩散性疾病之前将所需的T淋巴细胞或其样品取出，那么在发病时可以将相关的T细胞群返回给该病人，在经过必须的T细胞协同刺激后，来缓解疾病。协同刺激可以在将细胞返回给病人的同时进行，也可以在通过对病人实施其它治疗而将细胞返回给病人之后进行，或者除了该病人天然产生的刺激以外不再有其它刺激。细胞的活化/刺激也可以是在回输给病人之前在体外诱导。
本发明因此特别适用在易感于白细胞缺陷生长的病例中。它因此代表了一种从健康供血者个体取出白细胞，以便在该个体后来有需要时，通过自体(自基因)移植方法移植给该个体的一种方法(means)。尽管该易感个体有可能因为从来没有出现需要用这种方法进行治疗的疾病而从来没有接受这些细胞，本发明也可以用于提供一种保险形式，为该个体防范白细胞缺乏症的高风险提供保障。
类似地，没有诊断出易感性的个体也可以选择，在他们出国旅行之前，抽取样品，放入本发明的白细胞库，以备后用。这类应用可以包括境外感染的治疗。
除此之外，众所周知，老化过程使个体更易患疾病。这种易感性的根本原因似乎在于老化过程中的T细胞和B细胞的数目/活性显著降低，致使免疫功能丧失(Mech Ageing & Dev 91(1996)219；Science 273(1996)70；Mech Ageing & Dev 96(1997)1)。疾病易感性尤其可见于老年病人在医院内接受诸如外科手术时，在这里，他们很容易发生机会感染，导致严重或者甚至是致命的后果。在这类个体较年轻的时候取血样，按照本发明的方法处理，放入白细胞库中，就可以在上述情况中提供恢复性自体移植的机会。
这种方法可以更广泛地用于在手术后增强病人的免疫系统，从而减少机会感染引起术后并发症的可能性。因此，本发明可以作为预防性治疗，例如，用于当老年病人更易感于疾病之时。
IV.白细胞本发明涉及用分离的白细胞单采术从血样中分离并收集白细胞。可以理解，在白细胞单采过程中并不需要把血样中所有的白细胞都分离和/或取出来。在很多情况下，仅仅取出和/或分离出血样中白细胞总数的一部分就足以。本领域技术人员很容易确定需要取出的白细胞的合适量，它基于所分离出的白细胞的用途、样品量、供血者状态、白细胞的特征以及所采用的具体白细胞单采装置等因素而有不同。
本发明方法中收集到的白细胞在一定程度上是从原始血样中分离得到的。术语“分离的”在本文中用于表示，所分离的白细胞处在不同于它们在人体内环境的一种物理环境，该术语并不表示任何具体的纯度。事实上，纯度绝对值并非关键，本领域技术人员很容易基于白细胞的用途来确定合适的纯度。
本发明方法中对白细胞的分离和收集也并不必然表示，优先分离和收集任何具体类型的白细胞。本发明的白细胞包括任何白细胞，诸如粒细胞，淋巴细胞和单核细胞等。
粒细胞包括髓细胞(myelocyte)，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。淋巴细胞包括B淋巴细胞，T淋巴细胞和自然杀伤细胞。单核细胞包括单核巨噬细胞和其它巨噬细胞。
但在一些实施方案中，所分离并收集的白细胞优选包含一种或多种特定类型的白细胞。优选的细胞类型是淋巴细胞，尤其是T-淋巴细胞(T-细胞)。特别要优选成熟的T-淋巴细胞。
由于每升人血液中成熟T细胞总数为1-2.5×109，因此100ml血样中通常包含1-2.5×108成熟T细胞，一般这就足以提供能代表整个成熟人T细胞群体中产生有益效果所需的量。但是，根据用白细胞单采装置所分离并收集到的白细胞总数的级分，以及所采用的任何复苏技术的效力，优选使用至少100ml，115ml，200ml或300ml血样，更优选超过400或500ml的血样，以便在个体发生疾病时，能获得足够数量的成熟T细胞，在返回该个体后产生有益的治疗效果。
本领域已知有多种标准技术可以从包含混合淋巴细胞群的样品中选出具体的淋巴细胞亚群。这类亚群的实例包括，CD3+，CD8+，CD4+和CD16/56+(自然杀伤)T细胞以及CD19+B细胞。例如，这类T细胞亚群中任何一群或任何混合或任何组合都可以用于本发明的方法、用途和组合物中，它们可以通过多种已知方法很容易地获得，所述方法如FACS(荧光活化细胞分选(Fluorescence Activated Cell Sorting))和血细胞计数系统(haemocytometrysystems)。
本发明还发现了更广泛的应用，并且除了白细胞单采术以外，也可以采用任何其它形式的分离式采血术。因此，本发明涉及用于制备干细胞组合物(并因此产生干细胞库)的分离式采血方法。本发明因此还可以应用于干细胞或始祖细胞(progenitor cell)，包括多能干细胞和已经进入具体分化途径的干细胞或始祖细胞。
V.白细胞处理可以对白细胞进行各种处理。这类处理导致，例如扩增(expansion)一部分或所有代表性细胞亚群，提高白细胞在休眠阶段的长期活力，增强它们的治疗潜力，弥补部分或所有白细胞的缺乏或缺陷(例如，象在治疗性自体移植治疗模式中那样)和/或使它们在随后用于自体移植时更为安全。
所述处理可以在白细胞休眠之前或之后(以及进行自体移植之前或之后)进行。此外，可以在取样之后进行处理(即体外进行)，在使细胞休眠之前或复苏之后都可以处理。例如，对白细胞的处理可以是，在自体移植过程中，将一种另外的组合物与白细胞组合物依次(sequentially)或同时施用。对白细胞的处理可以在即将开始自体移植前进行。
或者(或另外)，可以在取血之前，通过施用生长因子或细胞因子等，对仍然在体内的白细胞进行处理(见下文)。
移植前处理的实例包括各种遗传修饰，如掺入阴性选择标记(例如，参见W096/14401，其引入本文作为参考)。这类处理使得有可能进行移植后的白细胞清除(ablation)或滴定剂量反应曲线。其它遗传干预可以包括，调节或修饰一或多个基因的表达(例如，增加或减少基因表达)，使一或多个基因失活，基因置换和/或使一或多个异源基因表达)。其它遗传修饰包括，定向引导(targeting)具体的T-细胞(见W096/15238，其引入本文作为参考)，以及用抗体修饰T-细胞受体所有组成部分(receptor repertoire)/表达，从而产生T-细胞嵌合体。
本发明的其它处理包括，将白细胞暴露于一或多种刺激分子，例如抗原(如癌症抗原或病毒抗原)、抗体、T细胞识别表位、肽、血液因子、激素、生长因子或细胞因子或其组合。
例如，白细胞可以在体外(或于取血之前在体内)用以下物质进行处理抗原(例如，前列腺特异性抗原1或前列腺特异性抗原2、her-2/new、MAGE-1、p53、Ha-ras和c-myc等癌症抗原，或病毒抗原)、抗体、T细胞识别表位、肽、血液因子、激素、生长因子或细胞因子或其组合。刺激分子可以是合成的分子、重组分子，或者可以是从人体或动物体纯化或分离的分子。这方面特别有用的刺激分子选自IFN-alpha，IFN-beta，IFN-gamma，II-1a，II-1b，II-2，II-3，II-4，II-5，II-6，II-7，II-8，II-9，II-10，II-11，II-12，II-13，II-14，II-15，GM-CSF，M-CSF，G-CSF，LT或上述两种或更多种的组合。这样的处理可以改变白细胞的生长和/或活性和/或分化状态，和/或可以用于区分或选择性分离或富集所需的白细胞类型或清除不想要的细胞。
最近有一些进展使得可以获得用于随后自体移植的细胞。例如，对造血调节因子的研究导致分离出一系列能影响淋巴细胞增殖和分化的因子。这些因子包括，细胞因子(如白细胞介素系列IL-1到IL-18，白三烯，肿瘤特异性抗原如前列腺特异性抗原1或前列腺特异性抗原2、her-2/new、MAGE-1、p53、Ha-ras和c-myc)，生长因子如TNF、TGF、FGF、EGF、GM-CSF、G-CSF，及其它。这其中有多种因子目前可以购买到临床使用的商品，有一些已经显示能大大增加外周血淋巴细胞，尤其是未成熟的T淋巴细胞的数量。将它们在取血前施用于供血者个体，可以控制质量和/或数量(指白细胞亚型的存在数量和特性而言)，并且有可能无需骨髓取样，直接从供血者个体外周血收获大量的所需细胞，如未成熟的T淋巴细胞。
移植前的其它处理包括培养白细胞(或其亚群)。例如，可以培养白细胞使得细胞数增加。例如，可以用本领域已知的方法使细胞传代。这类培养可以在白细胞休眠之前和/或之后进行。
因此，在白细胞包括T细胞的情况下，可以在移植前对T细胞进行协同刺激和/或在自体移植之前使T细胞暴露于肿瘤抗原(任选与协同刺激因子一起)。
VI.白细胞装置目前市面上可以购买到多种不同类型的白细胞单采装置。这类装置通常至少包含三个单独的组件(1)分离装置(例如包含膜或离心转子，它们提供力量使白细胞与血液中其它各种成分分开；(2)一或多个泵，用于将血样运输到上述分离装置，用于取出分离的白细胞以及用于维持灌输(transfusion)和再灌输(retransfusion)所必须的力量，和(3)管道系统(通常是一次性的)，它将血液及其各种级分以特定的几何位置保持在分离装置内，它限定出固定的血液流通通道(常常是从供血者，通过白细胞单采装置又回到该供血者的一个回路)以及用于收集分离的白细胞和/或其它血液级分或流体的容器(一般是袋子)。
广泛多种市售白细胞单采装置中的任一种都可以用于本发明中。白细胞单采装置的具体操作方式取决于多种因素，包括分离装置(例如，离心机，滤器等)的特点、所需的白细胞样品类型、需要处理的血样体积、供血者个体的特征和状态、白细胞组合物的最终用途、以及在进行本发明的处理之前施加于血样的任何处理的特性。因此，本领域技术人员能很容易地确定合适的操作参数。
但是优选地，选择对操作者介入和/或培训的需要最少的白细胞单采装置。对多种市售白细胞单采系统而言，操作者进行准备和操作所需的时间和/或专业技能各不相同。例如，减少操作者装卸管道系统所需的时间、以及降低这些操作的复杂程度，可以提高生产力和/或减少操作者失误的可能性。而且，减少系统对操作者的依赖程度，则可以减少操作失误和/或减少对这些系统的操作者所期望的/必需的资格。
性能-相关因素也是有关联的，可以用白细胞单采系统的“收集效力”来评判。一个系统的“收集效力”当然可以用多种方式来衡量，诸如用所收集到的白细胞部分相对于样品中自细胞总数的大小来衡量。性能也可以基于白细胞单采方法对各种类型血液成分的影响来评价。例如，一般希望减少采血法对至少白细胞的负面影响。可能还希望减弱血小板活化作用，以避免处理过程中样品质量的下降。
特别优选的是Cobe系统(Cobe BCT，Lakewood，CO，USA)。
VII.本发明中用到的收集系统本发明用到的从个体收集分离的血样的系统可以包含样品容器(用于收集和容纳血样)以及白细胞单采管道系统。
术语“白细胞单采管道系统”在本文中用于定义在先章节中描述的管道系统。这种管道系统可以包含血液处理容器，在该容器中，白细胞受到分离装置中的分离力(separation forces)的作用。
在与包含离心型分离装置的白细胞单采装置(见在先章节)一起使用的管道系统中，血液处理容器可以包含离心环(centrifuge loop)，当装备在分离装置的离心转子中时，该离心环限定了使血液受到离心分离力作用的容器空间。
本发明使用的系统可以是封闭系统，功能性封闭系统，或开放系统。
本文中术语“封闭系统”，当应用于白细胞单采管道系统时，是指一种无菌且通过无菌屏障与外界环境隔离的管道系统，在其内部所有组件都充分集成(integral)、相互连接(attached)和/或在生产地点装配好的(assembled atthe manufacturing site)。
本文中术语“功能性封闭系统”，当应用于白细胞单采管道系统时，是指一种在装置生产地点装配好的管道系统，它利用无菌屏障滤器(如0.22微米滤器)由最终用户将其与无菌连接装置进行连接。
本文中术语“开放系统”，当应用于白细胞单采管道系统时，是指仅有一部分在装置生产地点装配、然后由最终用户按照自己需要完成装配的管道系统。
优选地，所述系统还包含一或多个(例如3个)白细胞收集容器。优选3个或更多个收集容器，以便有足够的样品以供取舍并且也有利于用一式双份/一式三份的样品创建细胞库。这允许更灵活的自体移植方案。
所述系统还可以方便地包含能容纳获取白细胞后剩余的血液的容器。这剩余的血液可能在其它治疗方案中有用，例如在异源(allogenous)方案中有用。所述系统还可以包含针头或插管(cannula)，用于将血样从个体导入样品容器。
各种容器都可以方便地采用柔性(flexible)透明袋形式。部分(或全部)管道也可以方便地采用柔性透明材料(例如，塑料)。
VIII.休眠的诱导任何合适的手段都可以用于诱导休眠。
根据一种优选的深低温保存方法，细胞优选在-160℃以下冻存。一种特别优选的休眠手段是，将细胞冻存到氦(He)的沸点，即约-269℃或更低。
根据Freshney的观点(Freshney′s Tissue Culture of Animal Cells(Cultureof Animal CellsA Manual of Basic Technique，Wiley Liss，1994))，可以将细胞悬浮在合适的培养基(例如，包含最高浓度达10％的DMSO)中，以受控制的速率冷却(例如，每分钟1℃，直到-70℃，然后放入液/气N2)。这种方便的法可以适用于将细胞冷却在He/N2混合体或He中。其它实现和/或维持细胞休眠的方法包括冷却到4℃。
IX.复苏休眠之后，在用于移植之前将细胞复苏。同样地，这可以通过本领域已知的任何方便的方式，以及任何使细胞复苏或复活的方法来实现。
方便地讲，这可以通过，例如，将细胞解冻和/或稀释来实现。复苏技术是本领域已知的。细胞解冻可以如下操作将容纳细胞的容器在37℃水浴中温和振荡，然后用诸如培养基或血清将DMSO稀释到1％更低浓度。
细胞可以立刻植入或经过在培养基中恢复的阶段后植入。复苏过程是为重新建立使细胞在诸如预防或治愈性治疗中的用途来设计的。
X.细胞建库本发明的白细胞组合物可以建库，从而产生白细胞库。优选地，所述组合物在使白细胞休眠(如上述)后建库。
任何合适的细胞建库系统都可以采用，只要其中的保存物可以复苏用于自体移植。这意味着使用一些标记形式，但这并不必须是用每份保存物的物理附加物(physical appendage)的形式。
因此，本发明的白细胞库可以包含多组细胞贮存单元以便贮存白细胞组合物。通常，这样的细胞贮存是通过深低温保存法来进行的，但也可以采用其它保存技术。本发明的细胞库还可以包括数字信息单元，用于存储与供血者个体的身份(identity)、所在地(location)和医疗史有关的数字信息，和/或与一份具体的保存物有关的情况(例如，从供血者个体采集血样的日期，对该保存物中所含白细胞进行任何处理的处理条件和细节)。
数字信息单元优选包含至少一个数字计算机，它具有足够的数字存储能力，可以存储可能的与每一份保存物有关的大量信息。
本发明的白细胞库优选还包含数字数据检索(digital data retrieval)装置(arrangement)，它与数字信息单元相接(interfaced with)，可以检索存储在数字信息单元中的指定信息。这种数据检索装置可以整合在数字计算机中。还可以提供通过电话或互联网进行的数字信息远程访问，并且可以在全球范围内快速且方便地访问这些信息。
XI.医学应用本发明可适用在所有希望施用(经处理或未经处理的)自体白细胞的治疗和预防形式中(即，预期有治疗前景)。
为了本发明的目的，在这些适用情况中，认为出现了白细胞缺陷。
因此，可以理解，本发明医疗应用中的白细胞缺陷(leukocyte deficiency)涵盖多种疾病(disease)、综合征(syndrome)、失调(disorder)、生理失调(condition)和感染。例如，可以理解，当个体罹患与白细胞功能失调有关的疾病、综合征、失调、生理失调或感染时，以及当个体罹患内源白细胞成分表面看似乎正常、但正常的内源白细胞活性希望/需要改变、增大、或获得刺激的那些疾病、综合征、失调、生理失调或感染时，可以发生如上述特别广义的白细胞缺陷。具体地说，本文所述白细胞缺陷可以视为T细胞和/或B细胞非特异性损失的结果，或者视为具体的T细胞克隆群和/或B细胞克隆群损失或缺陷的结果。
为方便起见，这些疾病、综合征、失调、生理失调或感染在本文中统称白细胞缺陷。
适用本发明的治疗可以分为两大类。一类是利用本发明的方法从健康个体供血者的血样创建白细胞组合物(即形成白细胞库的一部分)。在这种应用中，本发明被用于创建源自个体供血者的健康白细胞组织的细胞来源，只要该个体在以后发生白细胞缺陷时，可以将细胞返回该供血者个体。
在这种疗法(本文称恢复性自体移植)中，本发明利用了以下事实多种白细胞缺陷的发生是一系列暂时性事件(它们彼此有或没有因果关系)的一部分，故而在发生白细胞缺陷之前的一个时间点创建白细胞库，就构成了后来可以进行恢复性治疗的一个治疗源。
第二大类是利用本发明的方法从罹患白细胞缺陷的个体供血者的血样创建白细胞组合物。然后在体外对白细胞组合物进行处理，将处理过的组合物再移植到该个体体内。对白细胞组合物进行的处理使这些白细胞组合物返回供血者体内后，可以缓解或消除白细胞缺陷。该方法的一个变换方法涉及在采血步骤之前在体内处理个体的白细胞，这些方法可以涉及在采血步骤之后在体外的进一步处理。
在这些治疗(本文中称治疗性自体移植)中，本发明利用了以下事实多种白细胞缺陷可以通过对个体白细胞总群体中一小部分进行处理而克服。这类处理将在下文中详述，包括基因修改，细胞扩增(cellular expansion)，选择性消除具体细胞类型和用具体分子(如细胞因子)进行刺激。
上述恢复性自体移植的概念可以应用于所有个体，不管是否健康，也不管有没有可被疑为白细胞缺陷指标的因素(例如年龄、医疗史、遗传背景和生活方式)。但是，它确实允许鉴别一类特别适于应用本发明方法的具体群体，详见第III节(题为“选择供血者个体”)。而且，由于如上述定义并可以用本发明恢复性或治疗性自体移植进行治疗的白细胞缺陷包括广泛多种已知疾病，因此，它们将在下面的第XII节(题为“实例说明”)中更详细描述。
XII.实例说明(Exemplary indications)如前文中所述，本发明的治疗性应用和预防性应用涉及广泛多种疾病、综合征、失调、生理失调和感染。
感染本发明可以用于治疗各种感染。在这种情况中，内源性白细胞活性可以是正常的(或具有正常反应)，但是仍希望改变、增大或刺激它。在其它情况(如HIV感染)中，内源性白细胞活性因感染直接导致功能失调。
可以根据本发明进行治疗或预防的感染包括，细菌性感染，真菌性感染或病毒性感染，或者由任何其它生物，例如原生动物，线虫、昆虫或其它寄生虫引起的感染。
优选的应用是治疗由HIV感染导致的AIDS。在这种情况中，可以在个体健康或未受感染的时候收集其CD4+细胞并贮存，当该个体出现HIV感染或者当AIDS发病或CD4+细胞计数降低时，将贮存的细胞移植到该个体中。这种方法对于那些生活方式使之面临HIV感染风险的个体具有吸引力。
癌症、白血病和肉瘤本发明还可以用于治疗和预防各种恶性病(malignancies)通常是指，任何恶性或恶性前兆(pre-malignant)，扩散或过度扩散(hyper-proliferative)生理失调或者任何由于机体细胞或组织中的功能失调(disturbance)或异常或者其它失调或异常所引起的疾病或与它们有关的疾病。
治疗或预防各种形式的癌症是本发明优选的实施方案，其包括治疗或预防机体的任何癌性细胞或组织。
因此，本发明不限于任一种扩散性疾病(例如，白血病、淋巴瘤、癌(carcinomas)或肉瘤)，也不限于具体的癌基因或肿瘤抑制基因表位如前列腺特异性抗原1或前列腺特异性抗原2，her-2/new，ras，myc，myb，fos，fas，视网膜母细胞瘤，p53等，或以HLAI类抗原限制性方式或其它类似方式呈递、从而能被白细胞识别的其它肿瘤细胞标志表位。所有癌症，如白血病，淋巴瘤，乳腺癌，胃癌，结肠癌，直肠癌，肺癌，肝癌，子宫癌，睾丸癌，卵巢癌，前列腺癌和脑肿瘤如神经胶质瘤、星形细胞瘤和神经母细胞瘤，肉瘤如横纹肌肉瘤和纤维肉瘤，都可以用本发明进行治疗或预防。
因此，本发明可以用于治疗或预防乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌。本发明还可以用于治疗或预防血液系统和淋巴系统的癌症(包括何杰金氏病(Hodgkin′s Disease)、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrm氏病)，皮肤癌症(包括恶性黑素瘤)，消化道癌症(包括头颈部癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、肛门癌)，泌尿生殖道癌症(包括肾癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌)，女性的癌症(包括乳腺癌、卵巢癌、妇科癌症和绒膜癌)以及脑、骨中的类癌，鼻咽癌，腹膜后腔(retroperitoneal)肿瘤，甲状腺肿瘤，和软组织肿瘤。本发明还可以用于治疗或预防未知的原发部位的癌症。
XIII.剂量学(Posology)本领域技术人员很容易确定本发明医学应用中进行自体移植的白细胞组合物用量。要注意，只要0.01×108(例如，1-10×108)成熟淋巴细胞(可以从单一一份约100ml的正常人血液样品中获得)就足以增强(boost)受试者的免疫系统，并因此具有本发明自体移植方法的有益效果。要注意，仅在英国，每年从供血者采集到超过3百万单位的血，从中取出一个单位的血用于同种异体移植是很平常的。
所施用的白细胞组合物可以来自单一一份血样，或者可以是将同一供血者个体在不同时间点采集的多份不同血样混合而成的白细胞组合物混合群(pool)。所施用的白细胞组合物可以是保存物的全部或一部分，优选是其一部分，以便可以多次(multiple dosing)施用，也可以选择在将剩余的细胞进行扩增后再施用(例如，T细胞数可以用标准方法体外扩增)。
在基于T细胞活性的应用中，成熟T细胞用量是至少0.01×108，更优选至少0.1×108，更优选至少1×108(如至少1-10×108)。优选的范围是0.01×108-1010成熟T淋巴细胞，如0.1×108-1010，1×108-1010或1×109-1010成熟T淋巴细胞。
因此，自体移植所需的成熟T细胞样品是至少0.01×108，通常在108-1010CD3+成熟T细胞的范围，优选2×108-1010，更优选3×108-1010CD3+，还更优选4-5×108-1010CD3+成熟T细胞。
方便地，每份用于自体移植的样品包含3×108CD3+成熟T细胞，更优选5×108，还更优选1×109CD3+成熟T细胞。当个体能提供充足的血液来源时，还更优选使用4-5×109CD3+成熟T细胞或1010CD3+成熟T细胞。
优选地，自体移植所需CD3+和CD8+成熟T细胞亚群的样品是至少0.01×108，通常在0.25×108-0.25×1010的范围，更优选0.5×108-0.25×1010，还更优选0.75×108-0.25×1010，还更优选0.75×108-0.25×1010或1.00-1.25×108-0.25×1010。方便地，用于移植的每份样品中CD3+和CD8+的细胞数是0.2×108的水平，优选0.4×108，或更优选1×108，或还更优选2×108，或更优选3×108，或更优选5×108。当个体能提供充足的血液来源时，可以使用1×109，优选2×109，4×109，或更优选1×1010CD3+和CD8+细胞。
优选地，自体移植所需CD3+和CD4+成熟T细胞亚群的样品是至少0.01×108，通常在0.1×108-0.5×1010的范围，更优选0.65×108-0.5×1010，还更优选0.85×108-0.5×1010，还更优选1×108-0.5×1010或1.8-3.6×108-0.5×1010。方便地，用于移植的每份样品中CD3+和CD4+的细胞数是0.2×1010的水平，优选0.3×108，或更优选0.4×108，0.5×108，1×108，2×108，3×108，4×108，或更优选5×108。当个体能提供充足的血液来源时，可以使用1×109，或更优选2×109，或更优选1×1010CD3+和CD4+细胞。
优选地，自体移植所需CD3+和CD16/56+成熟T细胞自然杀伤细胞亚群的样品是至少0.01×108，通常在0.01×108-0.5×1010的范围，优选0.02×108-0.5×1010，更优选0.03×108-0.5×1010，还更优选0.5×108-0.5×1010或0.5-2×108-0.5×1010。方便地，用于移植的每份样品中CD3+和CD16/56+的细胞数是0.01×108，0.2×108，0.3×108，0.5×108，1×108，2×108，3×108，5×108的水平，或更优选，当个体能提供充足的血液来源时，可以使用1×109，或更优选2×109，或更优选1×1010CD3+和CD16/56+细胞。
此外，成熟淋巴细胞样品优选包括B细胞，如CD19+B淋巴细胞。包括在T细胞样品中的成熟B细胞样品可以是至少107，108或109，通常在107-1010成熟B细胞的水平，优选2×107-1010成熟B细胞，更优选3×107-1010成熟B细胞，还更优选4-5×107-1010成熟B细胞。
方便地，自体移植物中B细胞的具体数目在3×107的水平，优选5×108，更优选1×109成熟B细胞，还更优选4-5×109或1010成熟B细胞。
此外，淋巴细胞样品可以优选包括树突细胞。树突细胞样品可以是至少107，108或109的数量，通常在107-1010树突细胞的范围，优选2×107-1010细胞，更优选3×107-1010细胞，还更优选4-5×107-1010细胞。
自体移植物中树突细胞的具体数目在3×107的水平，优选5×108，更优选1×108，还更优选4-5×109或1010成熟B细胞。
XIV.等效方案上文中详细描述了本发明的优选实施方案，它们因此被视为对本发明各个方面的举例说明而非限制。本领域技术人员了解或者可以认识到，利用常规实验，可以获得本文所述具体实施方案的多种等效方案(equivalent)，改良方案(modification)或变化方案(variation)。这些等效方案，改良方案或变化方案都包括在权利要求所述的发明范围内。
权利要求
1.制备用于自体移植的白细胞组合物的方法，包括以下步骤(a)提供来自供血者个体的分离的血样；(b)用白细胞单采装置从该血样中选择性分离并收集白细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述白细胞单采装置是自动白细胞单采装置。
3.权利要求1或2的方法，其中所述白细胞单采装置包含封闭系统或功能性封闭系统。
4.权利要求2或3的方法，其中所述白细胞单采装置是连续的或间断的流体离心式白细胞单采装置，或者是连续的或间断的流体过滤式白细胞单采装置。
5.在先任一权利要求的方法，其中所述自细胞单采装置包含(a)分离装置(例如，离心转子或滤器)；(b)白细胞单采管道装置；以及(c)一或多个泵，所述泵用于将样品运输通过所述管道装置和将分离的白细胞运输至采集容器。
6.在先任一权利要求的方法，所述方法用于制备恢复性自体移植所用的白细胞组合物，该方法还包括以下步骤(c)使收集到的白细胞休眠(例如，通过深低温保存使之休眠)；和，可选地(d)使休眠的白细胞复苏(例如，通过解冻和/或稀释使之复苏)。
7.权利要求1-5中之任一方法，所述方法用于制备治疗性自体移植所用的白细胞组合物，该方法还包括以下步骤(c)处理所收集到的白细胞；和，可选地(d)使经过处理的白细胞休眠(例如，通过深低温保存使之休眠)。
8.权利要求7的方法，还包括以下步骤(e)使经过处理且已休眠的白细胞复苏(例如，通过解冻和/或稀释使之复苏)。
9.权利要求6的方法，所述方法用于制备白细胞库，其中将所述方法重复应用于来自不同供血者个体的一系列血样，从而制备多份休眠(例如深低温保存)的白细胞组合物，所述方法还包括，将休眠的白细胞以可以复苏的方式保存、以备日后自体移植的步骤。
10.一种用于从个体收集分离的血样的系统(例如，封闭系统或功能性封闭系统)，所述系统包含(a)采样装置(例如，包含针头)，以用于从所述个体收集血样；(b)样品容器，其与所述采样装置之间有流体联通；(c)白细胞单采管道系统，其与所述样品容器之间有流体联通，其中所述管道系统是盲端，它不包含用于将经过分级分离的样品的任何一部分引回所述个体中的装置。
11.权利要求10的系统，其中所述管道系统包含一或多个(例如3个)白细胞收集容器。
12.权利要求10或11的系统，其中所述管道系统还包含血液处理容器(例如，离心环)。
13.权利要求6-8中之任一系统，其中所述管道系统还包含用于容纳获取白细胞以后剩余的血液的容器。
14.权利要求10-13中之任一系统，还包含用于将来自个体的血样导入样品容器的针。
15.用于从来自个体的分离的血样中选择性分离和取出白细胞的装置，所述装置包含带有权利要求10-14中之任一收集系统的白细胞单采装置。
16.权利要求15的装置，其中所述白细胞单采装置是权利要求2-5中之任一所述的装置。
17.白细胞组合物，其可以(或已经)用权利要求1-9中之任一方法获得。
18.白细胞库，其可以(或已经)用权利要求9的方法获得。
19.权利要求17的白细胞组合物，是在治疗或预防中应用的白细胞组合物。
20.权利要求17的白细胞组合物在制备用于自体移植(例如，CAT疗法，或者恢复性或治疗性自体移植)的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及新的白细胞单采形式(分离的白细胞单采)，实施分离的白细胞单采的方法和装置，由此产生的白细胞库以及基于它们进行的各种形式的治疗。
文档编号A61B5/155GK1761475SQ200480007085
公开日2006年4月19日 申请日期2004年6月17日 优先权日2003年6月21日
发明者威廉·A·施皮尔斯 申请人:英国生命力集团公司
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