治疗高胆固醇血症及相关疾病的小分子的制作方法
专利名称：治疗高胆固醇血症及相关疾病的小分子的制作方法
相关申请的交叉引用本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2004年6月9日提交的美国临时申请60/578,228的优先权，该临时申请通过引用结合在此。
背景技术：
发明领域本发明涉及治疗高胆固醇血症和相关心血管疾病以及其它疾病的反向胆固醇转运(RCT)的小分子介质。
相关领域描述目前充分确定的是升高的血清胆固醇(“高胆固醇血症”)是动脉粥样硬化发展的起因，所述动脉粥样硬化是胆固醇在动脉壁上的进行性积累。高胆固醇血症和动脉粥样硬化是心血管疾病的主要原因，所述心血管疾病包括高血压、冠状动脉疾病、心脏病发作和中风。仅在美国，每年约有一百一十万个体遭遇心脏病发作，估计费用超过1170亿美元。尽管有许多降低血液中胆固醇水平的药物策略，它们中的许多具有不理想的副作用并且已增加了安全问题。而且，商购的药物疗法都没有充分的刺激反向胆固醇转运，一种去除体内胆固醇的重要代谢途径。
循环胆固醇通过血浆脂蛋白-转运血液中脂质的复合脂质和蛋白组合物的颗粒进行。低密度脂蛋白(LDLs)，和高密度脂蛋白(HDLs)是主要的胆固醇载体。认为LDLs负责将胆固醇从肝(合成或从膳食来源获得其的地方)中传递胆固醇到体内的肝外组织中。术语“反相胆固醇转运”描述将胆固醇从肝外组织转运到肝中，它在肝中被代谢和清除。认为血浆HDL颗粒充当组织胆固醇的清除剂而在反向转运过程中具有主要作用。
有说服力的证据支持沉积在动脉粥样硬化损伤处的脂质主要来自血浆LDL的概念；因此，一般已将LDLs称为“坏”胆固醇。相反，血浆HDL水平与冠状心脏疾病呈反向相关-确实，将高血浆水平的HDL视为阴性风险因素。推测高水平的血浆HDL不仅对于冠状动脉疾病是保护性的，而且可以实际上诱导动脉粥样硬化斑块的退化(例如，见Badimon等，1992，Circulation 86(Suppl.III)86-94)。因此，通常已将HDLs称为“好”胆固醇。
释放自LDLs的胞内胆固醇的量控制细胞胆固醇代谢。来自LDLs的细胞胆固醇的积累控制三个过程(1)其通过关闭HMGCoA还原酶的合成来减少细胞胆固醇合成，所述HMGCoA还原酶是一种在胆固醇生物合成途径中的关键酶；(2)通过活化LCAT，进入的LDL-来源的胆固醇促进胆固醇的贮存，所述LCAT是将胆固醇转变成沉积在储藏液滴中的胆固醇酯的细胞酶；和(3)胆固醇在细胞中的累积促进抑制新LDL受体的细胞合成的反馈机制。因此，细胞调节它们对LDL受体的补充从而带来足够的胆固醇以满足它们的代谢需求，而不过载。(关于综述，见Brown &Goldstein，InThe Pharmacological Basis Of Therapeutics，8th Ed.，Goodman& Gilman，Pergamon Press，NY，1990，Ch.36，pp.874-896)。
反向胆固醇转运(RCT)是一种途径，通过所述途径外周细胞胆固醇可以返回肝以再循环到肝外组织或作为胆汁分泌到肠。所述RCT途径代表从大多数肝外组织中清除胆固醇的仅有方式。RCT主要由三个步骤组成(1)胆固醇流出，胆固醇从外周细胞中的最初去除；(2)通过卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LACT)作用的胆固醇酯化，其防止流出的胆固醇再入外周细胞；和(3)将HDL胆固醇酯吸收/传递到肝细胞。LCAT是RCT途径的关键酶并且主要产自肝中，并在与HDL级分关联的血浆中循环。LCAT将细胞来源的胆固醇转变成胆固醇酯，所述胆固醇酯汇集(sequester)在将要被清除的HDL中。RCT途径由HDLs所调节。
HDL是特征在于它们的高密度的脂蛋白颗粒的专业术语。HDL复合体的主要的脂质组分是各种磷脂，胆固醇(酯)和三酰甘油。最主要的载酯蛋白成分是决定HDL的功能特性的A-I和A-II。
每种HDL颗粒包含载脂蛋白A-1(ApoA-I)的至少一个拷贝(通常两个-四个拷贝)。ApoA-I由肝和小肠合成为前载脂蛋白原，所述前载脂蛋白原作为快速裂解以产生具有243个氨基酸残基的成熟多肽的前体蛋白(proprotein)分泌。ApoA-I主要包括由通常是脯氨酸的接头部分间隔的6-8个不同的22个氨基酸残基重复，并且在一些情况中包括由一些残基组成的一段序列。ApoA-I与脂质形成三种类型的稳定复合体被称作pre-beta-1HDL的小、少-脂质的复合体；被称作pre-beta-2 HDL的包含极性脂质(磷脂和胆固醇)的展平铁饼状颗粒；和被称作球形或成熟HDL(HDL3和HDL2)的包含极性和非极性脂质二者的球形颗粒。尽管大多数在循环中的HDL包含ApoA-I和ApoA-II二者，仅包含ApoA-I(AI-HDL)的HDL的级分似乎在RCT中更为有效。流行病学研究支持AI-HDL是抗-致动脉粥样硬化的假说(Parra等，1992，Arterioscler.Thromb.12701-707；Decossin等，1997，Eur.J.Clin.Invest.27299-307)。
基于体内获得的数据的一些系列的证据暗示HDL及其主要蛋白组分ApoA-I，在预防动脉粥样硬化损伤，和潜在地斑块的退化--使这些吸引人的目标进行治疗干预。首先在人血清ApoA-I(HDL)浓度和动脉粥样硬化形成之间存在逆相关(Gordon & Rifkind，1989，N.Eng.J.Med.3211311-1316；Gordon等，1989，Circulation 798-15)。确实，HDL的特定亚群已经与人中动脉粥样硬化的减少的风险相关(Miller，1987，Amer.Heart 113589-597；Cheung等，1991，Lipid Res.32383-394)；Fruchart & Ailhaud，1992，Clin.Chem.3879)。
第二，动物研究支持ApoA-I(HDL)的保护性作用。用ApoA-I或HDL治疗胆固醇喂养的兔减少了胆固醇-喂养兔的斑块(脂条)的发展和进展(Koizumi等，1988，J.Lipid Res.291405-1415；Badimon等，1989，Lab.Invest.60455-461；Badimon等，1990，J.Clin.Invest.851234-1241)。但是功效取决于HDL的来源而变化(Beitz等，1992，Prostaglandins，Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47149-152；Mezdour等，1995，Atherosclerosis 113237-246)。
第三，ApoA-I作用的直接证据由包括转基因动物的实验获得。转移到小鼠中的人ApoA-I基因的表达保护所述小鼠免于主动脉的损伤的发展，所述小鼠在遗传上倾向饮食诱导的动脉粥样硬化(Rubin等，1991，Nature 353265-267)。所述ApoA-I转基因还显示抑制在ApoE-缺陷小鼠中和在Apo(a)转基因小鼠中的动脉粥样硬化(Paszty等，1994，J.Clin.Invest.94899-903；Plump等，1994，PNAS.USA 919607-9611；Liu等，1994，J.Lipid Res.352263-2266)。在表达人ApoA-I的转基因兔(Duverger，1996，Circulation 94713-717；Duverger等，1996，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.161424-1429)和在转基因大鼠(Burkey等，1992，Circulation，Supplement I，86I-472，Abstract No.1876；Burkey等，1995，J.Lipid Res.361463-1473)中，观察到了相似的结果，在所述转基因大鼠中升高水平的人ApoA-I保护大鼠免于动脉粥样硬化并且在气囊血管成形术后抑制再狭窄。
目前对于高胆固醇血症和其它血脂异常的治疗在大约过去20年里，将cholesterolemic化合物分离成HDL和LDL调节剂并认识到减少LDL血液水平的需求已导致了许多药物的开发。但是，这些药物中的许多具有不理想的副作用和/或在某些患者中处置不当，特别是当与其它药物结合施用时。这些药物和治疗策略包括(1)胆汁-酸-结合树脂，其中断胆汁酸从肠到肝的再循环[例如，考来烯胺(QUESTRAN LIGHT，Bristol-Myers Squibb)，和盐酸考来替泊(COLESTID，Pharmacia & Upjohn Company)]；(2)抑制素(stains)，其通过阻断HMG CoA-涉及胆固醇生物合成的关键酶抑制胆固醇的合成[例如，洛伐他汀(MEVACOR，Merck & Co.，Inc.)，来自曲霉属菌株的天然产物，普伐他汀(PRAVACHOL，Bristol-Myers Squibb Co.)，和阿托伐他汀(LIPITOR，Warner Lambert)]；(3)烟酸是水溶性维生素B-复合物，其减少VLDL的产生并在降低LDL上是有效的；(4)通过减少VLDL级分将fibrates用于降低血清中的三酰甘油并可在一些患者群中通过相同的机制引起血浆胆固醇的适度减少[例如，安妥明(ATROMID-S，Wyeth-Ayerst Laboratories)，和吉非他奇(LOPID，Parke-Davis)]；(5)雌激素替代疗法可降低更年期后妇女的胆固醇水平；(6)已报道长链α，ω-二羧酸降低血清三酰甘油和胆固醇(见，例如，Bisgaier等，1998，J.Lipid Res.3917-30；WO 98/30530；美国专利号4,689,344；WO 99/00116；美国专利号5,756,344；美国专利号3,773,946；美国专利号4,689,344；美国专利号4,689,344；美国专利号4,689,344；和美国专利号3,930,024)；(7)公开了降低血清三酰甘油和胆固醇水平的其它化合物，包括醚(见，例如，美国专利号4,711,896；美国专利号5,756 544；美国专利号6,506,799)，和多萜醇的磷酸酯(美国专利号4,613,593)，和azolidinedione衍生物(美国专利号4,287,200)。
目前这些可获得的用于降低胆固醇的药物都没有安全地升高HDL水平和刺激RCT。确实，这些目前治疗策略中的大部分似乎作用在胆固醇转运途径上，调节饮食吸收，再循环，胆固醇的合成，和VLDL数量。
治疗高胆固醇血症的ApoA-I激动剂由于HDL的潜在作用，即ApoA-I及其相关磷脂在抗动脉粥样硬化疾病中的保护，开始了利用重组产生的ApoA-I进行的人临床试验，通过UCBBelgium停止和显然再次开始(Pharmaprojects，Oct.27，1995；IMS R & DFocus，Jun.30，1997；Drug Status Update，1997，Atherosclerosis 2(6)261-265；还见M.Eriksson at Congress，″The Role of HDL in Disease Prevention，″Nov.7-9，1996，Fort Worth；Lacko & Miller，1997，J.Lip.Res.381267-1273；和WO 94/13819)并通过Bio-Tech开始和停止(Pharmaprojects，Apr.7，1989)。使用ApoA-I还尝试进行试验以治疗败血症性休克(Opal，″ReconstitutedHDL as a Treatment Strategy for Sepsis，″IBC′s 7th International Conferenceon Sepsis，Apr.28-30，1997，Washington，D.C.；Gouni等，1993，J.LipidRes.94139-146；Levine，WO 96/04916)。然而，有许多与ApoA-I的生产和使用相关的缺陷，使其作为药物不那么理想；例如ApoA-I是大的蛋白质，生产它是困难的和昂贵的；至于在贮存过程中的稳定性，活性产品的传递和体内的半衰期，必须克服明显的生产和再现性问题。
鉴于这些缺陷，已经尝试制备模拟ApoA-I的肽。由于ApoA-I的关键活性是由于在蛋白质中的独特的二级结构特征中的多个重复的存在-类别A两亲性α-螺旋(Segrest，1974，FEBS Lett.38247-253；Segrest等，1990，PROTEINSStructure，Function and Genetics 8103-117)，大多数设计模拟ApoA-I活性的肽的努力已集中于设计形成种类A-类型的两亲性α-螺旋的肽(见，例如，在美国专利号6,376,464和6,506,799中的背景讨论；通过参考那里而将其全文并入结合在此)。
在一项研究中，Fukushima等合成了全部由周期排列的谷氨酸、赖氨酸和亮氨酸残基组成的22个残基的肽从而形成具有等-亲水性和疏水性面的两亲性α-螺旋(″ELK肽″)(Fukushima等，1979，J.Amer.Chem.Soc.101(13)3703-3704；Fukushima等，1980，J.Biol.Chem.25510651-10657)。所述ELK肽与ApoA-I的198-219片段共享41％的序列同源性。显示所述ELK肽与磷脂有效关联并模仿ApoA-I的一些物理和化学特性(Kaiser等，1983，PNAS USA 801137-1140；Kaiser等，1984，Science 223249-255；Fukushima等，1980，supra；Nakagawa等，1985，J.Am.Chem.Soc.1077087-7092)。后来发现该22个残基肽的二聚体比单体更接近地模仿ApoA-I；基于这些结果，提示被螺旋中断者(breaker)(甘氨酸或脯氨酸)在中部打断的44-聚物表示ApoA-I中的最小功能域(Nakagawa等，1985，supra)。
另一项研究包括被称作″LAP肽″的模型两亲性肽(Pownall等，1980，PNAS USA 77(6)3154-3158；Sparrow等，1981，InPeptidesSynthesis-Structure-Function，Roch and Gross，Eds.，Pierce Chem.Co.，Rockford，IL，253-256)。基于用天然载脂蛋白的片段的脂质结合研究，设计了一些名称为LAP-16，LAP-20和LAP-24的LAP肽(分别包含16，20和24个氨基酸残基)。这些模型两亲性肽与载脂蛋白没有序列同源性并被设计以具有亲水面，所述亲水面以与和载脂蛋白关联的类别A-类型两亲性螺旋结构域不同的方式构成(Segrest等，1992，J.Lipid Res.33141-166)。从这些研究，作者认为20个残基的最小长度是将脂质结合特性赋予模型两亲性肽所必需的。
用在序列的不同位置包含脯氨酸残基的LAP20的突变体进行的研究显示在脂结合和LCAT活化之间存在直接关系，但是肽单独的螺旋潜能没有导致LCAT的活化(Ponsin等，1986，J.Biol.Chem.261(20)9202-9205)。而且，接近肽中部的螺旋中断者(脯氨酸)的存在减少了其对于磷脂表面的亲和性及其活化LCAT的能力。尽管某些LAP肽显示结合磷脂(Sparrow等，supra)，存在关于在脂质存在时LAP肽螺旋的程度的争议(Buchko等，1996，J.Biol.Chem.271(6)3039-3045；Zhong等，1994，Peptide Research7(2)99-106)。
Segrest等已经合成了由18-24个氨基酸残基组成的肽，所述肽与ApoA-I的螺旋没有序列同源性(Kannelis等，1980，J.Biol.Chem.255(3)11464-11472；Segrest等，1983，J.Biol.Chem.2582290-2295)。对该序列进行具体设计以在疏水力矩(Eisenberg等，1982，Nature 299371-374)和电荷分布(Segrest等，1990，Proteins 8103-117；美国专利号4,643,988)方面模拟类A可交换的载脂蛋白的两亲性螺旋状结构域。将一个18残基的肽，“18A”肽设计为模型类别-Aα-螺旋(Segrest等，1990，supra)。用这些肽和其它具有反向电荷分布的肽，如“18R”肽进行的研究已经一致显示电荷分布对于活性是关键的；具有反向电荷分布的肽显示比18A类别A模拟物减少的脂质亲和性和在脂质存在时更低的螺旋含量(Kanellis等，1980，J.Biol.Chem25511464-11472；Anantharamaiah等，1985，J.Biol.Chem.26010248-10255；Chung等，1985，J.Biol.Chem.26010256-10262；Epand等，1987，J.Biol.Chem.2629389-9396；Anantharamaiah等，1991，Adv.Exp.Med.Biol.285131-140)。
还已经设计了一种基于人ApoA-I的螺旋的序列的包含22个氨基酸残基的“共有区”肽(Anantharamaiah等，1990，Arteriosclerosis 10(1)95-105；Venkatachalapathi等，1991，Mol.Conformation and Biol.Interactions，Indian.Acad.Sci.B585-596)。通过鉴定在人ApoA-I的推定螺旋的每个位置上的最普遍的残基来构建该序列。如上述肽，由该肽形成的螺旋具有集簇于亲水-疏水界面的正电荷氨基酸残基，集簇于亲水面中心的负电荷氨基酸残基和少于180°的疏水角。尽管该肽的二聚体在活化LCAT中稍稍有效，单体显示了较差的脂质结合特性(Venkatachalapathi等，1991，supra)。
主要基于关于上述肽的体外研究，已经出现了一组设计模拟ApoA-I的功能的肽的“规则”。显然，认为对于脂质亲和性和LCAT的活化，需要具有集簇于亲水-疏水界面的正电荷残基和集簇于亲水面中心的负电荷氨基酸残基的两亲性α-螺旋(Venkatachalapathi等，1991，supra)。Anantharamaiah等还已经指出在位于α-螺旋的疏水面中的共有区22-mer肽的位置13上的负电荷谷氨酸残基在LCAT的活化中具有重要作用(Anantharamaiah等，1991，supra)。另外，Brasseur已经指出少于180°的疏水角(pho角)是最佳脂质-载脂蛋白复合物的稳定性所需要的，并还解释在脂双层的边缘周围具有肽的饼状颗粒的形成(Brasseur，1991，J.Biol.Chem.66(24)16120-16127)。Rosseneu等还强调少于180°的疏水角是LCAT活化所需要的(WO 93/25581)。
然而，尽管在阐明设计ApoA-I激动剂的“规则”中存在进展，到目前为止，报道的最好的ApoA-I激动剂具有少于40％的完整ApoA-I的活性。文献中描述的肽激动剂没有被证实作为药物是有用的。因此，需要开发模拟ApoA-I的活性并且相对简单和生产经济的稳定分子。优选地，候选分子将调节间接和直接的RCT。这些分子将比现存的肽激动剂更小，并具有更宽的功能范围。然而，尚没有充分阐明设计RCT有效介质的“规则”并且尚不知道设计具有ApoA-I功能的有机分子的原理。
发明概述公开了一种反向胆固醇转运的介质，其包含下面的结构 其中A、B和C可以是处于任何顺序，并且其中A包含酸性氨基酸或其生物电子等排体；B包含芳族或亲脂性氨基酸或其类似物；并且C包含碱性氨基酸或其生物电子等排体，其中A或C中的至少一个包含其生物电子等排体。
在一个实施方案中，A或C中只有一个包含分子生物电子等排体。可以从未衍生化的氨基或羧基末端的氨基酸上除去α氨基或α羧基。
在另一个实施方案中，如果存在，来自氨基末端的α氨基可以用保护基加帽，所述的保护基选自由以下组成的组甲酰基、乙酰基、苯乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基(pivolyl)、9-芴基甲氧基羰基、2-萘酸、烟酸、其中n范围为1-20的CH3-(CH2)n-CO-、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、和取代的饱和的杂芳基。
在另一个实施方案中，如果存在，来自羧基末端的α羧基可以用保护基加帽，所述的保护基选自由以下组成的组胺如其中R＝H的RNH2、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、和取代的饱和的杂芳基。
酸性基团的生物电子等排体可以选自由以下组成的组
碱性基团的生物电子等排体可以选自由以下组成的组
A的生物电子等排体可以选自由以下组成的组
C的生物电子等排体可以选自由以下组成的组
所述的介质选自由以下组成的组 其中R为H、甲基、环烷基(C3-C7)，并且n＝1-10
其中R为H、甲基、环烷基(C3-C7)，并且n＝1-10 在优选的实施方案中，所述的介质可以选自由以下组成的组BenOMe-bip-苯胺、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(亚戊基(pentamethylene))丁酸、4-((S)-1-(4-胍基苯氨羰基)-2-(联苯基)乙基氨基甲酰基)苯甲酸、3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸，和4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸。
在其它优选的实施方案中，所述的介质可以选自4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸或4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸。
优选实施方案详述优选实施方案中RCT的介质模拟ApoA-I的功能和活性。在广泛的方面中，这些介质是包含三个域，酸性域、亲脂(例如芳族的)域、和碱性域的分子。所述分子优选含有带正电荷的域、带负电荷的域、和不带电的亲脂域。关于彼此域的位置可以在分子之间不同；因而，在优选实施方案中，不管每一个分子内部三个域的相对位置，所述分子介导RCT。而在一些优选实施方案中，分子模板或模型包含酸性氨基酸来源的残基、亲脂氨基酸来源的残基、和碱性氨基酸来源的残基，以任何顺序连接而形成RCT的介质，在其它的优选实施方案中，所述分子模型可以通过具有酸性、亲脂的和碱性域的单个残基来体现，例如，氨基酸，苯丙氨酸。
在一些优选实施方案中，所述RCT的分子介质通过提高直接的和/或间接的RCT途径(即，增加胆固醇的流出量)、活化LCAT的能力、和增加血清HDL浓度的能力而共享减少血清胆固醇的共同方面。
反向胆固醇运输的介质优选包含最多三个氨基酸残基、其生物电子等排体或含有碱性基、酸性基和亲脂基的任何非肽化合物。序列可以包括X1-X2-X3、X1-X2-Y3、Y1-X2-X3、或Y1-X2-Y3，其中X1是酸性氨基酸或其生物电子等排体；X2是芳族或亲脂性氨基酸或其类似物；X3是碱性氨基酸或其生物电子等排体；Y1是不含α氨基的氨基酸残基或其生物电子等排体；和Y3是不含α羧基的碱性氨基酸类或其生物电子等排体。氨基或羧基末端中的至少一个包含酸性或碱性氨基酸的生物电子等排体。当所述氨基末端上的α氨基存在时，它可以包含第一保护基，并且当羧基末端上的α羧基存在时，它可以包含第二保护基。优选所述第一和第二保护基独立地选自由以下组成的组甲酰基、乙酰基、苯乙酰基、苄基、新戊酰基(pivolyl)、2-萘酸、烟酸、其中n范围为1-20的CH3-(CH2)n-CO-、和乙酰基、苯乙酰基的酰胺，二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。C-末端要以被以下基团加帽胺如其中R＝H的RNH2、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。所述序列可以以任何和全部可能方式聚集而提供保持所述分子模型的基本特征的化合物。
在另一个实施方案中，所述介质可被结合到更大的实体中，例如约1至10个氨基酸的肽、或分子。
这里所用的术语“生物电子等排体”、“生物电子等排替换”、“生物电子等排性”及紧密相关的术语具有与本领域中一般公认的那些相同的含义。生物电子等排体是原子、离子、或者分子，其中电子的周围层可以被认为是相同的。术语生物电子等排体通常用于表示全部分子的一部分，与全部分子自身相反。生物电子等排替换涉及使用一种生物电子等排体以替换另一种，预期维持或稍微修饰所述第一生物电子等排体的生物活性。因而，这种情况下的生物电子等排体是具有相似大小、形状和电子密度的原子或原子团。由于合理的预期，即提出的生物电子等排替换将导致相似生物性质的保持，而产生生物电子等排性。这样的合理预期也可仅基于结构相似性。关于受体等的特征域，在已知大量细节的那些情况下这是特别正确的，所述特征域涉及生物电子等排体以某种方式结合到那里或者其在所述生物电子等排体上起作用。
羧酸的生物电子等排体和胍基的实例表示如下。
羧酸生物电子等排体(R＝H/烷基)
胍生物电子等排体(R＝H/烷基) 如这里所用，术语“氨基酸”也可以指的是通式NH2-CHR-COOH的分子或者在含有母体氨基酸(parent amino acid)的肽内部的残基，其中“R”是大量不同侧链之一。“R”可以指的是二十种遗传编码氨基酸之一的取代基。“R”也可以指的是不属于二十种遗传编码氨基酸之一的取代基。如这里所用，术语“氨基酸残基”指的是当它结合到另一种氨基酸时在失去水分子后保留的氨基酸部分。如这里所用，术语“氨基酸类似物”指的是氨基酸母体化合物的结构衍生物，其区别于它至少一个元件(element)。术语“修饰的氨基酸”指的是含有“R”取代基的氨基酸，所述的“R”取代基不对应于二十种遗传编码氨基酸之一。
氨基末端和羧基末端上的保护基独立地选自由以下组成的组甲酰基、乙酰基、苯乙酰基、新戊酰基(pivolyl)、2-萘酸、烟酸、其中n范围为1-20的CH3-(CH2)n-CO-、和乙酰基、苯乙酰基的酰胺，二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。C-末端可以被以下基团加帽胺如RNH2，其中R＝H、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。
某些化合物可以以互变异构形式存在。通过实施方案包含所有这样的包括非对映异构体和对映异构体的同分异构体。假设某些化合物或者以同分异构形式或其混合物形式存在。
某些化合物可以以多晶型的形式存在。多晶型性是由于以至少两种不同形式的化合物结晶而产生的。通过实施方案包含所有这样的多晶形物。假设所述某些化合物以某种多晶形物或其混合物形式存在。
RCT介导至今，设计ApoA-I激动药的努力集中在22聚物单元结构，例如Anantharamaiah等，1990，Arteriosclerosis 10(1)95-105；Venkatachalapathi等，1991，Mol.Conformation and Biol.Interactions，Indian Acad.Sci.B585-596的“共有22聚物”，其能够在脂质存在下形成两亲性α-螺旋(参见例如美国专利号6,376,464，其涉及从原子共有22聚物修饰得到的肽模拟物)。相比于较长的22聚物，利用这样相对短的肽有一些优势。例如，较短的RCT介质更容易并且更低成本地生产，它们在化学上和构象上更稳定，优选的构象保持相对刚性，在所述肽链内部有很少的或者没有分子内相互作用，并且越短的肽表现越高程度的口服可用性。这些较短肽的多拷贝可以结合到HDL或LDL，产生更受限制的大肽的相同效果。虽然ApoA-I多功能性可以基于它的多α-螺旋域的贡献，但是即使ApoA-I的单功能，例如LCAT活化，可以通过多于一个α-螺旋域在重复方式中作为媒介也是可能的。这样，在本发明的优选方面中，ApoA-I的多功能可以被指向单子域的公开的RCT介质模拟。
ApoA-I的三个功能性特征被广泛接受为ApoA-I激动剂设计用的主要标准(1)与磷脂缔合的能力；(2)活化LCAT的能力；和(3)促进胆固醇流出细胞的能力。根据优选实施方案的一些方式，RCT分子介质可以仅表现所述最后的功能性特征-提高RCT的能力。然而，经常被忽视的相当多的ApoA-I其它性质使ApoA-I成为特别有吸引力的用于治疗介入的目标。例如，ApoA-I经由受体-介导的过程指导胆固醇流量进入肝脏并且经由PLTP驱动的反应调整前-β-HDL(来自周围组织胆固醇的主受体)的生产。然而，这些特征使ApoA-I模拟分子的潜在有用性拓宽。这个为了考察ApoA-I模拟功能的全新方法将使用这里所公开的肽或氨基酸来源的小分子，以促进直接的RCT(经由HDL途径)，也促进间接的RCT(即，通过更改它们到肝脏的流向，将LDLs从循环中截取或清除)。为了能够提高间接的RCT，优选实施方案的分子介质将优选能够与磷脂缔合并且结合到肝脏(即，充当肝脏脂蛋白结合位点的配体)。
因而，导致优选实施方案的研究努力的目标是识别、设计、和合成稳定的RCT小分子介质，其表现优先的脂结合构象、通过促进直接的和/或间接的反向胆固醇运输增加胆固醇到肝脏的流量、改善血浆脂蛋白轮廓(profile)、并且随后防止动脉粥样硬化损害的进行或/和甚至促进动脉粥样硬化损害的消退。
所述优选实施方案的RCT介质可以以稳定的大批或单位剂量形式制备，例如，可以在体内使用之前重建或者再配制的冻干产品。所述优选实施方案包括在高脂血症、高胆固醇血症、冠心病、动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、早老性痴呆、多发性硬化、涉及高脂血症的病症例如炎症、和其它病症例如引起脓毒性休克的内毒素血症的治疗中的药物剂型和这种制剂的使用。
通过展示RCT介质与血浆的HDL、和LDL组分缔合并且能增加HDL和前-β-HDL颗粒浓度并且降低LDL血浆水平的工作实例，说明了优选实施方案。这样促进了直接的和间接的RCT。在人的肝细胞(HepG2细胞)中，优选实施方案的RCT介质增加了人LDL介导的胆固醇积累。RCT介质在活化PLTP方面也是有效的并因而促进前-β-HDL粒子的形成。HDL胆固醇的增加作为所述RCT中LCAT参与(未直接显示LCAT活化(体外))的间接证据。在动物模型中，优选实施方案的RCT介质的使用导致血清HDL浓度的增加。
在下面的小节中，更详细地陈述了优选实施方案，它描述了RCT介质的组成和结构，包括可以在RCT介质的结构中使用的生物电子等排体，被保护型、半剥裸型及其剥裸(denuded)型；结构和功能表征；大批或单位剂量配方的制备方法；和使用方法。
结构和功能优选实施方案的RCT介质通常是模拟ApoA-I活性的肽或其类似物。在一些实施方案中，用取代的酰胺、酰胺的电子等排体或酰胺模拟物(amidemimetic)替代所述肽中的至少一个酰胺键。另外，一种或多种酰胺键可以用不显著干涉所述肽的结构或活性的肽模拟部分或酰胺模拟部分替代。例如，在Olson等，1993，J.Med.Chem.363039-3049中描述了适合的酰胺模拟部分。
用于本文时，遗传编码的L-对映体氨基酸的缩写是常规的并且如下以小写字母指示D-氨基酸，例如，D-丙氨酸＝a，等。
表1
RCT的肽介质中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基所取代，而不会对所述肽的活性有显著不利影响，并在许多情况中甚至增加所述肽的活性。因此，优选实施方案还预期RCT的肽介质的改变或突变形式，在所述改变或突变形式中，结构中的至少一个限定的氨基酸残基被另一个氨基酸残基或其衍生物和/或类似物所取代。将认识到的是在优选实施方案中，氨基酸的取代是保守的，即，取代的氨基酸残基具有类似于被取代的氨基酸残基的物理和化学特性。
出于确定保守氨基酸残基取代的目的，可以将氨基酸方便地分成两个主要类别主要基于氨基酸侧链的物理-化学特性的亲水的和疏水的。可将这两个主要类别进一步分成更清楚定义氨基酸侧链特征的亚类。例如，可以将亲水性氨基酸类别进一步细分成酸性、碱性和极性氨基酸。可以将疏水性氨基酸类别进一步细分成非极性和芳香族氨基酸。限定ApoA-I的各种氨基酸类别如下进行定义术语“亲水性氨基酸”指按照Eisenberg等，1984，J.Mol.Biol.179125-142的标准化公认疏水性等级显示疏水性少于0的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸包括苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)和精氨酸(R)。
术语“疏水性氨基酸”指按照Eisenberg等，1984，J.Mol.Biol.179125-142的标准化公认疏水性等级显示疏水性大于0的氨基酸。遗传编码的疏水性氨基酸包括脯氨酸(P)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)。
术语“酸性氨基酸”指侧链pK值小于7的亲水性氨基酸。由于氢离子丢失，酸性氨基酸典型地在生理pH下具有带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)。
术语“碱性氨基酸”指侧链的pK值大于7的亲水性氨基酸。由于与水合氢离子相关，碱性氨基酸典型地在生理pH下具有带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括组氨酸(H)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)。
术语“极性氨基酸”指一种亲水性氨基酸，其在生理pH下具有不带电的侧链，但具有至少一个键，在所述键中被两个原子共享的一对电子被其中一个原子更紧密地拥有。遗传编码的极性氨基酸包括天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
术语“非极性氨基酸”指一种疏水性氨基酸，其在生理pH下具有不带电的侧链，并具有其中被两个原子共享的一对电子通常被两个原子的每个相同地拥有的键(即，侧链是非极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包括亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)。
术语“芳香族氨基酸”指具有带有至少一个芳香族或杂芳香族的环的侧链的疏水性氨基酸。芳香族或杂芳香族的环可以包含一个或多个取代基诸如-OH，-SH，-CN，-F，-Cl，-Br，-I，-NO2，-NO，-NH2，-NHR，-NRR，-C(O)R，-C(O)OH，-C(O)OR，-C(O)NH2，-C(O)NHR，-C(O)NRR等，其中每个R独立地是(C1-C6)烷基，取代的(C1-C6)烷基，(C1-C6)链烯基，取代的(C1-C6)链烯基，(C1-C6)炔基，取代的(C1-C6)炔基，(C5-C20)芳基，取代的(C5-C20)芳基，(C6-C26)烷芳基，取代的(C6-C26)烷芳基，5-20元的杂芳基，取代的5-20元的杂芳基，6-26元的烷杂芳基(alkheteroaryl)或取代的6-26元烷杂芳基。遗传编码的芳香族氨基酸包括苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。
术语“脂族氨基酸”指具有脂族烃侧链的疏水性氨基酸。遗传编码的脂族氨基酸包括丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)。
氨基酸残基半胱氨酸(C)是独特的，原因在于其可以与其它半胱氨酸(C)残基或其它含硫烷基的氨基酸形成二硫键。半胱氨酸(C)残基(和其它具有含-SH的侧链的氨基酸)以还原的游离-SH或是氧化的二硫键形式存在于肽中的能力影响半胱氨酸(C)残基贡献给肽净疏水还是亲水特征。尽管按照Eisenberg(Eisenberg，1984，supra)的标准化公认疏水性等级，半胱氨酸(C)显示0.29的疏水性，要理解的是尽管上面详细说明了一般分类，出于本发明的目的，将半胱氨酸(C)归类为极性亲水氨基酸。
如本领域那些技术人员将理解的，上述类别不是彼此排斥的。因此可以将具有显示两种或更多种物理-化学特性的侧链的氨基酸包括在多个类别中。例如，具有进一步被极性取代基取代的芳香族部分的氨基酸侧链，诸如酪氨酸(Y)，可以显示芳香族疏水特性和极性或亲水特性，因此可被包括在芳香族和极性类别中。任何氨基酸的合适分类对于那些本领域技术人员是显而易见的，特别是根据本文提供的详细说明书。
尽管上述定义的类别已经在遗传编码的氨基酸方面得到例证，氨基酸取代不需，并在某些实施方案中优选地不限于遗传编码的氨基酸。确实，RCT的许多优选的肽介质包含遗传非编码的氨基酸。因此，除天然存在的遗传编码氨基酸外，RCT的肽介质中的氨基酸残基可以由天然存在的非编码氨基酸和合成氨基酸所取代。
提供RCT的肽介质的有用取代的某些常见氨基酸包括，但不限于β-丙氨酸(β-Ala)和其它ω-氨基酸诸如3-氨基丙酸，2，3-二氨基丙酸(Dpr)，4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基已酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；t-丁基丙氨酸(t-BuA)；t-丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环已基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；萘基丙氨酸(Nal)；4-苯基苯丙氨酸，4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2，4-二氨基丁酸(Dbu)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；p-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)，高苯丙氨酸(hPhe)；和高丝氨酸(hSer)；羟脯氨酸(Hyp)，高脯氨酸(hPro)，N-甲基化的氨基酸和类肽(peptoids)(N-取代的甘氨酸)。
可以将本文没有具体提及的其它氨基酸残基容易地基于它们根据本文提供的定义被观察到的物理和化学性质进行分类。
可以将按照上面定义的类别的遗传编码的氨基酸和常见的非编码氨基酸的分类总结于下面的表2中。要理解的是表2仅出于举例说明的目的而不是可用于取代本文所述的RCT的肽介质的氨基酸残基和衍生物的全部的列表。
表2 常见氨基酸的分类
可以将本文没有具体提及的其它氨基酸残基容易地基于它们根据本文提供的定义被观察到的物理和化学性质进行分类。
尽管在大多数情况中，RCT的肽介质的氨基酸将被D-对映体氨基酸所取代，取代不限于D-对映体氨基酸。因此，包括在“突变”或“改变”形式定义中的还有那些取代，其中D-氨基酸被相同的L-氨基酸所取代(例如，D-精氨酸→L-精氨酸)或被相同类或亚类的L-氨基酸所取代(D-精氨酸D-赖氨酸)，反之亦然。肽可以有利地由至少一个D-对映体的氨基酸组成。认为与全部由L-氨基酸组成的肽相比，包含这些D-氨基酸的肽对于在口腔、肠或血清中的降解更稳定。
接头RCT的肽介质可以以头-尾方式(即，N-端到C-端)，头-头方式，(即N端-N端)、尾-尾方式(即，C端-C端)，或其组合进行连接或连结。接头LL可以是能够将两个肽彼此共价连接的任何双功能分子。因此，合适的接头是其中官能团能共价连接于肽的N-和/或C-端的双功能分子。适合于附着肽的N-或C-端的官能团是本领域众所周知的，影响这种共价键形成的合适的化学原理(chemistries)也是如此。
充分长度和柔性的接头包括但不限于Pro(P)、Gly(G)、Cys-Cys、Gly-Gly、H2N-(CH2)n-COOH，其中n是1至12，优选4至6；H2N-芳基-COOH和糖类。然而，在一些实施方案中，单独的接头在本质上是完全不能使用的。作为替代，酸性、亲脂性和碱性部分全部都是单分子的部分。
在一个优选实施方案中，有包括基于氨基酸的组合物的分子，所述组合物具有三个独立的区域酸性区域、芳族区域或亲脂性区域，和碱性区域。关于彼此的区域的相对定位可以在分子介质之间变化；不管这三个区域在每个分子中的位置，所述分子介导RCT。三聚体区肽可以由天然D-或L-氨基酸、氨基酸类似物，和氨基酸衍生物组成。
在另一个优选变化中，包括基于氨基酸的三聚体结构的分子介质可任选地在任一端被氨基或羧基末端上的一个或多个亲脂性基团加帽，从而提高RCT的分子介质的物理化学特性，并利用脂肪或亲脂性物质的天然或主动转运(吸收)系统到体内。加帽的基团可以是D或L对映体或非-对映体的分子或基团。在优选的实施方案中，N-末端基团选自由下列组成的组甲酰基、乙酰基、苯乙酰基、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。C-末端优选由以下基团加帽胺如RNH2，其中R＝H、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。
在RCT介质的结构内使用的生物电子等排体可以在优选的RCT介质中使用的优选的分子生物电子等排体的实例示于下面。含有胍鎓或脒基的生物电子等排体用来取代氨基酸，如精氨酸。含有羧酸的生物电子等排体用来取代氨基酸，如谷氨酸。预期用来取代碱性氨基酸，精氨酸、赖氨酸或组氨酸和酸性氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸的任何其它生物电子等排体。圆表示无环或环状结构，包括非芳香和芳香结构。
RCT介质的优选分子生物电子等排体型式的实例示于下面。
生物电子等排体系列L-氨基酸序列D-氨基酸序列 结构和功能分析可对包括上述多聚体形式的优选实施方案的RCT的介质的结构和功能进行测定从而选择活性化合物。例如，可以测定肽或肽类似物它们结合脂质、与脂质形成复合物、活化LCAT和促进胆固醇流出等的能力。
分析肽的结构和/或功能的方法和试验是本领域众所周知的。下文以工作实施例提供了优选的方法。例如，可以将下文描述的核磁共振(NMR)测定用于分析肽或肽类似物的结构--具体地，存在脂质时螺旋性的程度。使用下文所述的荧光光谱测定可以确定结合脂质的能力。可以使用下文所述的LCAT活化可容易地确定肽和/或肽类似物活化LCAT的能力。可以将下文所述的体外和体内测定用于评价半衰期、分布、胆固醇流出和对RCT的影响。
在另一个优选实施方案中，有包括基于氨基酸的组合物的分子，所述组合物具有三个独立的区域酸性区域、芳族区域或亲脂性区域，和碱性区域。关于彼此的区域的相对定位可以在分子介质之间变化；不管这三个区域在每个分子中的位置，所述分子介导RCT。
在另一个优选实施方案中，三聚体的芳香族区域可以由具有一个或多个酸性或碱性侧链的烟酸组成。
在另一个优选实施方案中，三聚体的芳香族区域可以由4-苯基苯丙氨酸组成。
用于遗传编码的氨基酸的D-对映体的缩写是表1中所示的单字母符号的小写字母等价物。例如，“R”指L-精氨酸并且“r”指D-精氨酸。除非另外指出(例如“OH”)，N-端是乙酰化了的并且C-端是酰胺化的。PhAc指苯基乙酰化了的；并且BIP指联苯基丙氨酸。
氨基酸取代不必，并在某些实施方案中优选地不局限于遗传编码的氨基酸。因此，除了天然存在的遗传编码的氨基酸之外，RCT的肽介质中的氨基酸残基可以被天然存在的非编码氨基酸和合成氨基酸取代。
优选的介质在优选的实施方案中，介质可以选自由以下组成的组BenOMe-bip-苯胺、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(亚戊基)丁酸、4-((S)-1-(4-胍基苯氨羰基)-2-(联苯基)乙基氨基甲酰基)苯甲酸、3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸、和4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸。
合成方法可使用实际上本领域-已知的任何制备肽的技术来制备优选实施方案的介质。例如，可以使用常规分步溶解或固相肽合成来制备肽。
使用常规的分步溶解或固相合成(见，例如Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins，Williams等，Eds.，1997，CRC Press，Boca Raton Fla.，和其中引用的参考文献；Solid Phase Peptide SynthesisAPractical Approach，Atherton & Sheppard，Eds.，1989，IRL Press，Oxford，England，和其中引用的参考文献)来制备RCT介质。
在常规固相合成中，第一个氨基酸的连接在化学上需要使其羧基端(C-端)末端与衍生化的树脂反应从而形成寡肽的羧基-端末端。氨基酸的α-氨基末端典型地由t-丁氧基-羰基基团(t-Boc)或9-芴基甲基氧基羰基(F-Moc)基团封闭从而阻止能够另外反应的氨基基团参与偶联反应。氨基酸的侧链基团，如果是反应性的，也被各种醚、硫醚、酯和氨基甲酸酯形式的苄基衍生的保护基所封闭(或被保护)。
接下来的步骤和随后的重复循环包括对氨基-末端(N-端)树脂结合的氨基酸(或肽链的末端残基)进行解封闭从而去除α-氨基封闭基团，随后化学添加(偶联)下一封闭的氨基酸。然而，该方法被重复很多个循环，所述循环对于合成完整目标肽链所需要的。在偶联和解封闭步骤的每个后，将树脂结合肽彻底洗去以在继续进行下面的(步骤)之前去除任何残余的反应物。固体支持颗粒在任何给定的步骤促进去除试剂，因为当被保持在具有多孔开口的柱或装置上时，可以容易地过滤和洗涤树脂和树脂-结合肽。
通过酸催化(典型地用氢氟酸或三氟乙酸)，合成肽可以从树脂上释放下来，所述酸催化将肽从树脂上裂解下来，将酰胺或羧基基团留在其C-末端氨基酸上。酸解裂解还在肽的合成中用于从氨基酸的侧链上去除保护基。然后可以通过各种层析法的任何一个将得到的肽进行纯化。
按照一个优选的实施方案，用Na-Fmoc化学通过固相合成方法来合成RCT的肽和肽衍生物介质。Na-Fmoc保护氨基酸和Rink酰胺MBHA树脂获自Novabiochem(San Diego，CA)或Chem-Impex Intl(Wood Dale，IL)，并且Sasrin树脂购自Aldrich(Milwaukee，WI)。其它的化学品和溶剂购自如下来源三氟乙酸(TFA)、茴香醚、1，2-乙二硫醇(1，2-ethanedithiol)、茴香硫醚、哌啶、乙酸酐、2-萘酸和新戊酸(Pivaloic acid)(Aldrich，Milwaukee，WI)，HOBt和NMP(Chem-Impex Intl，Wood Dale，IL)，二氯甲烷、甲醇和HPLC级溶剂获自Fischer Scientific，Pittsburgh，PA。通过LC/MS检查肽的纯度。使用在C18-结合的硅胶柱(Tosoh Biospec制备柱，ODS-80TM，Dim215mm×30cm)上的制备HPLC系统(Agilent technologies，1100Series)实现肽的纯化。使用梯度系统[50％-90％的B溶剂(具有0.1％的TFA的乙腈∶水60∶40)洗脱肽。
使用Rink酰胺MBHA树脂(0.5-0.66mmol/g)或Sasrin树脂(0.6-1.1mmol/g)通过固相方法以分步方式合成所有的肽。侧链的保护基是Arg(Pbf)、Glu(OtBu)和Asp(OtBu)。使用1.5-3倍过量的保护氨基酸，使每个Fmoc保护的氨基酸与该树脂偶联。偶联试剂是N-羟基苯并三唑(HOBt)和二异丙基碳二亚胺(DIC)，并且通过水合茚三酮试验监测偶联。用在NMP中的20％哌啶30-60分钟处理去除Fmoc基团，然后用CH2Cl2、在CH2Cl2中的10％TEA、甲醇和CH2Cl2连续洗涤。偶联步骤后，进行乙酰化作用或如果需要使用其它的加帽基团。
使用TFA、茴香硫醚、乙二硫醇和茴香醚(90∶5∶3∶2，v/v)(4-5小时于室温)的混合物将肽从肽-树脂上裂解下来并去除所有的侧链保护基。将粗肽混和物从烧结的漏斗中过滤，用TFA洗涤它(2-3次)。将过滤物浓缩为稠浆，并加入到冷醚中。在冷藏箱中保持过夜并离心后，肽沉淀为白色固体。将溶液倾去并用醚彻底洗涤所述固体。将得到的粗肽溶解在缓冲液(具有0.1％TFA的乙腈∶水60∶40)中并进行干燥。使用具有50-90％B的梯度系统的制备C-18柱(反相)通过HPLC在40分钟内纯化粗肽[缓冲液A包含0.1％(v/v)TFA的水，缓冲液B包含0.1％(v/v)TFA的乙腈∶水(60∶40)]。在Speedvac上浓缩纯化级分。产率5％变化到20％。
备选地，优选实施方案的肽可以通过链段缩合的方式进行制备，即将小组成肽链连接在一起形成更大的肽链，如，例如描述于Liu等，1996，Tetrahedron Lett.37(7)933-936；Baca等，1995，J.Am.Chem.Soc.1171881-1887；Tam等，1995，Int.J.Peptide Protein Res.45209-216；Schnolzer and Kent，1992，Science 256221-225；Liu and Tam，1994，J.Am.Chem.Soc.116(10)4149-4153；Liu and Tam，1994，PNAS USA 916584-6588Yamashiro and Li，1988，Int.J.Peptide Protein Res.31322-334；Nakagawa等，1985，J.Am Chem.Soc.1077087-7083；Nokihara等，1989，Peptides 1988166-168；Kneib-Cordonnier等，1990，Int.J.Pept.Protein Res.35527-538；将它们说明书全文全部内容并入此作为参考)中。其它用于合成优选实施方案的肽的方法描述在Nakagawa等，1985，J.Am.Chem.Soc.1077087-7092。
对于通过链段缩合制备的肽，缩合步骤的偶联效率可以通过增加偶联时间而明显增加。典型地，增加偶联时间导致产物外消旋作用的增加(Sieber等，1970；Helv.ChimActa 532135-2150)。使用有机化学的标准技术，可以对包含N-和/或C-末端封闭基团的RCT的介质进行制备。例如，酰化肽的N-末端或酰胺化或酯化肽的C-末端的方法是本领域众所周知的。在N-和/或C-端进行其它修饰的方式将对于本领域那些技术人员是显而易见的，如保护任何侧链官能度可能对于连接末端封闭基团是必须的一样。
同样地，例如，对于肽的N-末端或肽的C-末端上的保护基去保护的方法在本领域中是众所周知的。在N-和/或C-末端进行其它修饰的方法，如除去末端保护基所必需的任何侧链官能度的去保护方法一样，对于本领域技术人员是明显的。
制药上可接受的盐(抗衡离子)可以通过离子交换色谱或其它本领域众所周知的方法常规地制备。
在RCT介质的结构内使用的生物电子等排体下面的合成方案是可以用来合成带有生物电子等排体的RCT介质的方法的实例。
方案1
方案2 方案3
方案4 药剂剂型和治疗方法可以将优选实施方案的RCT介质用于治疗动物特别是包括人的哺乳动物中的任何疾病，对于所述动物降低血清胆固醇是有益的，所述疾病包括，但不限于其中增加血清HDL浓度、活化LCAT和促进胆固醇流出以及RCT是有利的疾病。这些疾病包括，但不限于高脂血，尤其是高胆固醇血症，和心血管疾病诸如动脉粥样硬化(包括动脉粥样硬化的治疗和预防)以及冠状动脉疾病；再狭窄(例如，预防或治疗作为医疗方法诸如气囊血管成形术的结果形成的动脉粥样斑块)；以及经常导致败血症性休克的其它疾病，诸如局部缺血，和内毒素血症。可以将RCT的介质单独使用或用在与其它用于治疗前述疾病的药物的联合疗法中。这些疗法包括，但不限于，同时或顺序使用涉及的药物。
例如，在治疗高胆固醇血症或动脉粥样硬化中，可以将RCT的分子介质的制剂与目前使用的任何一种或多种降低胆固醇疗法一起施用；例如，胆汁-酸树脂，烟酸和/或抑制素。这种联合治疗方案可以产生特别有利的治疗效应，因为每种药物作用在胆固醇合成和转运的不同目标上发挥作用；即，胆汁-酸树脂影响胆固醇再循环、乳糜微粒和LDL群体(poplulation)；烟酸主要影响VLDL和LDL群体；抑制素抑制胆固醇合成，减少LDL群体(也许增加LDL受体表达)；而RCT的介质影响RCT，增加HDL，增加LCAT活性并促进胆固醇的流出。
RCT的介质可与fibrates结合使用以治疗高脂血症、高胆固醇血症和/或心血管疾病诸如动脉粥样硬化。
RCT的介质可以与目前使用的抗菌剂和抗炎药结合使用以治疗内毒素诱导的败血症性休克。
可以将RCT的介质配制为基于分子的组合物或分子-脂质复合物，所述基于分子的组合物或分子-脂质复合物可以以多种方式，优选地通过口服给药，施用给受试者以将RCT的介质传递到循环中。下面描述示例性制剂和治疗方案。
在另一个优选的实施方案中，提供用于改善和/或预防高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的一个或多个症状的方法。所述方法优选地包括将优选实施方案的一种或多种化合物(或这些化合物的模拟物)施用给生物体，优选地，哺乳动物，更优选地人。如本文所述，可以按照许多标准方法的任一个施用所述的一种或多种化合物，所述方法包括，但不限于注射剂、栓剂、鼻腔喷雾剂、定时释放植入物、透皮贴片等。在一个特别优选的实施方案中，将所述的一种或多种化合物口服施用(例如，作为糖浆、胶囊或片剂)。
所述方法包括施用优选实施方案的单一化合物或施用两种或更多种不同的的化合物。可以将化合物提供为单体或二聚的、低聚的或聚合的形式。在某些实施方案中，多聚体形式可以包括缔合单体(例如离子或疏水性连接)而某些其它多聚体形式包括共价连接的单体(直接连接或通过接头)。
尽管对优选实施方案进行的描述是关于在人中的使用，其还适合于动物，例如兽医的应用。因此，优选的生物体包括，但不限于，人，非-人灵长类、犬、马、猫、猪、有蹄类动物(ungulates)、largomorphs等。
优选实施方案的方法不限于显示高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的一个或多个症状(例如，高血压、斑块形成和破裂，临床事件诸如心脏病发作(heart attack)的减少，绞痛，或中风，高水平的低密度脂蛋白，高水平的极低密度脂蛋白，或炎性蛋白质等)的人或非人动物，而且在预防性情况下是有用的。因此，可以将优选实施方案的化合物(或其模拟物)施用给生物以预防高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的一个或多个症状的发作/发展。关于这点特别优选的受试者是显示动脉粥样硬化的一个或多个风险因子(例如，家族史，高血压，肥胖症，高酒精消费，吸烟，高血液胆固醇，高血液三酰甘油，升高的血液LDL、VLDL、IDL，或低HDL，糖尿病，或糖尿病的家族史，高血液脂质，心脏病发作，绞痛或中风等)的受试者。优选的实施方案包括在治疗高脂血症、高胆固醇血症、冠心病、动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、早老性痴呆、多发性硬化、涉及高脂血症的病症例如炎症、和其它病症例如引起感染性休克的内毒素血症中的药物剂型和这种制剂的应用。
在一个优选的实施方案中，使用在涉及RCT的介质的合成和纯化的前面部分中所述的任何技术，可以合成或制备RCT的分子介质。通过冷冻干燥该化合物-从而制备再形成的批量(bulk)或制备可以通过在施用给受试者之前，用灭菌水或合适的灭菌缓冲溶液通过再次水合而重构的个体等分试样或剂量单位，可以制备具有长保存限期的稳定制剂。
在另一个优选的实施方案中，可以在分子-脂质复合物中配制和施用RCT的介质。该方法具有一些优势，因为所述复合物在循环中应具有增加的半衰期，特别是当复合物具有与HDL，尤其是前-β-1或前-β-2 HDL群体相似的大小和密度时。可以通过下面所述的许多方法的任一个方便地制备分子-脂质复合物。可以通过冷冻干燥-下面描述的作为优选方法的共冷冻干燥方法制备具有长保存期限的稳定制剂。可以将冻干的分子-脂质复合物用于制备药物再形成(pharmaceutical reformulation)的批量，或用于制备可以通过在施用给受试者前用灭菌水或合适的缓冲溶液通过再次水合而重构的个体等分试样或剂量单位。
可以将本领域技术人员众所周知的多种方法用于制备分子-脂质小泡或复合物。为此目的，可以使用许多可供制备脂质体或脂蛋白体的技术。例如，可以用合适的脂质对化合物进行共超声波(cosonicated)(使用水浴或探针超声波仪)从而形成复合物。或者，所述化合物可以与预先形成的脂质小泡结合，导致分子-脂质复合物的自发形成。在另一个备选方法中，可以通过去污剂透析方法形成分子-脂质复合物；例如，将化合物、脂质和去污剂的混合物进行透析从而去除去污剂并重构或形成分子-脂质复合物(例如，见Jonas等，1986，Methods in Enzymol.128553-582)。
尽管前述方法是可行的，在费用、产量、再现性和安全性方面，每种方法有其自己特殊的生产问题。按照一种优选的方法，将化合物和脂质在一种溶剂体系中进行结合，所述溶剂系统共溶解每种成分并可通过冷冻干燥彻底去除。为此目的，应仔细选择溶剂对以确保两亲性化合物和脂质的共溶解。在一个实施方案中，可以将结合到颗粒中的一种或多种化合物或其衍生物/类似物溶解在水性或有机溶剂或溶剂(溶剂1)的混合物中。将(二氧磷基)脂成分溶解在水性或有机溶剂或可与溶剂1混溶的溶剂(溶剂2)的混合物中，并将两种溶液混和。或者，可以将化合物和脂质结合在共溶剂体系中；即可混溶的溶剂的混合物。化合物与脂质的合适比例首先根据经验确定从而使得到的复合物具有合适的物理和化学特性；即通常(但不是必需)在大小上与HDL相似。将得到的混合物冷冻并冻干至干燥。有时，必须将另外的溶剂加入混合物中以促进冷冻干燥。该冻干产物可以储存长时间并将保持稳定。
可以将冻干的产物重构从而获得分子-脂质复合物的溶液或混悬液。为此目的，可以用水溶液将冻干的粉末再水合到合适的体积(经常是方便于静脉内注射的5mgs化合物/ml)。在一个优选的实施方案中，用磷酸盐缓冲溶液或生理盐水溶液将冻干的粉末进行再水合。必须将所述混合物进行搅拌或涡流以促进再水合，并在大多数情况中，应在等于或大于复合物的脂质成分的相变温度的温度下进行重构步骤。在数分钟内，得到重构的脂质-蛋白质复合物的清澈制剂。
可以对得到的重构制剂的等分试样进行表征从而证实制剂中的复合物具有所需的大小分布；例如，HDL的大小分布。可以将凝胶过滤层析用于此目的。例如，可以使用Pharmacia Superose 6 FPLC凝胶过滤层析系统。所用的缓冲液包含在50mM，pH7.4的磷酸缓冲液中的150mM NaCl。典型样品体积是20-200微升的包含5mgs化合物/ml的复合物。柱的流动速度是0.5mls/分钟。将一系列已知分子量和Stokes直径的蛋白质以及人HDL优选地用作校准柱的标准。通过波长254或280nm的吸光度或光散射来监测蛋白质和脂蛋白复合物。
优选实施方案的RCT的介质可以与多种脂质复合，所述脂质包括饱和、不饱和、天然和合成脂质和/或磷脂。合适的脂质包括，但不限于，小烷基链磷脂，例如，卵磷脂酰胆碱，大豆磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱，1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱，1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱二油酰磷脂酰乙醇胺，二月桂酰磷脂酰甘油 磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，神经鞘磷脂，神经鞘脂类，磷脂酰甘油，二磷脂酰甘油，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，二棕榈酰磷脂酰甘油，二硬脂酰磷脂酰甘油，二油酰磷脂酰甘油，二肉豆蔻酰磷脂酸，二棕榈酰磷脂酸，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸，二棕榈酰磷脂酰丝氨酸，脑磷脂酰丝氨酸，脑神经鞘磷脂，二棕榈酰神经鞘磷脂，二硬脂酰神经鞘磷脂，磷脂酸，半乳糖脑苷脂，神经节苷脂，脑苷脂，二月桂基磷脂酰胆碱，(1，3)-D-mannosyl-(1，3)甘油二酯，氨基苯基糖苷，3-胆甾烯基-6′-(糖基硫代)己基醚糖脂，和胆固醇及其衍生物。
优选实施方案的药物制剂在适合于体内施用及传递的药用载体中包含作为活性组分的RCT的分子介质或分子-脂质复合物。因为所述化合物可能包含酸性和/或碱性末端和/或侧链，可以将所述化合物以游离酸或碱形式，或以药用盐形式包括在制剂中。
可注射的制剂包括在水性或油性赋形剂中的活性组分的无菌混悬液、溶液或乳状液。所述组合物还可以包含配方剂(formulating agents)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于注射的制剂可以以单位剂型，例如以安瓿或多剂量容器形式存在，并可以包含另外的防腐剂。
或者，可注射的制剂可以以在使用前用合适的赋形剂进行重构的粉末形式进行提供，所述赋形剂包括，但不限于无菌的无热原的水，缓冲液，葡萄糖溶液等。为此目的，可以冻干RCT的介质，或可以制备共-冻干的分子-脂质复合物。可以以单位剂型的形式提供贮存的制剂并在体内使用前进行重构。
对于延长的传递，可以将活性组分配制为通过植入进行施用的长效制剂；例如，皮下、皮内或肌内注射。因此，例如，可以将活性组分与合适的聚合或疏水性材料一起进行配制(例如，作为在可接受的油中的乳状液)或与离子交换树脂一起进行配制，或配制为少量可溶的衍生物；例如。作为RCT的介质的少量可溶的盐形式。
或者，可以使用被生产为缓慢释放活性组分以进行经皮吸收的粘着盘或贴片的透皮传递系统。为此目的，可以使用渗透增强剂以促进活性组分的透皮渗透。可以通过将优选实施方案的RCT的介质或分子-脂质复合物结合到硝化甘油贴片中以使用在患有局部缺血性心脏疾病和高胆固醇血症的患者中以获得特别的益处。
对于口服施用，药物组合物可以采取通过传统方式用药用赋形剂诸如粘合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)进行制备的片剂或胶囊形式。所述片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。进行口服施用的液体制剂可以采用，例如溶液、糖浆或混悬液的形式，或它们可作为在使用前用水或其它合适的赋形剂组构的干燥产品存在。这些液体制剂可以通过常规方法用药用添加剂诸如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性赋形剂(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分级分离的植物油)；和防腐剂(例如，对-羟基苯甲酸甲酯或对-羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)进行制备。所述制剂还可包含合适的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。可以将口服施用的制剂合适地配制以获得活性化合物的控释。
对于颊含施用，所述组合物可以采取以常规方法配制的片剂或锭剂的形式。对于直肠和阴道施用路径，可以将活性组分配制为溶液(对于滞留型灌肠剂)栓剂或软膏剂。
对于通过吸入进行施用，使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，以来自压缩包装或喷雾器的气溶胶喷雾剂形式来方便地传递活性组分。在压缩的气溶胶情形中，可以通过提供阀以传递计量来确定剂量单位。可以配制用在吸气器或吸入器中的例如，明胶的胶囊和药筒，其包含化合物的粉末混合物和合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉。
如果需要，所述组合物可以存在于包装或分配器装置中，其可以包含一个或多个单位剂型，所述剂型包含活性组分。所述包装可以例如，包含金属或塑料箔，诸如泡眼包装。所述包装或分配器可配有施用的说明书。
可以通过确保在循环中的生物利用度的任何合适的路径来施用优选实施方案的RCT的分子介质和/或分子-脂质复合物。这可以通过包括静脉内(IV)、肌内(IM)、皮内、皮下(SC)和腹膜内(IP)注射的施用的肠胃外路径来完成。然而，可以使用其它施用途径。例如，如果将合适的制剂(例如，肠溶包衣)用于避免或最小化活性组分在，例如口腔粘膜、胃和/或小肠的苛刻环境中的降解，经过胃肠道的吸收可以通过施用的口服路径(包括但不限于摄取、颊含和舌下路径)来完成。口服施用具有易于应用和因此提高顺应性的优势。或者，可以将经过粘膜组织的施用诸如阴道和直肠施用方式用于避免或最小化在胃肠道中的降解。在另一个备选方法中，可以将优选实施方案的制剂经过皮肤地(例如，透皮地)，或通过吸入进行施用。将理解的是优选的路径可以随受者的疾病、年龄和顺应性而变化。
所用的RCT的分子介质或分子-脂质复合物的实际剂量将随施用的路径而变化，并应被调整以获得1.0mg/l-2g/l的循环血浆浓度。本文所述的在动物模型系统中获得的数据显示优选实施方案的ApoA-I激动剂与HDL成分相关，并在人中具有约5天的预计的半衰期。因此，在一个实施方案中，可以通过以介于0.5mg/kg-100mg/kg之间的剂量，一星期一次的注射施用RCT的介质。在另一个实施方案中，理想的血清水平可通过持续的输注或通过提供约0.1mg/kg/小时-100mg/kg/小时的间歇输注来维持。
不同的RCT介质的毒性和治疗功效可以利用细胞培养或实验动物中用于确定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)的标准制药程序而确定。毒性和治疗效应之间的剂量比率是治疗指数并且可将其表示为比率LD50/ED50。优选显示大的治疗指数的ApoA-I分子激动剂。
其它应用可将优选实施方案的RCT激动剂的介质用在体外测定中以测量血清HDL，例如用于诊断目的。因为RCT的介质与血清的HDL和LDL成分相关，可以将激动剂用作HDL和LDL群体的“标记”。而且，可以将激动剂用作在RCT中有效的HDL的亚群的标记。为此目的，可将激动剂加入患者的血清样品中或与其混合；在合适的温育时间后，通过检测结合的RCT的介质可以测定HDL的成分。这可以通过使用标记的激动剂(例如，放射性标记，荧光标记，酶标记，染料等)，或使用特异于激动剂的抗体(或抗体片段)的免疫测定来完成。
或者，可以将标记的激动剂用在成像方法(例如，CAT扫描，MRI扫描)中以显现循环系统，或监测RCT，或显现HDL在脂条、动脉粥样硬化损伤等中的聚集。(其中HDL应在胆固醇流出中是有活性的)。
反向胆固醇转运的介质的分析的测定LCAT活性测定可通过各种体外测定，例如，通过它们在体外活化LCAT的能力来评价按照优选实施方案的RCT的介质的潜在临床功效。在LCAT测定中，用等量的化合物或ApoA-I(分离自人血浆)对由卵磷脂酰胆碱(EPC)或1-棕榈酰-2-油基-磷脂酰-胆碱(POPC)与放射性标记的胆固醇组成的底物小泡(小的单层小泡或“SUVs”)进行预温育。通过添加LCAT(纯化自人血浆)来起始反应。被用作阳性对照的天然ApoA-I，表现了100％的活化活性。可将分子介质的“比活”(即活性的单位(LCAT活化)/质量单位)计算为获得最大LCAT活化的介质的浓度。例如，可对一系列浓度的化合物(例如，有限稀释)进行测定以确定化合物的“比活”--分析中在特定时间点(例如1小时)获得最大LCAT活化(即，胆固醇向胆固醇酯的百分比转变)的浓度。当使用针对化合物的浓度在例如1小时时的胆固醇的标绘百分比转变时，可将“比活”确定为在标绘曲线上获得平稳期的化合物的浓度。
底物小泡的制备用在LCAT测定中的小泡是由摩尔比为20∶1的卵磷脂(EPC)或1-棕榈酰-2-油基-磷脂酰胆碱(POPC)与胆固醇组成的SUVs。为了制备足够40次测定的小泡贮存溶液，将7.7mg EPC(或7.6mg POPC；10μmol)，78μg(0.2μmol)4-14C-胆固醇，116μg胆固醇(0.3μmol)溶解于5ml的二甲苯中并进行冻干。其后，将4ml的测定缓冲液加入干燥粉末中并在氮气氛下于4℃超声处理。超声处理条件Branson 250超声波仪，10mm探头(tip)，6×5分钟；测定缓冲液10mM Tris，0.14M NaCl，1mM EDTA，pH7.4。将超声处理的混合物在14,000rpm(16,000×g)离心6次，每次5分钟以去除钛颗粒。将得到的澄清溶液用于酶测定。
LCAT的纯化对于LCAT的纯化，将葡聚糖硫酸酯/Mg2+处理的人血浆用于获得缺乏脂蛋白的血清(LPDS)，将其在苯基琼脂糖(Phenylsepharose)、Affigelblue、ConcanavalinA sepharose和抗-ApoA-I亲和层析法上顺序进行色谱分析。
制备LPDS为了制备LPDS，将500ml的血浆加入50ml葡聚糖硫酸酯(分子量＝500,000)溶液。搅拌20分钟。在3000rpm(16,000×g)于4℃离心30分钟。应用上清液(LPDS)进行进一步纯化(ca.500ml)。
苯基琼脂糖(Phenylsepharose)层析法将下列材料和条件用于苯基琼脂糖层析法。固相苯基琼脂糖快速流动，高subst.级，PharmaciacolumnXK26/40，凝胶床高度33cm，V＝ca，175ml流动速度200ml/小时(样品)洗涤200ml/小时(缓冲液)洗脱80ml/小时(蒸馏水)缓冲液10mM Tris，140mM NaCl，1mM EDTA pH7.4，0.01％叠氮化钠。
在Tris-缓冲液中平衡柱，将29g NaCl加入500ml的LPDS中并加样到柱上，用数体积的Tris缓冲液洗涤直到在280nm波长的吸收大约处于基线，然后用蒸馏水开始洗脱。合并包含蛋白质的级分(合并大小180ml)并将其用于Affigelblue层析法。
Affigelblue层析法将苯基琼脂糖合并物对着20mM Tris-HCl，pH7.4，0.01％叠氮化钠于4℃透析过夜。通过超滤(Amicon YM30)，将合并的体积减少到50-60ml，并装载到Affigelblue柱上。固相Affigelblue，Biorad，153-7301柱，XK26/20，凝胶床高度ca.13em；柱体积约70ml。流动速度装载15ml/小时洗涤50ml/小时。在Tris-缓冲液中平衡柱。将苯基琼脂糖合并物加样到柱上。平行开始以收集级分。用Tris-缓冲液进行洗涤。将合并的级分(170ml)用于ConA层析法。
ConA层析法通过Amicon(YM30)将Affigelblue合并物减少到30-40ml并对着ConA起始缓冲液(1mM Tris HCl pH7.4；1mM MgCl2，1mM MnCl2，1mMCaCl2，0.01％叠氮化钠)在4℃透析过夜。固相ConA sepharose(Pharmacia)柱XK26/20，凝胶床高度14cm(75ml)。流动速度装载40ml/小时，洗涤(用起始缓冲液)90ml/小时，洗脱50ml/小时，在1mM Tris，pH7.4中的0.2M甲基-α-D-甘露糖苷。收集甘露糖苷洗脱液的蛋白质级分(110ml)，并通过超滤(YM 30)将体积减少到44ml。将ConA合并物分成贮存于-20℃的2ml的等分试样。
抗-ApoA-I亲和层析法在已经与抗-ApoA-I abs共价偶联的Affigel-Hz材料(Biorad)上进行抗-ApoA-I亲和层析法。柱XK16/20，V＝16ml。用pH7.4的PBS平衡柱。在装载到柱上之前，将2ml的ConA合并物向着PBS进行透析2小时。流动速度装载15ml/小时洗涤(PBS)40ml/小时。将合并的蛋白质级分(V＝14ml)用于LCAT测定。用0.1M的柠檬酸缓冲液(pH4.5)再生柱以洗脱结合的A-I(100ml)，并在该方法后立即用PBS再次平衡。
RCT的介质的药物代谢动力学可以将随后的实验流程用于证实RCT的介质在循环中是稳定的并与血浆的HDL成分缔合。
化合物激动剂的合成和/或放射性标记通过达到500-900cpm/ng的比活的一氯化碘方法来制备125I-标记的LDL(Goldstein和Brown 1974 J.Biol.Chem.2495153-5162)。如所述(Goldstein和Brown 1974 J.Biol.Chem.2495153-5162)在500-900cpm/ng的终比活上，确定培养的人成纤维细胞的低密度脂蛋白的结合和降解。在每种情形中，通过用10％(wt/vol)的三氯乙酸(TCA)于4℃温育脂蛋白，＞99％的放射性是可沉淀的。将酪氨酸残基与每种化合物的N-末端连接以使其能被放射性碘标记。使用Iodo-Beads(Pierce Chemicals)，并按照生产商的手册，用Na125I(ICN)将化合物放射性碘标记到800-1000cpm/ng的比活。透析后，化合物的可沉淀的放射性(10％TCA)一直是＞97％。
或者，可以通过将14C-标记的Fmoc-脯氨酸偶联为N-末端氨基酸来合成放射性标记的化合物。可以将L-[U-14C]X，比活9.25GBq/mmol用于合成包含X的标记的激动剂。可以按照Lapatsanis，Synthesis，1983，671-173进行合成。简而言之，将250μM(29.6mg)未标记的L-X溶解于225μl的9％Na2CO3溶液并加入9.25MBq(250μM)14C-标记的L-X的溶液(9％Na2CO3)中。将液体冷却至0℃，与在0.75ml DMF中的600μM(202mg)的9-芴基甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-OSu)混合，并于室温摇动4小时。其后，用二乙醚(2×5ml)和氯仿(1×5ml)抽提所述混合物，用30％HCl酸化剩余的水相并用氯仿(5×8ml)抽提。通过Na2SO4干燥有机相，将其过滤除去并将体积在氮流动下减到5ml。通过用UV检测的TLC(CHCl3∶MeOH∶Hac，9∶1∶0.1v/v/v，固定相HPTLC硅胶60，Merck，Germany)估计纯度，例如放射化学纯度线性分析器，Berthold，Germany；反应产率可以是约90％(如通过LSC所确定)。
将包含14C-肽X的氯仿溶液直接用于肽的合成。如上所述，可以自动合成包含氨基酸2-22的树脂并将其用于合成。通过Edman降解来确定肽的序列。偶联的进行如前面所述，除了优选使用替代TBTU的HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(uroniumhexafluorophosphate))以外。手动进行用未标记的Fmoc-L-X进行的第二次偶联。
小鼠中的药物代谢动力学在每个实验中，可将300-500μg/kg(0.3-0.5mg/kg)[或更多诸如2.5mg/kg]放射性标记的化合物腹膜内注射到小鼠中，用正常小鼠食物(Chow)或导致动脉粥样硬化的Thomas-Harcroft改进的食物(导致VLDL和IDL胆固醇的剧烈升高)对所述小鼠进行喂养。在多个时间间隔取血液样品以进行血浆中放射性的评价。
在人血清中的稳定性可将100μg标记的化合物可与2ml新鲜人血浆(于37℃)混和，并被立即去脂质化(delipidated)(对照样品)或在于37℃温育8天后被去脂质化(测试样品)。通过用等体积的2∶1(v/v)氯仿∶甲醇抽提脂质来进行去脂质化。将样品装载到反相C18HPLC柱上并用线性梯度(在33分钟内25-58％)的乙腈(包含0.1％w的TFA)进行洗脱。洗脱图谱根据吸光度(220nm)和放射性绘制。
前-β样颗粒的形成可通过在密度d＝1.21g/ml处的KBr密度超离心来分离人HDL以获得上层级分，随后通过Superose 6凝胶过滤层析法来从其它脂蛋白中分离HDL。基于Bradford蛋白测定所确定的蛋白质含量，用生理盐水将分离的HDL调整为1.0mg/ml的终浓度。从分离的HDL制备物中移出300μl的等分试样，并用100μl标记的化合物(0.2-1.0μg/μl)于37℃温育2小时。分析多个单独的温育物，包括包含100μl的生理盐水的空白和四个稀释度的标记的化合物。例如(i)0.20μg/μl的化合物HDL比率＝1∶15；(ii)0.30μg/μl化合物HDL比率＝1∶10；(iii)0.60μg/μl的化合物∶HDL比率＝1∶5；和(iv)1.00μg/μl的化合物∶HDL比率＝1∶3。2小时温育后，将200μl的样品的等分试样(总体积＝400μl)装载到Superose 6凝胶过滤柱上以进行脂蛋白分离和分析并将100μl用于确定总的装载的放射性。
介质与人脂蛋白的关联可通过与每个脂蛋白类别(HDL、LDL和VLDL)和不同脂蛋白类别的混合物一起温育标记的化合物来确定分子介质与人脂蛋白级分之间的关联。通过在d＝1.21g/ml的KBr密度梯度超离心来分离HDL、LDL和VLDL，并通过在Superose 6B柱大小排阻柱上的FPLC进行纯化(用0.7ml/分钟的流速和1mM Tris(pH8)，115mM NaCl，2mM EDTA和0.0％NaN3的运行缓冲液进行层析法)。标记的化合物与HDL，LDL和VLDL一起在1∶5的化合物∶磷脂比率(质量比率)下于37℃温育2小时。所需量的脂蛋白(基于产生1000μg所需的量的体积)与0.2ml的化合物贮存液(1mg/ml)混和并使用0.9％NaCl使溶液达到2.2ml。
于37℃温育2小时后，移出等分试样(0.1ml)以确定总放射性(例如，取决于标记的同位素，通过液体闪烁计数或γ计数)，用KBr将剩余的温育混合物的密度调整到1.21g/ml，并使用Beckman台式超速离心机在TLA100.3转子中将所述样品在100,000rpm(300,000g)于4℃离心24小时。通过从每个样品的上层移出0.3ml的等分试样将得到的上清液进行分级分离，共5个级分，并将0.05ml的每个级分用于计数。上两个级分包含漂浮脂蛋白，其它的级分(3-5)对应于溶液中的化合物。
与HDL脂质的选择性结合将人血浆(2ml)与20、40、60、80和100μg的标记的化合物一起于37℃温育2小时。通过将密度调整为1.21g/ml并在TLA 100.3转子中于100,000rpm(300,000g)，4℃离心36小时分离脂蛋白。取上层900μl(在300μl级分中)进行分析。计算来自每个300μl级分的50μl的放射性并通过FPLC(Superose 6/Superose 12组合柱)分析来自每个级分的200μl。
将反向胆固醇转运的介质应用在动物模型系统中可在兔或其它合适的动物模型中证实优选实施方案的RCT的介质的功效。
制备磷脂/化合物复合物按照胆酸盐(cholate)透析方法制备由磷脂(DPPC)和化合物组成的小的盘状颗粒。将磷脂溶解于氯仿并在氮气流下干燥。将化合物以1-2mg/ml的浓度溶解在缓冲液(盐水)中。将脂质薄膜再溶解(43℃)于包含胆酸盐的缓冲液中并以3∶1的磷脂/化合物重量比率将化合物溶液加入。于43℃过夜温育所述混合物并于43℃(24小时)、室温(24小时)和4℃(24小时)进行透析，在温度点缓冲液(大体积)变化3次。将所述复合物过滤除菌(0.22μm)以进行注射并贮存于4℃。
化合物/磷脂颗粒的分离和表征将所述颗粒在凝胶过滤柱上(Superose 6 HR)进行分离。通过在每个级分中测量磷脂浓度来鉴定包含所述颗粒的峰的位置。从洗脱体积，可确定斯托克斯半径(Stokes radius)。通过在16小时酸水解后测量苯丙氨酸的含量(通过HPLC)来确定复合物中化合物的浓度。
兔的注射用一剂量的磷脂/化合物复合体(5或10mg/kg体重，表示为化合物)以不超过10-15ml的单一推注形式静脉注射雄性新西兰白兔(2.5-3kg)。在操作之前使所述动物稍微镇静。在注射之前和之后5、15、30、60、240和1440分钟取血液样品(在EDTA上收集)。确定每个样品的血细胞比容(Hct)。在分析前将样品等分，并存于-20℃。
兔血清的分析使用商购分析，例如按照生产商的手册(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany和Biomerieux，69280，Marcy-L′etoile，France)酶促测定总血浆胆固醇，血浆三酰甘油和血浆磷脂。
可通过在蔗糖密度梯度中旋转来确定在血浆分离成其脂蛋白级分后所获得的级分的血浆脂蛋白轮廓。例如，收集级分并通过常规酶促分析在对应于VLDL、ILDL、LDL和HDL脂蛋白密度的级分中测量磷脂和胆固醇的水平。
合成带有生物电子等排体的RCT介质使用Sasrin树脂(4-羟基-2-甲氧基苄基醇，Aldrich)和Rink酰胺MBHA树脂，通过使用标准的SPPS方案制备出这些化合物。
SASRIN树脂(100-200目)(1G)(取代0.6-1.1mmol/g)
RINK酰胺MBHA树脂(1G)(取代0.66mmol/g)Fmoc-HN-树脂
合成的化合物的实例包括下列各项生物电子等排体序列L-氨基酸序列D-氨基酸序列 通用分析方法全部试剂属于商业品质。溶剂是通过标准方法干燥和纯化的。氨基酸衍生物是从商业来源获得的。分析的TLC在涂覆有0.2mm的硅胶60F254层，Merck的铝板上进行，以及制备的TLC在涂覆有2mm的硅胶PF254层，Merck的20cm×20cm玻璃板上进行。硅胶60(230-400目)，Merck用于快速色谱法。在micro-hot-stage设备上获得熔点并且是未修正的。用Brucker400分光计记录1H NMR光谱，在400MHz操作，利用TMS或溶剂作为参比。在NuMega Resonance Laboratories，San Diego上进行元素分析。终产物的制备反相HPLC(Glison)在Phenomenex Luna 5μC18(2)(60mm×21.2mm)柱上进行，流速为15mL/分钟，利用可调的设定在254nm的UV检测器。CH3CN和H2O的混合物用作梯度方式中的流动相(CH3CN＝5％-95％)。LC/UV/ELSD/MS的分析利用获自PE Sciex的API 150 EX仪器进行。在正模式中进行ESI-MS实验。
通用程序A(酰胺偶联)向酸(1.05当量)、胺(1.00当量)和HOBt(1.05当量)在无水CH2Cl2(20mL)中的混合物中，加入Et3N(1.5当量)。加入EDCI(1.05当量)，并且在氮气下于室温搅拌过夜(16小时)。然后，加入水(15mL)，并且于室温搅拌5分钟。进行层分离，并且将水层用CH2Cl2(2×15mL)萃取。将合并的有机层相继用水(15mL)、盐水(15mL)洗涤，并且干燥(Na2SO4)。过滤后，在旋转蒸发器中除去溶剂，并且真空干燥，得到期望的产物。
在少数情况下，在反应完成后在旋转蒸发器中除去挥发物，并且将残余物用水(25mL)于室温搅拌15分钟。过滤非均相混合物，用水(3×25mL)洗涤，并且干燥，得到所希望的酰胺。
通用程序B(Fmoc脱保护)向在CH2Cl2(20mL)中的N-Fmoc衍生物(1.0mmol)，加入4-氨基甲基哌啶(4-AMP)(5mL)，并且于室温搅拌16h小时。在旋转蒸发器中除去挥发物。将粗产物重新放入CH2Cl2(50mL)中，并且相继用磷酸盐缓冲液pH5.5(4×25mL)、水(25mL)、盐水(25mL)洗涤，并且干燥(Na2SO4)。过滤后，在旋转蒸发器中除去溶剂，并且真空干燥，得到期望的胺产物。
通用程序C(胺与酸酐的反应)向在THF(25mL)中的胺(1.0mmol)，加入酸酐(1.5至2.0mmol)，并且在氮气下于室温搅拌24小时。在旋转蒸发器中除去挥发物。将粗产物用于随后的反应，或由反相HPLC柱纯化。
通用程序D(N-Boc基团的脱保护)将N-Boc衍生物(1.0mmol)在1∶1三氟乙酸(TFA)/CH2Cl2(10mL)中、在氮气下于室温搅拌4小时。在旋转蒸发器中除去挥发物。将粗产物用NaHCO3水溶液(15mL)搅拌1小时(小心！CO2气体逸出)。在少数情况下，为了得到细小的固体，可能需要更长的搅拌时间。将固体滤出，用水(3×25mL)洗涤，并且干燥，提供游离胺。
当未形成固体或材料通过用NaHCO3搅拌形成胶状时，用CH2Cl2(2×25mL)萃取产物，并且将合并的有机物相继用水(25mL)、盐水(25mL)洗涤，并且干燥(Na2SO4)。过滤后，在旋转蒸发器中除去溶剂，并且真空干燥，得到期望的胺产物。
通用程序E(酯水解)向酯(1.0mmol)在MeOH-THF(3∶2，15mL)中的搅拌溶液中，加入1NNaOH水溶液(4.0mL，4.0mmol)，并且于室温在氮气下搅拌过夜(16小时)。然后在旋转蒸发器中除去挥发物，并且加入2M NaHSO4(2mL)，以中和碱。用EtOAc(3×15mL)萃取酸。将合并的有机萃取物相继用水(20mL)，盐水(20mL)洗涤，并且干燥(Na2SO4)。过滤后，在旋转蒸发器中除去溶剂，并且真空干燥，得到期望的酸产物。
通用程序F(胺的胍基化)向胺(1.0mmol)在CHCl3(15mL)中的溶液中，加入Et3N(1.5mmol)，接着加入1，3-二-Boc-2-(三氟甲磺酰基)胍(Goodman′s试剂)(1.5mmol)。将该均相反应在氮气下于室温搅拌3天，然后加入另外量的Et3N(1.5mmol)和1，3-二-Boc-2-(三氟甲磺酰基)胍(1.5mmol)，并且再搅拌3天。将反应内容物相继用2M NaHSO4(10mL)、NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤。将溶剂蒸发至干燥，得到双-Boc-胍衍生物。
通用程序G(硝基的还原)向硝基化合物(1.0mmol)在MeOH(25mL)或MeOH-THF(2∶1，25mL)中的溶液中，在氩气下加入10％Pd/C(0.075g)。在氢气鼓泡下，将反应搅拌过夜(16小时)。然后，将反应脱气，用氩气吹扫，并且通过Celite545过滤。将反应烧瓶用MeOH漂洗，并且通过滤饼。将合并的洗涤物浓缩，以制备胺产物。
方案-5 4-(1-(4-胍基丁基氨基甲酰基)-2-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)乙基氨基甲酰基)丁酸向外消旋的2-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-丙酸(2.10g，9.62mmol)和NaHCO3在175mL H2O-二噁烷(1∶2)中的搅拌悬浮液中，加入Fmoc-OSu，并且于室温搅拌(方案5)。在旋转蒸发器中除去挥发物，并且将残余物放入100mL冰-水中，并且用5N HCl(水溶液)酸化至pH～3.0。过滤沉淀物，用水(3×50mL)洗涤，干燥，并且用乙醚(30mL)研制，得到2-(Fmoc-氨基)-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-丙酸，为灰白色松软固体(3.40g，80％)。
根据通用程序A，将2-(Fmoc-氨基)-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-丙酸(0.463g，1.05mmol)与(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍丁胺(0.331g，1.00mmol)、EDCI(0.23g，1.20mmol)、HOBt(0.142g，1.05mmol)和Et3N(0.152g，1.50mmol)反应。分离出N-Fomc-(1-(4-(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍基丁基氨基甲酰基)-2-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)乙基胺)，产率为81％(0.64g)。
根据通用程序B，将上述N-Fmoc衍生物(1.10g，1.46mmol)通过用哌啶(5mL)处理，得到1.28g的粗产物。它被Fmoc-衍生的副产物污染，并且在没有进一步纯化的情况下用于下面的步骤。
根据通用程序C，将上述在THF(10mL)中的粗胺[1-(4-(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍基丁基氨基甲酰基)-2-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)乙基胺]](0.36g，0.68mmol)与戊二酸酐(0.116g，1.02mmol)反应。根据通用程序D，将粗(双-Boc衍生物)用TFA处理。在旋转蒸发器中除去挥发物。将粗产物放入DMSO中，并且用NaHCO3(0.15g)处理1小时。然后，加入极少量的水(0.7mL)，并且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。将含有纯物质的级分合并，并且冻干，得到0.03g的4-(1-(4-胍基丁基氨基甲酰基)-2-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)乙基氨基甲酰基)丁酸，为白色固体。Mp291℃。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝7.53分钟(CH3CN-H2O＝45∶55)。1HNMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)9.97(s，1H)，8.12(d，J＝4.0Hz，1H)，8.02(d，J＝8.8Hz，1H)，7.58(d，J＝8.4Hz，1H)，7.35(d，J＝7.2Hz，1H)，7.04(t，J＝7.4Hz，1H)，7.00(s，1H)，6.92(d，J＝7.4Hz，2H)，4.37(dt，J＝8.8，4.0Hz，1H)，3.63(s，3H)，3.30-3.00(m，3H)，2.95-2.85(m，3H)，2.15-2.08(m，1H)，1.94-1.85(m，2H)，1.81-1.74(m，1H)，1.68-1.52(m，3H)，1.42-1.34(m，3H)。MS[EI]m/e 445.5[M+H]+。分析(C22H32N6O4+1.89 H2O+0.18CF3CO2H)C，H，N。
方案-6
方案-7 (R)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}根据通用程序A(方案6)，允许Fmoc-D-Phe-OH(3.50g，9.0mmol)与N-Boc-对苯二胺(1.79g，8.6mmol)、HOBt(1.22g，9.0mmol)、Et3N(1.04g，10.3mmol)和EDCI(1.73g，9.0mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中反应。在旋转蒸发器中除去挥发性物质，并且将残余物用水(25mL)于室温搅拌15分钟。过滤出灰白色固体，用水(3×25mL)洗涤，并且干燥，提供(R)-{2-苄基-N-(4-叔丁氧羰基氨基-苯基)-丙酰胺酸9H-芴-9-基甲酯}，产率为85.6％(4.47g)。
根据通用程序B，将上述Fmoc-衍生物(2.1g，3.63mmol)用4-AMP(2.07g，18.2mmol)处理60小时。通过萃取工序和蒸发，得到(R)-{[4-(2-氨基-3-苯基-丙酰氨基)-苯基]-氨基甲酸叔丁酯}，为淡黄色固体(1.1g，85％)。
然后根据通用程序A，允许对苯二甲酸一甲酯(0.51g，2.8mmol)与(R)-{[4-(2-氨基-3-苯基-丙酰氨基)-苯基]-氨基甲酸叔丁酯}(1.00g，2.8mmol)、HOBt(0.38g，2.8mmol)、Et3N(0.34g，3.4mmol)和EDCI(0.54g，2.8mmol)在无水CH2Cl2(20mL)中反应。在旋转蒸发器中除去挥发性物质，并且将残余物用水(15mL)于室温搅拌15分钟。过滤非均相混合物，用水(3×25mL)洗涤，并且干燥，提供所希望的酰胺(R)-{N-[1-(4-叔丁氧羰基氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(1.38g，94.8％)，为淡黄色固体。
根据通用程序D，将在(R)-{N-[1-(4-叔丁氧羰基氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(1.0g，1.93mmol)中的N-Boc基团进行3小时脱保护。过滤出固体，用水(3×25mL)洗涤，并且干燥，提供游离苯胺(0,76g，94％)。如在方案7中所示，还通过还原硝基化合物制备该胺。将0.075g的粗产物溶解于极少体积的DMSO(1.2mL)中，并且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝9.10分钟(CH3CN-H2O＝55∶45)。将含有纯物质的级分合并并且冻干，得到0.048g的(R)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}，为淡黄色固体。Mp 240-2℃。1H NMR(CDCl3，δ，按ppm计)8.03(d，J＝8.4Hz，2H)，7.72(d，J＝8.0Hz，2H)，7.28-7.15(m，7H)，6.93(d，J＝8.8Hz，2H)，4.91-4.82(m，1H)，3.88(s，3H)，3.29(dd，J＝14.0，6.4Hz，1H)，3.14(dd，J＝14.0，8.0Hz，1H)。MS[EI]m/e 418.5[M+H]+。分析(C24H23N3O4+0.25 H2O)C，H，N。
(R)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸}采用通用程序E，将在甲基(R)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.25g，0.60mmol)中的酯水解(方案6)。将粗反应混合物溶解于DMSO(1.5mL)中，并且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝3.47分钟(CH3CN-H2O＝25∶75)。将含有纯物质的级分合并并且冻干，得到0.06g标题化合物的Na-盐。Mp 220℃(分解)。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)9.88(s，1H)，8.61(d，J＝8.4Hz，1H)，7.85(d，J＝9.2Hz，2H)，7.73(d，J＝8.8Hz，2H)，7.44(d，J＝7.6Hz，2H)，7.26-7.18(m，4H)，7.11(d，J＝7.4Hz，2H)，6.54(d，J＝7.6Hz，2H)，4.82(br.s，IH)，4.73-4.68(m，1H)，3.07-3.01(m，2H).MS[EI]m/e 404.5[M(相应酸)+H]+。分析(C23H20N3NaO4+2.4 H2O+0.06CF3CO2Na)C，H，N。
(R)-(N-[1-(4-胍基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸)根据通用程序F，允许在(R)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.30g，0.72mmol)中的胺与1，3-二-Boc-2-(三氟甲磺酰基)胍和Et3N反应，得到(R)-{N-[1-(4-(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}，产率为90％(0.427g)。将其用于随后的反应(方案6)。
采用通用程序E，将(R)-{N-[1-(4-(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.40g，0.61mmol)中的酯基水解。将含有N2，3-二-叔丁氧羰基的粗反应混合物(0.45g)在通用程序D下进行5小时。将浓缩的粗物质溶解于DMSO(1.5mL)中，并且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。将含有纯物质的级分合并并且冻干，0.095g的(R)-{N-[1-(4-胍基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸}，为白色固体。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝6.20分钟(CH3CN-H2O＝25∶75)。Mp 242℃(分解)。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)10.92(br.s，1H)，10.39(s，1H)，8.55(d，J＝7.6Hz，1H)，7.91(d，J＝8.4Hz，2H)，7.79(d，J＝8.4Hz，2H)，7.77(br.s，3H)，7.67(d，J＝8.8Hz，2H)，7.39(d，J＝7.2Hz，2H)，7.27(t，J＝7.6Hz，2H)，7.18(d，J＝8.8Hz，2H)，7.17(t，J＝7.2Hz，1H)，4.82(表观q，J＝6.0Hz，1H)，3.15-3.04(m，2H)。MS[EI]m/e 446.4[M+H]+。分析(C24.6H27.6F0.9N5Na0.3O6.9)C，H，N。
方案-8 (S)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸}根据通用程序A(方案8)，允许Boc-L-Bip-OH(3.00g，8.8mmol)与对硝基苯胺(1.34g，9.7mmol)、HOBt(1.19g，8.8mmol)、Et3N(1.07g，10.5mmol)和EDCI(1.68g，8.8mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中反应。在旋转蒸发器中除去挥发性物质，并且将残余物用水(50mL)于室温搅拌15分钟。过滤出固体，用水(2×25mL)洗涤，并且干燥，提供(S)-{[1-(4-硝基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-氨基甲酸叔丁酯}，产率为84％(4.4g)。
根据通用程序D，将上述Boc-衍生物(2.1g，3.63mmol)用TFA处理。通过过滤、水洗涤和干燥，得到(S)-{2-氨基-3-联苯基-4-基-N-(4-硝基-苯基)-丙酰胺)，为淡黄色固体(1.75g，97％)。
然后根据通用程序A，允许对苯二甲酸一甲酯(0.90g，5.02mmol)与上述胺(1.65g，4.56mmol)、HOBt(0.68g，5.02mmol)，Et3N(0.55g，5.48mmol)和EDCI(0.96g，5.02mmol)在无水CH2Cl2(20mL)中反应。在旋转蒸发器中除去挥发性物质，并且将残余物用水(15mL)于室温搅拌15分钟。过滤非均相混合物，用水(3×25mL)洗涤，并且干燥，提供(S)-{N-[1-(4-硝基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(2.23g，93％)，为淡黄色固体。
按照通用程序G，将上述硝基化合物(0.90g，1.72mmol)在MeOH-THF(2∶1，25mL)中还原，提供(S)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.81g，95％)。
采用通用程序E，将在(S)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.12g，0.24mmol)中的酯水解。将粗反应混合物溶解于DMSO(1.5mL)中，并且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。将含有纯物质的级分合并并且冻干，得到0.03g标题化合物的Na-盐，为灰白色固体。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝8.92分钟(CH3CN-H2O＝55∶45)。Mp 251℃(分解)。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)9.98(s，1H)，8.97(d，J＝8.0Hz，1H)，8.00(d，J＝8.8Hz，2H)，7.97(d，J＝8.4Hz，2H)，7.61(d，J＝8.8Hz，2H)，7.58(d，J＝7.2Hz，2H)，7.48(d，J＝8.0Hz，2H)，7.40(d，J＝8.2Hz，2H)，7.32(t，J＝7.6Hz，1H)，7.30(d，J＝7.0Hz，2H)，6.68(d，J＝8.4Hz，2H)，4.89-4.83(m，1H)，3.16-3.06(m，2H)。MS[EI]m/e 480.4[M(相应酸)+H]+。分析(C29H27.2N3NaO5.6)C，H，N。
(S)-{N-[2-联苯基-4-基-1-(4-胍基-苯氨羰基)-乙基]-对氨甲酰苯甲酸}根据通用程序F，允许(S)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.23g，0.466mmol)与1，3-二-Boc-2-(三氟甲磺酰基)胍[2×(0.54g，1.4mmol)]和Et3N[2×(0.14g，1.4mmol)]反应，得到(S)-{N-[1-(4-(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}，产率为87.5％(0.30g)。将其用于下面的反应(方案8)。
采用通用程序E，将在(S)-{N-[1-(4-(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.29g，0.39mmol)中的酯基水解。将含有N-Boc基团的粗反应混合物在通用程序D下进行5小时。将浓缩的粗物质溶解于DMSO(1.5mL)中，并且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。将含有纯物质的级分合并并且冻干，得到0.06g的标题化合物，为白色固体。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝6.92分钟(CH3CN-H2O＝40∶60)。Mp 238-40℃(分解)。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)10.85(br.s，1H)，10.47(s，1H)，9.05(d，J＝6.4Hz，1H)，8.02(d，J＝7.2Hz，2H)，7.94(d，J＝7.6Hz，2H)，7.79(s，3H)，7.78(d，J＝7.2Hz，2H)，7.70(t，J＝8.4Hz，4H)，7.58(d，J＝7.2Hz，2H)，7.50(t，J＝7.2Hz，2H)，7.39(t，J＝8.0Hz，1H)，7.27(d，J＝7.6Hz，2H)，4.96(q，J＝6.8Hz，1H)，3.24(d，J＝5.6Hz，2H)。MS[EI]m/e 522.8[M+H]+。分析(C30H35.2N5O8.1)C，H，N。
方案-9 3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸根据通用程序A，允许Boc-D-Phe-OH(2.00g，7.54mmol)与N，N-二甲基-对苯二胺(0.98g，7.18mmol)、HOBt(1.02g，7.54mmol)、Et3N(1.09g，10.77mmol)和EDCI(1.44g，7.54mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中反应，提供叔丁基(R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酸叔丁酯(2.85g，98.6％)，为灰色固体(方案9)。
根据通用程序D，将上述Boc-衍生物(1.85g，4.82mmol)用TFA处理。通过过滤、水洗和干燥，得到(R)-2-氨基-N-(4-(二甲基氨基)苯基)-3-苯基丙酰胺，为灰色固体(1.29g，94％)。
根据通用程序C，将上述在THF(5mL)中的胺(0.12g，0.42mmol)与琥珀酸酐(0.051g，0.51mmol)反应。将粗产物放入DMSO(1.5mL)中，并且过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。将含有纯物质的级分合并并且冻干，得到0.105g的3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸，为淡灰色固体。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝8.32分钟(CH3CN-H2O＝45∶55)。Mp 197-8℃。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)12.21(br.s，1H)，9.86(s，1H)，8.42-8.25(m，1H)，7.50-7.25(m，9H)，6.89(br.s，1H)，4.69-4.61(m，1H)，3.16-3.04(m，2H)，2.95(s，6H)，2.45-2.33(m，4H)。MS[EI]m/e 384.4[M+H]+。分析(C21H25.5N3O4.25)C，H，N。
4-((R)-1-(4-二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g(0.42mmol)的(R)-2-氨基-N-(4-(二甲基氨基)苯基)-3-苯基丙酰胺和戊二酸酐(0.058g，0.51mmol)，得到0.089g的4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸，为淡灰色固体(方案9)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝8.81分钟(CH3CN-H2O＝48∶52)。Mp 205-7℃。1HNMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)12.21(br.s，1H)，9.86(s，1H)，8.42-8.25(m，1H)，7.50-7.25(m，9H)，6.84(br.t，J＝8.2Hz，1H)，4.69-4.61(m，1H)，3.16-2.95(m，2H)，2.93(s，6H)，2.15(t，J＝6.6Hz，4H)，1.68(t，J＝6.6Hz，2H)。MS[EI]m/e 398.5[M+H]+。分析(C22H27.5N3O4.25)C，H，N。
4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-2-氨基-N-(4-(二甲基氨基)苯基)-3-苯基丙酰胺和3，3-(二甲基)戊二酸酐(0.072g，0.51mmol)，得到0.10g所期望的酸，为淡灰色固体(方案9)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝9.60分钟(CH3CN-H2O＝55∶45)。Mp 85-6℃。1NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)12.21(br.s，1H)，9.86(s，1H)，8.42-8.25(m，1H)，7.50-7.25(m，9H)，6.84(br.t，J＝8.2Hz，1H)，4.69-4.61(m，1H)，3.16-2.95(m，2H)，2.93(s，6H)，2.26-2.14(m，4H)，0.92(s，6H)。MS[EI]m/e 426.5[M+H]+。分析(C24.2H32.3N3.1O4.5)C，H，N。
4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(四亚甲基)丁酸的合成其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-2-氨基-N-(4-(二甲基氨基)苯基)-3-苯基丙酰胺和3，3-(四亚甲基)戊二酸酐(0.085g，0.51mmol)，得到0.076g所期望的酸，为淡灰色固体(方案9)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝9.54分钟(CH3CN-H2O＝62∶38)。Mp91-2℃。1NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)12.21(br.s，1H)，9.86(s，1H)，8.42-8.25(m，1H)，7.50-7.25(m，9H)，6.84(br.s，1H)，4.83(表观q，J＝7.4Hz，1H)，3.20-3.02(m，2H)，2.91(s，6H)，2.27(s，2H)，2.23(d，J＝13.2Hz，1H)，2.09(d，J＝13.2Hz，1H)，1.55-1.30(m，8H)。MS[EI]m/e452.4[M+H]+。分析(C26H33.5N3O4.25)C，H，N。
4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(亚戊基)丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-2-氨基-N-(4-(二甲基氨基)苯基)-3-苯基丙酰胺和3，3-(亚戊基)戊二酸酐(0.092g，0.51mmol)，得到0.119g所期望的酸，为淡灰色固体(方案9)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝11.02分钟(CH3CN-H2O＝66∶34)。Mp110-1℃。1HNMR(CDCl3+DMSO-d6，δ，按ppm计)12.21(br.s，1H)，9.86(s，1H)，8.42-8.25(m，1H)，7.50-7.25(m，9H)，6.84(br.s，1H)，4.83(表观q，J＝7.4Hz，1H)，3.20-3.02(m，2H)，2.83(s，6H)，2.27(s，2H)，2.32-2.11(m，4H)，1.32(br.s，6H)，1.21(br.s，2H)，1.11(br.s，2H)。MS[EI]m/e 466.6[M+H]+。分析(C27.12H35.4F0.18N3Na0.06O4.32)C，H，N。
方案-10 3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸根据通用程序A，允许Boc-D-Phe-OH(2.00g，7.54mmol)与4-N，N-二甲基氨基苄基胺二盐酸盐(1.60g，7.18mmol)、HOBt(1.02g，7.54mmol)、Et3N(2.54g，25.1mmol)和EDCI(1.44g，7.54mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中反应，提供(R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酸叔丁酯(2.79g，95.5％)，为灰白色固体(方案10)。
根据通用程序D，将上述(R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酸叔丁酯(1.80g，4.53mmol)用TFA处理。通过过滤、水洗和干燥，得到游离胺[(R)-N-(4-(二甲基氨基)苄基)-2-氨基-3-苯基丙酰胺]，为淡黄色固体(1.30g，96.5％)。
根据通用程序C，将在THF(5mL)中的(R)-N-(4-(二甲基氨基)苄基)-2-氨基-3-苯基丙酰胺(0.12g，0.40mmol)与琥珀酸酐(0.048g，0.48mmol)反应。将粗产物放入DMSO(1.5mL)中，且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。将含有纯物质的级分合并并且冻干，得到0.10的3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸，为白色固体。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝8.03分钟(CH3CN-H2O＝45∶55)。Mp 194-6℃。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)12.18(br.s，1H)，8.36(br.s，1H)，8.10(d，J＝8.0Hz，1H)，7.25-7.15(m，5H)，6.95(d，J＝7.2Hz，2H)，6.67(br.s，1H)，4.44-4.28(m，1H)，4.08(s，2H)，3.00(d，J＝1 2.4Hz，1H)，2.69(dd，J＝12.4，7.8Hz，1H)，2.91(s，6H)，2.45-2.22(m，4H)。MS[EI]m/e 398.5[M+H]+。分析(C22H28.56N3O4.78)C，H，N。
4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-N-(4-(二甲基氨基)苄基)-2-氨基-3-苯基丙酰胺和戊二酸酐(0.055g，0.48mmol)，得到0.086g所期望的酸，为白色固体(方案10)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15 mL/分钟]tR＝7.97分钟(CH3CN-H2O＝47∶53)。Mp208-9℃。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)12.18(br.s，1H)，8.42(br.s，1H)，8.04(d，J＝8.4Hz，1H)，7.25-7.15(m，5H)，6.95(d，J＝7.6Hz，2H)，6.65(br.s，1H)，4.44(表观q，J＝8.4Hz，1H)，4.19(d，J＝4.4Hz，2H)，2.90(dd，J＝13.6，4.4Hz，1H)，2.91(s，6H)，2.65(dd，J＝12.6，10.8Hz，1H)，2.16(表观t，J＝7.0，4H)，1.54(表观t，J＝7.0，2H)。MS[EI]m/e 412.5[M+H]+。分析(C23H29.66N3O4.33)C，H，N。
4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-N-(4-(二甲基氨基)苄基)-2-氨基-3-苯基丙酰胺和3，3-(二甲基)戊二酸酐(0.069g，0.48mmol)，得到0.097g所期望的酸，为白色固体(方案10)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝9.55分钟(CH3CN-H2O＝55∶45)。Mp 76-7℃。1H NMR(CDCl3，δ，按ppm计)7.48(d，J＝7.6Hz，1H)，7.18-7.11(m，6 H)，6.92(d，J＝8.4Hz，2H)，6.67(br.s，2H)，6.43(br.s，1H)，4.44(表观q，J＝7.6Hz，1H)，4.16(d，J＝4.8Hz，2H)，3.05-2.95(m，2H)；2.85(s，6H)，2.18(d，J＝2.4Hz，2H)，2.16(d，J＝13.0，1H)，2.04(d，J＝13.0，1H)，0.92(s，3H)，0.87(s，3H)。MS[EI]m/e 440.6[M+H]+。分析(C25H33N3O4)C，H，N。
4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(四亚甲基)丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-N-(4-(二甲基氨基)苄基)-2-氨基-3-苯基丙酰胺和3，3-(四亚甲基)戊二酸酐(0.081g，0.48mmol)，得到0.105g所期望的酸，为白色固体(方案10)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝9.56分钟(CH3CN-H2O＝62∶38)。Mp 88-90℃。1H NMR(CDCl3，δ，按ppm计)7.60(d，J＝8.0Hz，1H)，7.18-7.13(m，6H)，6.91(d，J＝8.4Hz，2H)，6.62(d，J＝8.0Hz，2H)，4.66(表观q，J＝7.8Hz，1H)，4.15(两套dd，J＝14.4，5.6Hz，2H)，3.05-2.94(m，2H)，2.84(s，6H)，2.29(d，J＝13.6Hz，1H)，2.18(表观t，J＝12.2，2H)，2.04(d，J＝13.6，1H)，1.53(br.s，4H)，1.40(br.s，2H)，1.31(br.s，2H)。MS[EI]m/e466.6[M+H]+。分析(C27H35.5N3O4.25)C，H，N。
4-(R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(亚戊基)丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-N-(4-(二甲基氨基)苄基)-2-氨基-3-苯基丙酰和3，3-(亚戊基)戊二酸酐(0.088g，0.48mmol)，得到0.12g所期望的酸，为白色固体(方案10)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝9.57分钟(CH3CN-H2O＝66∶34)。Mp 100-2℃。1H NMR(CDCl3，δ，按ppm计)7.37(br.，1H)，7.18-7.11(m，6H)，6.95(br.t，J＝6.8Hz，2H)，6.68(br.s，2H)，6.43(br.s，1H)，4.66(表观t，J＝7.2Hz，1)，4.17(br.s，2H)，3.05-2.95(m，2H)，2.86(s，6H)，2.25-2.12(m，4H)，1.32(br.s，6H)，1.21(br.s，2H)，1.11(br.s，2H)。MS[EI]m/e480.5[M+H]+。分析(C28H37.5N3O4.25)C，H，N。
方案-11
(S)-{4-[2-(9H-芴-9-基氧基羰基氨基)-2-苯基-乙酰氨基]-苯基}-氨基甲酸叔丁酯(7B)向Fmoc-L-Phe-OH(7A，2g，5mmol)在DMF(20mL)中的溶液中，加入HOBt(800mg，5mmol)、EDCI(1.1g，5.7mmol)，并且将混合物于室温搅拌20分钟。加入N-Boc-1，4-苯二胺(1.1g，5mmol)，接着加入TEA(525mg，724μL)，将混合物于室温搅拌5小时。将溶液在减压下浓缩，并且加入水，将混合物超声处理，以沉淀产物，将其通过过滤收集，得到灰白色固体(2.9g，5mmol)。
(S)-(4-(2-氨基-2-苯基-乙酰基氨基)-苯基]-氨基甲酸叔丁酯(7C)向{4-[2-(9H-芴-9-基氧基羰基氨基)-2-苯基-乙酰氨基]-苯基}-氨基甲酸叔丁酯(7B)(2.8g，5mmol)在DMF(50mL)中的溶液中，加入4-氨基甲基哌啶(10x，5.7g，50mmol)，并且将溶液于室温搅拌18小时。将混合物过滤以除去固体，并且将滤液在减压下浓缩。将残余物放入DCM中，并且用饱和NaCl、5.5磷酸盐缓冲液(3×25mL)、饱和NaCl洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤和浓缩，得到固体产物(3.48mmol，1.24g)，将其原样使用。
(S)-{N-[(4-氨基-苯氨羰基-苯基-甲基)-对氨甲酰苯甲酸](7D)向对苯二甲酸一甲酯(133mg，0.74mmol)在无水DCM(50mL)中的溶液中，加入EDCI(142mg，0.74mmol)和HOBt(114mg，0.74mmol)，并且将反应混合物于室温搅拌3小时。加入[4-(2-氨基-2-苯基-乙酰氨基)-苯基]-氨基甲酸叔丁酯(7C)(288mg，0.67mmol)，接着加入TEA(75mg，103μL)，并且将混合物于室温搅拌15小时。用水和饱和NaCl溶液萃取DCM，并且干燥，得到残余物。将残余物溶解于DCM(3mL)中，并且加入TFA(2mL)，将混合物于室温搅拌3小时。将溶液浓缩，得到褐色油状残余物。将该油溶解于MeOH(5mL)中，加入10％KOH(3mL)，并且将混合物于室温搅拌3小时。将溶液调节至pH～5，浓缩甲醇，并且收集得到的固体并且干燥，得到150mg的固体。将此粗产物由反相HPLC使用ACN/H2O(5-95％ACN)纯化，并且冻干，得到产物，为白色固体(42mg)。MP151℃。1H NMR(400MHz)δ9.83(s，1H)，8.87(d，J＝8.4Hz，1H)，7.98(d，J＝8.4Hz，2H)，7.90(d，J＝8.8Hz，2H)，7.39(d，J＝7.2Hz，2H)，7.22(m，5H)，6.5(m，2H)，4.80(m，1H)，3.10(m，4H)。M+1404.5。分析C23H21N3O4+1H2O(S)-{4-[2-(4-氰基-苯甲酰氨基)-3-苯基-丙酰氨基]-氨基甲酸叔丁酯(7E)向4-氰基苯甲酸(1.54mmol，227mg)在DMF(15mL)中的溶液中，加入EDCI(296mg，1.54mmol)和HOBt(236mg，1.54mmol)，并且将溶液于室温搅拌30分钟。加入[4-(2-氨基-2-苯基-乙酰氨基)-苯基]-氨基甲酸叔丁酯(7C)(500mg，1.4mmol)，接着加入TEA(214μL)，并且将混合物于室温搅拌4小时。将溶液倾倒入水(250mL)中，通过过滤收集固体，并且在减压下干燥，得到产物，为白色固体(638mg，1.32mmol)，将其原样使用。
(S)-(4-{3-苯基-2-[4-(1H-四唑-5-基)-苯甲酰氨基]-丙酰氨基}-苯基)-氨基甲酸叔丁酯(7F)向{4-[2-(4-氰基-苯甲酰氨基)-3-苯基-丙酰氨基]-氨基甲酸叔丁酯(7E)(100mg，0.21mmol)在DMF(2mL)中的溶液中，加入NaN3(3x，40mg，0.62mmol)和NH4Cl(0.68mmol，38mg)，并且将混合物于90℃加热18小时。减压下除去DMF，并且通过反相HPLC在C18上使用ACN/H2O(20％-95％ACN)纯化残余物，得到产物，在冻干后为白色粉末固体(31mg)。
(S)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-4-(1H-四唑-5-基)苯甲酰胺}(7G)向(4-{3-苯基-2-[4-(1H-四唑-5-基)-苯甲酰氨基]-丙酰氨基}-苯基)-氨基甲酸叔丁酯(7F)(31mg，0.06mmol)在DCM(4mL)中的悬浮液中，加入TFA(1mL)，并且将混合物于室温搅拌1.5小时。浓缩溶液，并且通过反相HPLC在C18上使用ACN/H2O(20％-95％ACN)纯化，得到产物，在冻干后为白色粉末(4.5mg)。MP137℃。1H NMR(400MHz)δ9.88(s，1H)，8.86(d，J＝8.0Hz，1H)，8.06(d，J＝8.0Hz，2H)，7.97(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝7.6Hz，2H)，7.24(m，4H)，7.14(m，1H)，6.56(d，J＝8.4Hz，2H)，5.70 s，1H)4.78(m，1H)，3.07(m，6H).M+1428.5。分析C23H21N7O2+2H2O0.4TFA
方案-12 (N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-D-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯(8E)该化合物以类似于N-[(4-氨基-苯氨羰基)-苯基-甲基]-对氨甲酰苯甲酸(7D)的方式，通过取代D-联苯基丙氨酸(8A)，并且进行如方案8中所示的皂化步骤来制备。(32mg)Mp289℃。1H NMR(400MHz)δ9.88(s，1H)，8.86(d，J＝8.0Hz，1H)，8.02(m，2H)，7.95(m，2H)，7.62(m，4H)，7.49(d，J＝8.0Hz，2H)，7.43(m，2H)，7.32(m，1H)，7.24(m，2H)6.51(m，2H)，4.85(m，3H)，3.86(s，3H)，3.14(m，2H)。M+1494.6。分析C30H27N3O4。
N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-D-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸(8F)向N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-D-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯(8E)在MeOH中的溶液中，加入10％KOH，并且将溶液于室温搅拌7天。减压下除去MeOH，并且用20％HCl将水性混合物调节至pH5-7。收集得到的固体，通过反相HPLC使用C18，用ACN/H2O(5％-95％ACN)洗脱而纯化，将适当的级分冻干，得到产物，为白色固体(13mg)。Mp282℃。1H NMR(400MHz)δ9.87(s，1H)，9.92(d，J＝8.0Hz，1H)，7.99(d，J＝8.4Hz，2H)，7.92(d，J＝8.4Hz，2H)，7.61(m，2H)，7.48(m，1H)，7.43(m，1H)，7.32(m，1H)，7.24(d，J＝8.8Hz，1H)6.51(d，J＝8.4Hz，1H)，4.84(m，1H)，3.15(m，3H)。M+1480.3。分析C29H25N3O2在不背离所述范围的情况下，可以对这里描述的实施方案进行许多修改和变更，这对于本领域技术人员是明显的。这里描述的特定实施方案仅是通过实例的方式提供。
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1.一种反向胆固醇转运的介质，其包含下面的结构 其中A、B和C可以处于任何顺序，并且其中A包含酸性氨基酸或其分子生物电子等排体；B包含芳族或亲脂性氨基酸或其类似物；并且C包含碱性氨基酸或其分子生物电子等排体，其中A或C中的至少一个包含其分子生物电子等排体。
2.权利要求1的介质，其中A或C中只有一个包含生物电子等排体，并且从不包含生物电子等排体的A或C氨基酸上去除了α氨基或α羧基。
3.权利要求1的介质，其中如果存在，来自所述氨基末端的α氨基用保护基加帽，所述的保护基选自由以下组成的组甲酰基、乙酰基、苯乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基(pivolyl)、9-芴基甲氧基羰基、2-萘酸、烟酸、其中n范围为1至20的CH3-(CH2)n-CO-、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、和取代的饱和的杂芳基。
4.权利要求1的介质，其中如果存在，来自所述羧基末端的α羧基用保护基加帽，所述的保护基选自由以下组成的组胺如其中R＝H的RNH2、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、和取代的饱和的杂芳基。
5.权利要求1的介质，其中A的酸性基团包含选自由以下组成的组的生物电子等排体
6.权利要求1的介质，其中C的碱性基团包含选自由以下组成的组的生物电子等排体
7.权利要求1的介质，其中A的生物电子等排体选自由以下组成的组
8.权利要求1的介质，其中C的生物电子等排体选自由以下组成的组
9.权利要求1的介质，其中所述的介质选自由以下组成的组 其中R为H、甲基、环烷基(C3-C7)，并且n＝1-10 其中R为H、甲基、环烷基(C3-C7)，并且n＝1-10
10.化合物BenOMe-bip-苯胺。
11.化合物4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸。
12.化合物4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸。
13.化合物4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(亚戊基)丁酸。
14.化合物4-((S)-1-(4-胍基苯氨羰基)-2-(联苯基)乙基氨基甲酰基)苯甲酸。
15.化合物3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸。
16.化合物4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸。
17.化合物4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸。
全文摘要
本发明提供适合于增加哺乳动物中反向胆固醇转运的组合物。所述组合物适合于口服递送，并且在治疗和/或预防高胆固醇血症，动脉粥样硬化和相关心血管疾病中是有用的。
文档编号A61K31/198GK1964955SQ200580018581
公开日2007年5月16日 申请日期2005年6月9日 优先权日2004年6月9日
发明者J·C·索卡, V·C·瓦萨, I·尼库林, K·阿利萨拉 申请人:阿文尼尔药品公司
相关申请的交叉引用本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2004年6月9日提交的美国临时申请60/578,228的优先权，该临时申请通过引用结合在此。
背景技术：
发明领域本发明涉及治疗高胆固醇血症和相关心血管疾病以及其它疾病的反向胆固醇转运(RCT)的小分子介质。
相关领域描述目前充分确定的是升高的血清胆固醇(“高胆固醇血症”)是动脉粥样硬化发展的起因，所述动脉粥样硬化是胆固醇在动脉壁上的进行性积累。高胆固醇血症和动脉粥样硬化是心血管疾病的主要原因，所述心血管疾病包括高血压、冠状动脉疾病、心脏病发作和中风。仅在美国，每年约有一百一十万个体遭遇心脏病发作，估计费用超过1170亿美元。尽管有许多降低血液中胆固醇水平的药物策略，它们中的许多具有不理想的副作用并且已增加了安全问题。而且，商购的药物疗法都没有充分的刺激反向胆固醇转运，一种去除体内胆固醇的重要代谢途径。
循环胆固醇通过血浆脂蛋白-转运血液中脂质的复合脂质和蛋白组合物的颗粒进行。低密度脂蛋白(LDLs)，和高密度脂蛋白(HDLs)是主要的胆固醇载体。认为LDLs负责将胆固醇从肝(合成或从膳食来源获得其的地方)中传递胆固醇到体内的肝外组织中。术语“反相胆固醇转运”描述将胆固醇从肝外组织转运到肝中，它在肝中被代谢和清除。认为血浆HDL颗粒充当组织胆固醇的清除剂而在反向转运过程中具有主要作用。
有说服力的证据支持沉积在动脉粥样硬化损伤处的脂质主要来自血浆LDL的概念；因此，一般已将LDLs称为“坏”胆固醇。相反，血浆HDL水平与冠状心脏疾病呈反向相关-确实，将高血浆水平的HDL视为阴性风险因素。推测高水平的血浆HDL不仅对于冠状动脉疾病是保护性的，而且可以实际上诱导动脉粥样硬化斑块的退化(例如，见Badimon等，1992，Circulation 86(Suppl.III)86-94)。因此，通常已将HDLs称为“好”胆固醇。
释放自LDLs的胞内胆固醇的量控制细胞胆固醇代谢。来自LDLs的细胞胆固醇的积累控制三个过程(1)其通过关闭HMGCoA还原酶的合成来减少细胞胆固醇合成，所述HMGCoA还原酶是一种在胆固醇生物合成途径中的关键酶；(2)通过活化LCAT，进入的LDL-来源的胆固醇促进胆固醇的贮存，所述LCAT是将胆固醇转变成沉积在储藏液滴中的胆固醇酯的细胞酶；和(3)胆固醇在细胞中的累积促进抑制新LDL受体的细胞合成的反馈机制。因此，细胞调节它们对LDL受体的补充从而带来足够的胆固醇以满足它们的代谢需求，而不过载。(关于综述，见Brown &Goldstein，InThe Pharmacological Basis Of Therapeutics，8th Ed.，Goodman& Gilman，Pergamon Press，NY，1990，Ch.36，pp.874-896)。
反向胆固醇转运(RCT)是一种途径，通过所述途径外周细胞胆固醇可以返回肝以再循环到肝外组织或作为胆汁分泌到肠。所述RCT途径代表从大多数肝外组织中清除胆固醇的仅有方式。RCT主要由三个步骤组成(1)胆固醇流出，胆固醇从外周细胞中的最初去除；(2)通过卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LACT)作用的胆固醇酯化，其防止流出的胆固醇再入外周细胞；和(3)将HDL胆固醇酯吸收/传递到肝细胞。LCAT是RCT途径的关键酶并且主要产自肝中，并在与HDL级分关联的血浆中循环。LCAT将细胞来源的胆固醇转变成胆固醇酯，所述胆固醇酯汇集(sequester)在将要被清除的HDL中。RCT途径由HDLs所调节。
HDL是特征在于它们的高密度的脂蛋白颗粒的专业术语。HDL复合体的主要的脂质组分是各种磷脂，胆固醇(酯)和三酰甘油。最主要的载酯蛋白成分是决定HDL的功能特性的A-I和A-II。
每种HDL颗粒包含载脂蛋白A-1(ApoA-I)的至少一个拷贝(通常两个-四个拷贝)。ApoA-I由肝和小肠合成为前载脂蛋白原，所述前载脂蛋白原作为快速裂解以产生具有243个氨基酸残基的成熟多肽的前体蛋白(proprotein)分泌。ApoA-I主要包括由通常是脯氨酸的接头部分间隔的6-8个不同的22个氨基酸残基重复，并且在一些情况中包括由一些残基组成的一段序列。ApoA-I与脂质形成三种类型的稳定复合体被称作pre-beta-1HDL的小、少-脂质的复合体；被称作pre-beta-2 HDL的包含极性脂质(磷脂和胆固醇)的展平铁饼状颗粒；和被称作球形或成熟HDL(HDL3和HDL2)的包含极性和非极性脂质二者的球形颗粒。尽管大多数在循环中的HDL包含ApoA-I和ApoA-II二者，仅包含ApoA-I(AI-HDL)的HDL的级分似乎在RCT中更为有效。流行病学研究支持AI-HDL是抗-致动脉粥样硬化的假说(Parra等，1992，Arterioscler.Thromb.12701-707；Decossin等，1997，Eur.J.Clin.Invest.27299-307)。
基于体内获得的数据的一些系列的证据暗示HDL及其主要蛋白组分ApoA-I，在预防动脉粥样硬化损伤，和潜在地斑块的退化--使这些吸引人的目标进行治疗干预。首先在人血清ApoA-I(HDL)浓度和动脉粥样硬化形成之间存在逆相关(Gordon & Rifkind，1989，N.Eng.J.Med.3211311-1316；Gordon等，1989，Circulation 798-15)。确实，HDL的特定亚群已经与人中动脉粥样硬化的减少的风险相关(Miller，1987，Amer.Heart 113589-597；Cheung等，1991，Lipid Res.32383-394)；Fruchart & Ailhaud，1992，Clin.Chem.3879)。
第二，动物研究支持ApoA-I(HDL)的保护性作用。用ApoA-I或HDL治疗胆固醇喂养的兔减少了胆固醇-喂养兔的斑块(脂条)的发展和进展(Koizumi等，1988，J.Lipid Res.291405-1415；Badimon等，1989，Lab.Invest.60455-461；Badimon等，1990，J.Clin.Invest.851234-1241)。但是功效取决于HDL的来源而变化(Beitz等，1992，Prostaglandins，Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47149-152；Mezdour等，1995，Atherosclerosis 113237-246)。
第三，ApoA-I作用的直接证据由包括转基因动物的实验获得。转移到小鼠中的人ApoA-I基因的表达保护所述小鼠免于主动脉的损伤的发展，所述小鼠在遗传上倾向饮食诱导的动脉粥样硬化(Rubin等，1991，Nature 353265-267)。所述ApoA-I转基因还显示抑制在ApoE-缺陷小鼠中和在Apo(a)转基因小鼠中的动脉粥样硬化(Paszty等，1994，J.Clin.Invest.94899-903；Plump等，1994，PNAS.USA 919607-9611；Liu等，1994，J.Lipid Res.352263-2266)。在表达人ApoA-I的转基因兔(Duverger，1996，Circulation 94713-717；Duverger等，1996，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.161424-1429)和在转基因大鼠(Burkey等，1992，Circulation，Supplement I，86I-472，Abstract No.1876；Burkey等，1995，J.Lipid Res.361463-1473)中，观察到了相似的结果，在所述转基因大鼠中升高水平的人ApoA-I保护大鼠免于动脉粥样硬化并且在气囊血管成形术后抑制再狭窄。
目前对于高胆固醇血症和其它血脂异常的治疗在大约过去20年里，将cholesterolemic化合物分离成HDL和LDL调节剂并认识到减少LDL血液水平的需求已导致了许多药物的开发。但是，这些药物中的许多具有不理想的副作用和/或在某些患者中处置不当，特别是当与其它药物结合施用时。这些药物和治疗策略包括(1)胆汁-酸-结合树脂，其中断胆汁酸从肠到肝的再循环[例如，考来烯胺(QUESTRAN LIGHT，Bristol-Myers Squibb)，和盐酸考来替泊(COLESTID，Pharmacia & Upjohn Company)]；(2)抑制素(stains)，其通过阻断HMG CoA-涉及胆固醇生物合成的关键酶抑制胆固醇的合成[例如，洛伐他汀(MEVACOR，Merck & Co.，Inc.)，来自曲霉属菌株的天然产物，普伐他汀(PRAVACHOL，Bristol-Myers Squibb Co.)，和阿托伐他汀(LIPITOR，Warner Lambert)]；(3)烟酸是水溶性维生素B-复合物，其减少VLDL的产生并在降低LDL上是有效的；(4)通过减少VLDL级分将fibrates用于降低血清中的三酰甘油并可在一些患者群中通过相同的机制引起血浆胆固醇的适度减少[例如，安妥明(ATROMID-S，Wyeth-Ayerst Laboratories)，和吉非他奇(LOPID，Parke-Davis)]；(5)雌激素替代疗法可降低更年期后妇女的胆固醇水平；(6)已报道长链α，ω-二羧酸降低血清三酰甘油和胆固醇(见，例如，Bisgaier等，1998，J.Lipid Res.3917-30；WO 98/30530；美国专利号4,689,344；WO 99/00116；美国专利号5,756,344；美国专利号3,773,946；美国专利号4,689,344；美国专利号4,689,344；美国专利号4,689,344；和美国专利号3,930,024)；(7)公开了降低血清三酰甘油和胆固醇水平的其它化合物，包括醚(见，例如，美国专利号4,711,896；美国专利号5,756 544；美国专利号6,506,799)，和多萜醇的磷酸酯(美国专利号4,613,593)，和azolidinedione衍生物(美国专利号4,287,200)。
目前这些可获得的用于降低胆固醇的药物都没有安全地升高HDL水平和刺激RCT。确实，这些目前治疗策略中的大部分似乎作用在胆固醇转运途径上，调节饮食吸收，再循环，胆固醇的合成，和VLDL数量。
治疗高胆固醇血症的ApoA-I激动剂由于HDL的潜在作用，即ApoA-I及其相关磷脂在抗动脉粥样硬化疾病中的保护，开始了利用重组产生的ApoA-I进行的人临床试验，通过UCBBelgium停止和显然再次开始(Pharmaprojects，Oct.27，1995；IMS R & DFocus，Jun.30，1997；Drug Status Update，1997，Atherosclerosis 2(6)261-265；还见M.Eriksson at Congress，″The Role of HDL in Disease Prevention，″Nov.7-9，1996，Fort Worth；Lacko & Miller，1997，J.Lip.Res.381267-1273；和WO 94/13819)并通过Bio-Tech开始和停止(Pharmaprojects，Apr.7，1989)。使用ApoA-I还尝试进行试验以治疗败血症性休克(Opal，″ReconstitutedHDL as a Treatment Strategy for Sepsis，″IBC′s 7th International Conferenceon Sepsis，Apr.28-30，1997，Washington，D.C.；Gouni等，1993，J.LipidRes.94139-146；Levine，WO 96/04916)。然而，有许多与ApoA-I的生产和使用相关的缺陷，使其作为药物不那么理想；例如ApoA-I是大的蛋白质，生产它是困难的和昂贵的；至于在贮存过程中的稳定性，活性产品的传递和体内的半衰期，必须克服明显的生产和再现性问题。
鉴于这些缺陷，已经尝试制备模拟ApoA-I的肽。由于ApoA-I的关键活性是由于在蛋白质中的独特的二级结构特征中的多个重复的存在-类别A两亲性α-螺旋(Segrest，1974，FEBS Lett.38247-253；Segrest等，1990，PROTEINSStructure，Function and Genetics 8103-117)，大多数设计模拟ApoA-I活性的肽的努力已集中于设计形成种类A-类型的两亲性α-螺旋的肽(见，例如，在美国专利号6,376,464和6,506,799中的背景讨论；通过参考那里而将其全文并入结合在此)。
在一项研究中，Fukushima等合成了全部由周期排列的谷氨酸、赖氨酸和亮氨酸残基组成的22个残基的肽从而形成具有等-亲水性和疏水性面的两亲性α-螺旋(″ELK肽″)(Fukushima等，1979，J.Amer.Chem.Soc.101(13)3703-3704；Fukushima等，1980，J.Biol.Chem.25510651-10657)。所述ELK肽与ApoA-I的198-219片段共享41％的序列同源性。显示所述ELK肽与磷脂有效关联并模仿ApoA-I的一些物理和化学特性(Kaiser等，1983，PNAS USA 801137-1140；Kaiser等，1984，Science 223249-255；Fukushima等，1980，supra；Nakagawa等，1985，J.Am.Chem.Soc.1077087-7092)。后来发现该22个残基肽的二聚体比单体更接近地模仿ApoA-I；基于这些结果，提示被螺旋中断者(breaker)(甘氨酸或脯氨酸)在中部打断的44-聚物表示ApoA-I中的最小功能域(Nakagawa等，1985，supra)。
另一项研究包括被称作″LAP肽″的模型两亲性肽(Pownall等，1980，PNAS USA 77(6)3154-3158；Sparrow等，1981，InPeptidesSynthesis-Structure-Function，Roch and Gross，Eds.，Pierce Chem.Co.，Rockford，IL，253-256)。基于用天然载脂蛋白的片段的脂质结合研究，设计了一些名称为LAP-16，LAP-20和LAP-24的LAP肽(分别包含16，20和24个氨基酸残基)。这些模型两亲性肽与载脂蛋白没有序列同源性并被设计以具有亲水面，所述亲水面以与和载脂蛋白关联的类别A-类型两亲性螺旋结构域不同的方式构成(Segrest等，1992，J.Lipid Res.33141-166)。从这些研究，作者认为20个残基的最小长度是将脂质结合特性赋予模型两亲性肽所必需的。
用在序列的不同位置包含脯氨酸残基的LAP20的突变体进行的研究显示在脂结合和LCAT活化之间存在直接关系，但是肽单独的螺旋潜能没有导致LCAT的活化(Ponsin等，1986，J.Biol.Chem.261(20)9202-9205)。而且，接近肽中部的螺旋中断者(脯氨酸)的存在减少了其对于磷脂表面的亲和性及其活化LCAT的能力。尽管某些LAP肽显示结合磷脂(Sparrow等，supra)，存在关于在脂质存在时LAP肽螺旋的程度的争议(Buchko等，1996，J.Biol.Chem.271(6)3039-3045；Zhong等，1994，Peptide Research7(2)99-106)。
Segrest等已经合成了由18-24个氨基酸残基组成的肽，所述肽与ApoA-I的螺旋没有序列同源性(Kannelis等，1980，J.Biol.Chem.255(3)11464-11472；Segrest等，1983，J.Biol.Chem.2582290-2295)。对该序列进行具体设计以在疏水力矩(Eisenberg等，1982，Nature 299371-374)和电荷分布(Segrest等，1990，Proteins 8103-117；美国专利号4,643,988)方面模拟类A可交换的载脂蛋白的两亲性螺旋状结构域。将一个18残基的肽，“18A”肽设计为模型类别-Aα-螺旋(Segrest等，1990，supra)。用这些肽和其它具有反向电荷分布的肽，如“18R”肽进行的研究已经一致显示电荷分布对于活性是关键的；具有反向电荷分布的肽显示比18A类别A模拟物减少的脂质亲和性和在脂质存在时更低的螺旋含量(Kanellis等，1980，J.Biol.Chem25511464-11472；Anantharamaiah等，1985，J.Biol.Chem.26010248-10255；Chung等，1985，J.Biol.Chem.26010256-10262；Epand等，1987，J.Biol.Chem.2629389-9396；Anantharamaiah等，1991，Adv.Exp.Med.Biol.285131-140)。
还已经设计了一种基于人ApoA-I的螺旋的序列的包含22个氨基酸残基的“共有区”肽(Anantharamaiah等，1990，Arteriosclerosis 10(1)95-105；Venkatachalapathi等，1991，Mol.Conformation and Biol.Interactions，Indian.Acad.Sci.B585-596)。通过鉴定在人ApoA-I的推定螺旋的每个位置上的最普遍的残基来构建该序列。如上述肽，由该肽形成的螺旋具有集簇于亲水-疏水界面的正电荷氨基酸残基，集簇于亲水面中心的负电荷氨基酸残基和少于180°的疏水角。尽管该肽的二聚体在活化LCAT中稍稍有效，单体显示了较差的脂质结合特性(Venkatachalapathi等，1991，supra)。
主要基于关于上述肽的体外研究，已经出现了一组设计模拟ApoA-I的功能的肽的“规则”。显然，认为对于脂质亲和性和LCAT的活化，需要具有集簇于亲水-疏水界面的正电荷残基和集簇于亲水面中心的负电荷氨基酸残基的两亲性α-螺旋(Venkatachalapathi等，1991，supra)。Anantharamaiah等还已经指出在位于α-螺旋的疏水面中的共有区22-mer肽的位置13上的负电荷谷氨酸残基在LCAT的活化中具有重要作用(Anantharamaiah等，1991，supra)。另外，Brasseur已经指出少于180°的疏水角(pho角)是最佳脂质-载脂蛋白复合物的稳定性所需要的，并还解释在脂双层的边缘周围具有肽的饼状颗粒的形成(Brasseur，1991，J.Biol.Chem.66(24)16120-16127)。Rosseneu等还强调少于180°的疏水角是LCAT活化所需要的(WO 93/25581)。
然而，尽管在阐明设计ApoA-I激动剂的“规则”中存在进展，到目前为止，报道的最好的ApoA-I激动剂具有少于40％的完整ApoA-I的活性。文献中描述的肽激动剂没有被证实作为药物是有用的。因此，需要开发模拟ApoA-I的活性并且相对简单和生产经济的稳定分子。优选地，候选分子将调节间接和直接的RCT。这些分子将比现存的肽激动剂更小，并具有更宽的功能范围。然而，尚没有充分阐明设计RCT有效介质的“规则”并且尚不知道设计具有ApoA-I功能的有机分子的原理。
发明概述公开了一种反向胆固醇转运的介质，其包含下面的结构 其中A、B和C可以是处于任何顺序，并且其中A包含酸性氨基酸或其生物电子等排体；B包含芳族或亲脂性氨基酸或其类似物；并且C包含碱性氨基酸或其生物电子等排体，其中A或C中的至少一个包含其生物电子等排体。
在一个实施方案中，A或C中只有一个包含分子生物电子等排体。可以从未衍生化的氨基或羧基末端的氨基酸上除去α氨基或α羧基。
在另一个实施方案中，如果存在，来自氨基末端的α氨基可以用保护基加帽，所述的保护基选自由以下组成的组甲酰基、乙酰基、苯乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基(pivolyl)、9-芴基甲氧基羰基、2-萘酸、烟酸、其中n范围为1-20的CH3-(CH2)n-CO-、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、和取代的饱和的杂芳基。
在另一个实施方案中，如果存在，来自羧基末端的α羧基可以用保护基加帽，所述的保护基选自由以下组成的组胺如其中R＝H的RNH2、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、和取代的饱和的杂芳基。
酸性基团的生物电子等排体可以选自由以下组成的组
碱性基团的生物电子等排体可以选自由以下组成的组
A的生物电子等排体可以选自由以下组成的组
C的生物电子等排体可以选自由以下组成的组
所述的介质选自由以下组成的组 其中R为H、甲基、环烷基(C3-C7)，并且n＝1-10
其中R为H、甲基、环烷基(C3-C7)，并且n＝1-10 在优选的实施方案中，所述的介质可以选自由以下组成的组BenOMe-bip-苯胺、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(亚戊基(pentamethylene))丁酸、4-((S)-1-(4-胍基苯氨羰基)-2-(联苯基)乙基氨基甲酰基)苯甲酸、3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸，和4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸。
在其它优选的实施方案中，所述的介质可以选自4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸或4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸。
优选实施方案详述优选实施方案中RCT的介质模拟ApoA-I的功能和活性。在广泛的方面中，这些介质是包含三个域，酸性域、亲脂(例如芳族的)域、和碱性域的分子。所述分子优选含有带正电荷的域、带负电荷的域、和不带电的亲脂域。关于彼此域的位置可以在分子之间不同；因而，在优选实施方案中，不管每一个分子内部三个域的相对位置，所述分子介导RCT。而在一些优选实施方案中，分子模板或模型包含酸性氨基酸来源的残基、亲脂氨基酸来源的残基、和碱性氨基酸来源的残基，以任何顺序连接而形成RCT的介质，在其它的优选实施方案中，所述分子模型可以通过具有酸性、亲脂的和碱性域的单个残基来体现，例如，氨基酸，苯丙氨酸。
在一些优选实施方案中，所述RCT的分子介质通过提高直接的和/或间接的RCT途径(即，增加胆固醇的流出量)、活化LCAT的能力、和增加血清HDL浓度的能力而共享减少血清胆固醇的共同方面。
反向胆固醇运输的介质优选包含最多三个氨基酸残基、其生物电子等排体或含有碱性基、酸性基和亲脂基的任何非肽化合物。序列可以包括X1-X2-X3、X1-X2-Y3、Y1-X2-X3、或Y1-X2-Y3，其中X1是酸性氨基酸或其生物电子等排体；X2是芳族或亲脂性氨基酸或其类似物；X3是碱性氨基酸或其生物电子等排体；Y1是不含α氨基的氨基酸残基或其生物电子等排体；和Y3是不含α羧基的碱性氨基酸类或其生物电子等排体。氨基或羧基末端中的至少一个包含酸性或碱性氨基酸的生物电子等排体。当所述氨基末端上的α氨基存在时，它可以包含第一保护基，并且当羧基末端上的α羧基存在时，它可以包含第二保护基。优选所述第一和第二保护基独立地选自由以下组成的组甲酰基、乙酰基、苯乙酰基、苄基、新戊酰基(pivolyl)、2-萘酸、烟酸、其中n范围为1-20的CH3-(CH2)n-CO-、和乙酰基、苯乙酰基的酰胺，二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。C-末端要以被以下基团加帽胺如其中R＝H的RNH2、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。所述序列可以以任何和全部可能方式聚集而提供保持所述分子模型的基本特征的化合物。
在另一个实施方案中，所述介质可被结合到更大的实体中，例如约1至10个氨基酸的肽、或分子。
这里所用的术语“生物电子等排体”、“生物电子等排替换”、“生物电子等排性”及紧密相关的术语具有与本领域中一般公认的那些相同的含义。生物电子等排体是原子、离子、或者分子，其中电子的周围层可以被认为是相同的。术语生物电子等排体通常用于表示全部分子的一部分，与全部分子自身相反。生物电子等排替换涉及使用一种生物电子等排体以替换另一种，预期维持或稍微修饰所述第一生物电子等排体的生物活性。因而，这种情况下的生物电子等排体是具有相似大小、形状和电子密度的原子或原子团。由于合理的预期，即提出的生物电子等排替换将导致相似生物性质的保持，而产生生物电子等排性。这样的合理预期也可仅基于结构相似性。关于受体等的特征域，在已知大量细节的那些情况下这是特别正确的，所述特征域涉及生物电子等排体以某种方式结合到那里或者其在所述生物电子等排体上起作用。
羧酸的生物电子等排体和胍基的实例表示如下。
羧酸生物电子等排体(R＝H/烷基)
胍生物电子等排体(R＝H/烷基) 如这里所用，术语“氨基酸”也可以指的是通式NH2-CHR-COOH的分子或者在含有母体氨基酸(parent amino acid)的肽内部的残基，其中“R”是大量不同侧链之一。“R”可以指的是二十种遗传编码氨基酸之一的取代基。“R”也可以指的是不属于二十种遗传编码氨基酸之一的取代基。如这里所用，术语“氨基酸残基”指的是当它结合到另一种氨基酸时在失去水分子后保留的氨基酸部分。如这里所用，术语“氨基酸类似物”指的是氨基酸母体化合物的结构衍生物，其区别于它至少一个元件(element)。术语“修饰的氨基酸”指的是含有“R”取代基的氨基酸，所述的“R”取代基不对应于二十种遗传编码氨基酸之一。
氨基末端和羧基末端上的保护基独立地选自由以下组成的组甲酰基、乙酰基、苯乙酰基、新戊酰基(pivolyl)、2-萘酸、烟酸、其中n范围为1-20的CH3-(CH2)n-CO-、和乙酰基、苯乙酰基的酰胺，二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。C-末端可以被以下基团加帽胺如RNH2，其中R＝H、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。
某些化合物可以以互变异构形式存在。通过实施方案包含所有这样的包括非对映异构体和对映异构体的同分异构体。假设某些化合物或者以同分异构形式或其混合物形式存在。
某些化合物可以以多晶型的形式存在。多晶型性是由于以至少两种不同形式的化合物结晶而产生的。通过实施方案包含所有这样的多晶形物。假设所述某些化合物以某种多晶形物或其混合物形式存在。
RCT介导至今，设计ApoA-I激动药的努力集中在22聚物单元结构，例如Anantharamaiah等，1990，Arteriosclerosis 10(1)95-105；Venkatachalapathi等，1991，Mol.Conformation and Biol.Interactions，Indian Acad.Sci.B585-596的“共有22聚物”，其能够在脂质存在下形成两亲性α-螺旋(参见例如美国专利号6,376,464，其涉及从原子共有22聚物修饰得到的肽模拟物)。相比于较长的22聚物，利用这样相对短的肽有一些优势。例如，较短的RCT介质更容易并且更低成本地生产，它们在化学上和构象上更稳定，优选的构象保持相对刚性，在所述肽链内部有很少的或者没有分子内相互作用，并且越短的肽表现越高程度的口服可用性。这些较短肽的多拷贝可以结合到HDL或LDL，产生更受限制的大肽的相同效果。虽然ApoA-I多功能性可以基于它的多α-螺旋域的贡献，但是即使ApoA-I的单功能，例如LCAT活化，可以通过多于一个α-螺旋域在重复方式中作为媒介也是可能的。这样，在本发明的优选方面中，ApoA-I的多功能可以被指向单子域的公开的RCT介质模拟。
ApoA-I的三个功能性特征被广泛接受为ApoA-I激动剂设计用的主要标准(1)与磷脂缔合的能力；(2)活化LCAT的能力；和(3)促进胆固醇流出细胞的能力。根据优选实施方案的一些方式，RCT分子介质可以仅表现所述最后的功能性特征-提高RCT的能力。然而，经常被忽视的相当多的ApoA-I其它性质使ApoA-I成为特别有吸引力的用于治疗介入的目标。例如，ApoA-I经由受体-介导的过程指导胆固醇流量进入肝脏并且经由PLTP驱动的反应调整前-β-HDL(来自周围组织胆固醇的主受体)的生产。然而，这些特征使ApoA-I模拟分子的潜在有用性拓宽。这个为了考察ApoA-I模拟功能的全新方法将使用这里所公开的肽或氨基酸来源的小分子，以促进直接的RCT(经由HDL途径)，也促进间接的RCT(即，通过更改它们到肝脏的流向，将LDLs从循环中截取或清除)。为了能够提高间接的RCT，优选实施方案的分子介质将优选能够与磷脂缔合并且结合到肝脏(即，充当肝脏脂蛋白结合位点的配体)。
因而，导致优选实施方案的研究努力的目标是识别、设计、和合成稳定的RCT小分子介质，其表现优先的脂结合构象、通过促进直接的和/或间接的反向胆固醇运输增加胆固醇到肝脏的流量、改善血浆脂蛋白轮廓(profile)、并且随后防止动脉粥样硬化损害的进行或/和甚至促进动脉粥样硬化损害的消退。
所述优选实施方案的RCT介质可以以稳定的大批或单位剂量形式制备，例如，可以在体内使用之前重建或者再配制的冻干产品。所述优选实施方案包括在高脂血症、高胆固醇血症、冠心病、动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、早老性痴呆、多发性硬化、涉及高脂血症的病症例如炎症、和其它病症例如引起脓毒性休克的内毒素血症的治疗中的药物剂型和这种制剂的使用。
通过展示RCT介质与血浆的HDL、和LDL组分缔合并且能增加HDL和前-β-HDL颗粒浓度并且降低LDL血浆水平的工作实例，说明了优选实施方案。这样促进了直接的和间接的RCT。在人的肝细胞(HepG2细胞)中，优选实施方案的RCT介质增加了人LDL介导的胆固醇积累。RCT介质在活化PLTP方面也是有效的并因而促进前-β-HDL粒子的形成。HDL胆固醇的增加作为所述RCT中LCAT参与(未直接显示LCAT活化(体外))的间接证据。在动物模型中，优选实施方案的RCT介质的使用导致血清HDL浓度的增加。
在下面的小节中，更详细地陈述了优选实施方案，它描述了RCT介质的组成和结构，包括可以在RCT介质的结构中使用的生物电子等排体，被保护型、半剥裸型及其剥裸(denuded)型；结构和功能表征；大批或单位剂量配方的制备方法；和使用方法。
结构和功能优选实施方案的RCT介质通常是模拟ApoA-I活性的肽或其类似物。在一些实施方案中，用取代的酰胺、酰胺的电子等排体或酰胺模拟物(amidemimetic)替代所述肽中的至少一个酰胺键。另外，一种或多种酰胺键可以用不显著干涉所述肽的结构或活性的肽模拟部分或酰胺模拟部分替代。例如，在Olson等，1993，J.Med.Chem.363039-3049中描述了适合的酰胺模拟部分。
用于本文时，遗传编码的L-对映体氨基酸的缩写是常规的并且如下以小写字母指示D-氨基酸，例如，D-丙氨酸＝a，等。
表1
RCT的肽介质中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基所取代，而不会对所述肽的活性有显著不利影响，并在许多情况中甚至增加所述肽的活性。因此，优选实施方案还预期RCT的肽介质的改变或突变形式，在所述改变或突变形式中，结构中的至少一个限定的氨基酸残基被另一个氨基酸残基或其衍生物和/或类似物所取代。将认识到的是在优选实施方案中，氨基酸的取代是保守的，即，取代的氨基酸残基具有类似于被取代的氨基酸残基的物理和化学特性。
出于确定保守氨基酸残基取代的目的，可以将氨基酸方便地分成两个主要类别主要基于氨基酸侧链的物理-化学特性的亲水的和疏水的。可将这两个主要类别进一步分成更清楚定义氨基酸侧链特征的亚类。例如，可以将亲水性氨基酸类别进一步细分成酸性、碱性和极性氨基酸。可以将疏水性氨基酸类别进一步细分成非极性和芳香族氨基酸。限定ApoA-I的各种氨基酸类别如下进行定义术语“亲水性氨基酸”指按照Eisenberg等，1984，J.Mol.Biol.179125-142的标准化公认疏水性等级显示疏水性少于0的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸包括苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)和精氨酸(R)。
术语“疏水性氨基酸”指按照Eisenberg等，1984，J.Mol.Biol.179125-142的标准化公认疏水性等级显示疏水性大于0的氨基酸。遗传编码的疏水性氨基酸包括脯氨酸(P)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)。
术语“酸性氨基酸”指侧链pK值小于7的亲水性氨基酸。由于氢离子丢失，酸性氨基酸典型地在生理pH下具有带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)。
术语“碱性氨基酸”指侧链的pK值大于7的亲水性氨基酸。由于与水合氢离子相关，碱性氨基酸典型地在生理pH下具有带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括组氨酸(H)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)。
术语“极性氨基酸”指一种亲水性氨基酸，其在生理pH下具有不带电的侧链，但具有至少一个键，在所述键中被两个原子共享的一对电子被其中一个原子更紧密地拥有。遗传编码的极性氨基酸包括天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
术语“非极性氨基酸”指一种疏水性氨基酸，其在生理pH下具有不带电的侧链，并具有其中被两个原子共享的一对电子通常被两个原子的每个相同地拥有的键(即，侧链是非极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包括亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)。
术语“芳香族氨基酸”指具有带有至少一个芳香族或杂芳香族的环的侧链的疏水性氨基酸。芳香族或杂芳香族的环可以包含一个或多个取代基诸如-OH，-SH，-CN，-F，-Cl，-Br，-I，-NO2，-NO，-NH2，-NHR，-NRR，-C(O)R，-C(O)OH，-C(O)OR，-C(O)NH2，-C(O)NHR，-C(O)NRR等，其中每个R独立地是(C1-C6)烷基，取代的(C1-C6)烷基，(C1-C6)链烯基，取代的(C1-C6)链烯基，(C1-C6)炔基，取代的(C1-C6)炔基，(C5-C20)芳基，取代的(C5-C20)芳基，(C6-C26)烷芳基，取代的(C6-C26)烷芳基，5-20元的杂芳基，取代的5-20元的杂芳基，6-26元的烷杂芳基(alkheteroaryl)或取代的6-26元烷杂芳基。遗传编码的芳香族氨基酸包括苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。
术语“脂族氨基酸”指具有脂族烃侧链的疏水性氨基酸。遗传编码的脂族氨基酸包括丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)。
氨基酸残基半胱氨酸(C)是独特的，原因在于其可以与其它半胱氨酸(C)残基或其它含硫烷基的氨基酸形成二硫键。半胱氨酸(C)残基(和其它具有含-SH的侧链的氨基酸)以还原的游离-SH或是氧化的二硫键形式存在于肽中的能力影响半胱氨酸(C)残基贡献给肽净疏水还是亲水特征。尽管按照Eisenberg(Eisenberg，1984，supra)的标准化公认疏水性等级，半胱氨酸(C)显示0.29的疏水性，要理解的是尽管上面详细说明了一般分类，出于本发明的目的，将半胱氨酸(C)归类为极性亲水氨基酸。
如本领域那些技术人员将理解的，上述类别不是彼此排斥的。因此可以将具有显示两种或更多种物理-化学特性的侧链的氨基酸包括在多个类别中。例如，具有进一步被极性取代基取代的芳香族部分的氨基酸侧链，诸如酪氨酸(Y)，可以显示芳香族疏水特性和极性或亲水特性，因此可被包括在芳香族和极性类别中。任何氨基酸的合适分类对于那些本领域技术人员是显而易见的，特别是根据本文提供的详细说明书。
尽管上述定义的类别已经在遗传编码的氨基酸方面得到例证，氨基酸取代不需，并在某些实施方案中优选地不限于遗传编码的氨基酸。确实，RCT的许多优选的肽介质包含遗传非编码的氨基酸。因此，除天然存在的遗传编码氨基酸外，RCT的肽介质中的氨基酸残基可以由天然存在的非编码氨基酸和合成氨基酸所取代。
提供RCT的肽介质的有用取代的某些常见氨基酸包括，但不限于β-丙氨酸(β-Ala)和其它ω-氨基酸诸如3-氨基丙酸，2，3-二氨基丙酸(Dpr)，4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基已酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；t-丁基丙氨酸(t-BuA)；t-丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环已基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；萘基丙氨酸(Nal)；4-苯基苯丙氨酸，4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2，4-二氨基丁酸(Dbu)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；p-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)，高苯丙氨酸(hPhe)；和高丝氨酸(hSer)；羟脯氨酸(Hyp)，高脯氨酸(hPro)，N-甲基化的氨基酸和类肽(peptoids)(N-取代的甘氨酸)。
可以将本文没有具体提及的其它氨基酸残基容易地基于它们根据本文提供的定义被观察到的物理和化学性质进行分类。
可以将按照上面定义的类别的遗传编码的氨基酸和常见的非编码氨基酸的分类总结于下面的表2中。要理解的是表2仅出于举例说明的目的而不是可用于取代本文所述的RCT的肽介质的氨基酸残基和衍生物的全部的列表。
表2 常见氨基酸的分类
可以将本文没有具体提及的其它氨基酸残基容易地基于它们根据本文提供的定义被观察到的物理和化学性质进行分类。
尽管在大多数情况中，RCT的肽介质的氨基酸将被D-对映体氨基酸所取代，取代不限于D-对映体氨基酸。因此，包括在“突变”或“改变”形式定义中的还有那些取代，其中D-氨基酸被相同的L-氨基酸所取代(例如，D-精氨酸→L-精氨酸)或被相同类或亚类的L-氨基酸所取代(D-精氨酸D-赖氨酸)，反之亦然。肽可以有利地由至少一个D-对映体的氨基酸组成。认为与全部由L-氨基酸组成的肽相比，包含这些D-氨基酸的肽对于在口腔、肠或血清中的降解更稳定。
接头RCT的肽介质可以以头-尾方式(即，N-端到C-端)，头-头方式，(即N端-N端)、尾-尾方式(即，C端-C端)，或其组合进行连接或连结。接头LL可以是能够将两个肽彼此共价连接的任何双功能分子。因此，合适的接头是其中官能团能共价连接于肽的N-和/或C-端的双功能分子。适合于附着肽的N-或C-端的官能团是本领域众所周知的，影响这种共价键形成的合适的化学原理(chemistries)也是如此。
充分长度和柔性的接头包括但不限于Pro(P)、Gly(G)、Cys-Cys、Gly-Gly、H2N-(CH2)n-COOH，其中n是1至12，优选4至6；H2N-芳基-COOH和糖类。然而，在一些实施方案中，单独的接头在本质上是完全不能使用的。作为替代，酸性、亲脂性和碱性部分全部都是单分子的部分。
在一个优选实施方案中，有包括基于氨基酸的组合物的分子，所述组合物具有三个独立的区域酸性区域、芳族区域或亲脂性区域，和碱性区域。关于彼此的区域的相对定位可以在分子介质之间变化；不管这三个区域在每个分子中的位置，所述分子介导RCT。三聚体区肽可以由天然D-或L-氨基酸、氨基酸类似物，和氨基酸衍生物组成。
在另一个优选变化中，包括基于氨基酸的三聚体结构的分子介质可任选地在任一端被氨基或羧基末端上的一个或多个亲脂性基团加帽，从而提高RCT的分子介质的物理化学特性，并利用脂肪或亲脂性物质的天然或主动转运(吸收)系统到体内。加帽的基团可以是D或L对映体或非-对映体的分子或基团。在优选的实施方案中，N-末端基团选自由下列组成的组甲酰基、乙酰基、苯乙酰基、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。C-末端优选由以下基团加帽胺如RNH2，其中R＝H、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。
在RCT介质的结构内使用的生物电子等排体可以在优选的RCT介质中使用的优选的分子生物电子等排体的实例示于下面。含有胍鎓或脒基的生物电子等排体用来取代氨基酸，如精氨酸。含有羧酸的生物电子等排体用来取代氨基酸，如谷氨酸。预期用来取代碱性氨基酸，精氨酸、赖氨酸或组氨酸和酸性氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸的任何其它生物电子等排体。圆表示无环或环状结构，包括非芳香和芳香结构。
RCT介质的优选分子生物电子等排体型式的实例示于下面。
生物电子等排体系列L-氨基酸序列D-氨基酸序列 结构和功能分析可对包括上述多聚体形式的优选实施方案的RCT的介质的结构和功能进行测定从而选择活性化合物。例如，可以测定肽或肽类似物它们结合脂质、与脂质形成复合物、活化LCAT和促进胆固醇流出等的能力。
分析肽的结构和/或功能的方法和试验是本领域众所周知的。下文以工作实施例提供了优选的方法。例如，可以将下文描述的核磁共振(NMR)测定用于分析肽或肽类似物的结构--具体地，存在脂质时螺旋性的程度。使用下文所述的荧光光谱测定可以确定结合脂质的能力。可以使用下文所述的LCAT活化可容易地确定肽和/或肽类似物活化LCAT的能力。可以将下文所述的体外和体内测定用于评价半衰期、分布、胆固醇流出和对RCT的影响。
在另一个优选实施方案中，有包括基于氨基酸的组合物的分子，所述组合物具有三个独立的区域酸性区域、芳族区域或亲脂性区域，和碱性区域。关于彼此的区域的相对定位可以在分子介质之间变化；不管这三个区域在每个分子中的位置，所述分子介导RCT。
在另一个优选实施方案中，三聚体的芳香族区域可以由具有一个或多个酸性或碱性侧链的烟酸组成。
在另一个优选实施方案中，三聚体的芳香族区域可以由4-苯基苯丙氨酸组成。
用于遗传编码的氨基酸的D-对映体的缩写是表1中所示的单字母符号的小写字母等价物。例如，“R”指L-精氨酸并且“r”指D-精氨酸。除非另外指出(例如“OH”)，N-端是乙酰化了的并且C-端是酰胺化的。PhAc指苯基乙酰化了的；并且BIP指联苯基丙氨酸。
氨基酸取代不必，并在某些实施方案中优选地不局限于遗传编码的氨基酸。因此，除了天然存在的遗传编码的氨基酸之外，RCT的肽介质中的氨基酸残基可以被天然存在的非编码氨基酸和合成氨基酸取代。
优选的介质在优选的实施方案中，介质可以选自由以下组成的组BenOMe-bip-苯胺、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(亚戊基)丁酸、4-((S)-1-(4-胍基苯氨羰基)-2-(联苯基)乙基氨基甲酰基)苯甲酸、3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸、4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸、和4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸。
合成方法可使用实际上本领域-已知的任何制备肽的技术来制备优选实施方案的介质。例如，可以使用常规分步溶解或固相肽合成来制备肽。
使用常规的分步溶解或固相合成(见，例如Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins，Williams等，Eds.，1997，CRC Press，Boca Raton Fla.，和其中引用的参考文献；Solid Phase Peptide SynthesisAPractical Approach，Atherton & Sheppard，Eds.，1989，IRL Press，Oxford，England，和其中引用的参考文献)来制备RCT介质。
在常规固相合成中，第一个氨基酸的连接在化学上需要使其羧基端(C-端)末端与衍生化的树脂反应从而形成寡肽的羧基-端末端。氨基酸的α-氨基末端典型地由t-丁氧基-羰基基团(t-Boc)或9-芴基甲基氧基羰基(F-Moc)基团封闭从而阻止能够另外反应的氨基基团参与偶联反应。氨基酸的侧链基团，如果是反应性的，也被各种醚、硫醚、酯和氨基甲酸酯形式的苄基衍生的保护基所封闭(或被保护)。
接下来的步骤和随后的重复循环包括对氨基-末端(N-端)树脂结合的氨基酸(或肽链的末端残基)进行解封闭从而去除α-氨基封闭基团，随后化学添加(偶联)下一封闭的氨基酸。然而，该方法被重复很多个循环，所述循环对于合成完整目标肽链所需要的。在偶联和解封闭步骤的每个后，将树脂结合肽彻底洗去以在继续进行下面的(步骤)之前去除任何残余的反应物。固体支持颗粒在任何给定的步骤促进去除试剂，因为当被保持在具有多孔开口的柱或装置上时，可以容易地过滤和洗涤树脂和树脂-结合肽。
通过酸催化(典型地用氢氟酸或三氟乙酸)，合成肽可以从树脂上释放下来，所述酸催化将肽从树脂上裂解下来，将酰胺或羧基基团留在其C-末端氨基酸上。酸解裂解还在肽的合成中用于从氨基酸的侧链上去除保护基。然后可以通过各种层析法的任何一个将得到的肽进行纯化。
按照一个优选的实施方案，用Na-Fmoc化学通过固相合成方法来合成RCT的肽和肽衍生物介质。Na-Fmoc保护氨基酸和Rink酰胺MBHA树脂获自Novabiochem(San Diego，CA)或Chem-Impex Intl(Wood Dale，IL)，并且Sasrin树脂购自Aldrich(Milwaukee，WI)。其它的化学品和溶剂购自如下来源三氟乙酸(TFA)、茴香醚、1，2-乙二硫醇(1，2-ethanedithiol)、茴香硫醚、哌啶、乙酸酐、2-萘酸和新戊酸(Pivaloic acid)(Aldrich，Milwaukee，WI)，HOBt和NMP(Chem-Impex Intl，Wood Dale，IL)，二氯甲烷、甲醇和HPLC级溶剂获自Fischer Scientific，Pittsburgh，PA。通过LC/MS检查肽的纯度。使用在C18-结合的硅胶柱(Tosoh Biospec制备柱，ODS-80TM，Dim215mm×30cm)上的制备HPLC系统(Agilent technologies，1100Series)实现肽的纯化。使用梯度系统[50％-90％的B溶剂(具有0.1％的TFA的乙腈∶水60∶40)洗脱肽。
使用Rink酰胺MBHA树脂(0.5-0.66mmol/g)或Sasrin树脂(0.6-1.1mmol/g)通过固相方法以分步方式合成所有的肽。侧链的保护基是Arg(Pbf)、Glu(OtBu)和Asp(OtBu)。使用1.5-3倍过量的保护氨基酸，使每个Fmoc保护的氨基酸与该树脂偶联。偶联试剂是N-羟基苯并三唑(HOBt)和二异丙基碳二亚胺(DIC)，并且通过水合茚三酮试验监测偶联。用在NMP中的20％哌啶30-60分钟处理去除Fmoc基团，然后用CH2Cl2、在CH2Cl2中的10％TEA、甲醇和CH2Cl2连续洗涤。偶联步骤后，进行乙酰化作用或如果需要使用其它的加帽基团。
使用TFA、茴香硫醚、乙二硫醇和茴香醚(90∶5∶3∶2，v/v)(4-5小时于室温)的混合物将肽从肽-树脂上裂解下来并去除所有的侧链保护基。将粗肽混和物从烧结的漏斗中过滤，用TFA洗涤它(2-3次)。将过滤物浓缩为稠浆，并加入到冷醚中。在冷藏箱中保持过夜并离心后，肽沉淀为白色固体。将溶液倾去并用醚彻底洗涤所述固体。将得到的粗肽溶解在缓冲液(具有0.1％TFA的乙腈∶水60∶40)中并进行干燥。使用具有50-90％B的梯度系统的制备C-18柱(反相)通过HPLC在40分钟内纯化粗肽[缓冲液A包含0.1％(v/v)TFA的水，缓冲液B包含0.1％(v/v)TFA的乙腈∶水(60∶40)]。在Speedvac上浓缩纯化级分。产率5％变化到20％。
备选地，优选实施方案的肽可以通过链段缩合的方式进行制备，即将小组成肽链连接在一起形成更大的肽链，如，例如描述于Liu等，1996，Tetrahedron Lett.37(7)933-936；Baca等，1995，J.Am.Chem.Soc.1171881-1887；Tam等，1995，Int.J.Peptide Protein Res.45209-216；Schnolzer and Kent，1992，Science 256221-225；Liu and Tam，1994，J.Am.Chem.Soc.116(10)4149-4153；Liu and Tam，1994，PNAS USA 916584-6588Yamashiro and Li，1988，Int.J.Peptide Protein Res.31322-334；Nakagawa等，1985，J.Am Chem.Soc.1077087-7083；Nokihara等，1989，Peptides 1988166-168；Kneib-Cordonnier等，1990，Int.J.Pept.Protein Res.35527-538；将它们说明书全文全部内容并入此作为参考)中。其它用于合成优选实施方案的肽的方法描述在Nakagawa等，1985，J.Am.Chem.Soc.1077087-7092。
对于通过链段缩合制备的肽，缩合步骤的偶联效率可以通过增加偶联时间而明显增加。典型地，增加偶联时间导致产物外消旋作用的增加(Sieber等，1970；Helv.ChimActa 532135-2150)。使用有机化学的标准技术，可以对包含N-和/或C-末端封闭基团的RCT的介质进行制备。例如，酰化肽的N-末端或酰胺化或酯化肽的C-末端的方法是本领域众所周知的。在N-和/或C-端进行其它修饰的方式将对于本领域那些技术人员是显而易见的，如保护任何侧链官能度可能对于连接末端封闭基团是必须的一样。
同样地，例如，对于肽的N-末端或肽的C-末端上的保护基去保护的方法在本领域中是众所周知的。在N-和/或C-末端进行其它修饰的方法，如除去末端保护基所必需的任何侧链官能度的去保护方法一样，对于本领域技术人员是明显的。
制药上可接受的盐(抗衡离子)可以通过离子交换色谱或其它本领域众所周知的方法常规地制备。
在RCT介质的结构内使用的生物电子等排体下面的合成方案是可以用来合成带有生物电子等排体的RCT介质的方法的实例。
方案1
方案2 方案3
方案4 药剂剂型和治疗方法可以将优选实施方案的RCT介质用于治疗动物特别是包括人的哺乳动物中的任何疾病，对于所述动物降低血清胆固醇是有益的，所述疾病包括，但不限于其中增加血清HDL浓度、活化LCAT和促进胆固醇流出以及RCT是有利的疾病。这些疾病包括，但不限于高脂血，尤其是高胆固醇血症，和心血管疾病诸如动脉粥样硬化(包括动脉粥样硬化的治疗和预防)以及冠状动脉疾病；再狭窄(例如，预防或治疗作为医疗方法诸如气囊血管成形术的结果形成的动脉粥样斑块)；以及经常导致败血症性休克的其它疾病，诸如局部缺血，和内毒素血症。可以将RCT的介质单独使用或用在与其它用于治疗前述疾病的药物的联合疗法中。这些疗法包括，但不限于，同时或顺序使用涉及的药物。
例如，在治疗高胆固醇血症或动脉粥样硬化中，可以将RCT的分子介质的制剂与目前使用的任何一种或多种降低胆固醇疗法一起施用；例如，胆汁-酸树脂，烟酸和/或抑制素。这种联合治疗方案可以产生特别有利的治疗效应，因为每种药物作用在胆固醇合成和转运的不同目标上发挥作用；即，胆汁-酸树脂影响胆固醇再循环、乳糜微粒和LDL群体(poplulation)；烟酸主要影响VLDL和LDL群体；抑制素抑制胆固醇合成，减少LDL群体(也许增加LDL受体表达)；而RCT的介质影响RCT，增加HDL，增加LCAT活性并促进胆固醇的流出。
RCT的介质可与fibrates结合使用以治疗高脂血症、高胆固醇血症和/或心血管疾病诸如动脉粥样硬化。
RCT的介质可以与目前使用的抗菌剂和抗炎药结合使用以治疗内毒素诱导的败血症性休克。
可以将RCT的介质配制为基于分子的组合物或分子-脂质复合物，所述基于分子的组合物或分子-脂质复合物可以以多种方式，优选地通过口服给药，施用给受试者以将RCT的介质传递到循环中。下面描述示例性制剂和治疗方案。
在另一个优选的实施方案中，提供用于改善和/或预防高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的一个或多个症状的方法。所述方法优选地包括将优选实施方案的一种或多种化合物(或这些化合物的模拟物)施用给生物体，优选地，哺乳动物，更优选地人。如本文所述，可以按照许多标准方法的任一个施用所述的一种或多种化合物，所述方法包括，但不限于注射剂、栓剂、鼻腔喷雾剂、定时释放植入物、透皮贴片等。在一个特别优选的实施方案中，将所述的一种或多种化合物口服施用(例如，作为糖浆、胶囊或片剂)。
所述方法包括施用优选实施方案的单一化合物或施用两种或更多种不同的的化合物。可以将化合物提供为单体或二聚的、低聚的或聚合的形式。在某些实施方案中，多聚体形式可以包括缔合单体(例如离子或疏水性连接)而某些其它多聚体形式包括共价连接的单体(直接连接或通过接头)。
尽管对优选实施方案进行的描述是关于在人中的使用，其还适合于动物，例如兽医的应用。因此，优选的生物体包括，但不限于，人，非-人灵长类、犬、马、猫、猪、有蹄类动物(ungulates)、largomorphs等。
优选实施方案的方法不限于显示高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的一个或多个症状(例如，高血压、斑块形成和破裂，临床事件诸如心脏病发作(heart attack)的减少，绞痛，或中风，高水平的低密度脂蛋白，高水平的极低密度脂蛋白，或炎性蛋白质等)的人或非人动物，而且在预防性情况下是有用的。因此，可以将优选实施方案的化合物(或其模拟物)施用给生物以预防高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的一个或多个症状的发作/发展。关于这点特别优选的受试者是显示动脉粥样硬化的一个或多个风险因子(例如，家族史，高血压，肥胖症，高酒精消费，吸烟，高血液胆固醇，高血液三酰甘油，升高的血液LDL、VLDL、IDL，或低HDL，糖尿病，或糖尿病的家族史，高血液脂质，心脏病发作，绞痛或中风等)的受试者。优选的实施方案包括在治疗高脂血症、高胆固醇血症、冠心病、动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、早老性痴呆、多发性硬化、涉及高脂血症的病症例如炎症、和其它病症例如引起感染性休克的内毒素血症中的药物剂型和这种制剂的应用。
在一个优选的实施方案中，使用在涉及RCT的介质的合成和纯化的前面部分中所述的任何技术，可以合成或制备RCT的分子介质。通过冷冻干燥该化合物-从而制备再形成的批量(bulk)或制备可以通过在施用给受试者之前，用灭菌水或合适的灭菌缓冲溶液通过再次水合而重构的个体等分试样或剂量单位，可以制备具有长保存限期的稳定制剂。
在另一个优选的实施方案中，可以在分子-脂质复合物中配制和施用RCT的介质。该方法具有一些优势，因为所述复合物在循环中应具有增加的半衰期，特别是当复合物具有与HDL，尤其是前-β-1或前-β-2 HDL群体相似的大小和密度时。可以通过下面所述的许多方法的任一个方便地制备分子-脂质复合物。可以通过冷冻干燥-下面描述的作为优选方法的共冷冻干燥方法制备具有长保存期限的稳定制剂。可以将冻干的分子-脂质复合物用于制备药物再形成(pharmaceutical reformulation)的批量，或用于制备可以通过在施用给受试者前用灭菌水或合适的缓冲溶液通过再次水合而重构的个体等分试样或剂量单位。
可以将本领域技术人员众所周知的多种方法用于制备分子-脂质小泡或复合物。为此目的，可以使用许多可供制备脂质体或脂蛋白体的技术。例如，可以用合适的脂质对化合物进行共超声波(cosonicated)(使用水浴或探针超声波仪)从而形成复合物。或者，所述化合物可以与预先形成的脂质小泡结合，导致分子-脂质复合物的自发形成。在另一个备选方法中，可以通过去污剂透析方法形成分子-脂质复合物；例如，将化合物、脂质和去污剂的混合物进行透析从而去除去污剂并重构或形成分子-脂质复合物(例如，见Jonas等，1986，Methods in Enzymol.128553-582)。
尽管前述方法是可行的，在费用、产量、再现性和安全性方面，每种方法有其自己特殊的生产问题。按照一种优选的方法，将化合物和脂质在一种溶剂体系中进行结合，所述溶剂系统共溶解每种成分并可通过冷冻干燥彻底去除。为此目的，应仔细选择溶剂对以确保两亲性化合物和脂质的共溶解。在一个实施方案中，可以将结合到颗粒中的一种或多种化合物或其衍生物/类似物溶解在水性或有机溶剂或溶剂(溶剂1)的混合物中。将(二氧磷基)脂成分溶解在水性或有机溶剂或可与溶剂1混溶的溶剂(溶剂2)的混合物中，并将两种溶液混和。或者，可以将化合物和脂质结合在共溶剂体系中；即可混溶的溶剂的混合物。化合物与脂质的合适比例首先根据经验确定从而使得到的复合物具有合适的物理和化学特性；即通常(但不是必需)在大小上与HDL相似。将得到的混合物冷冻并冻干至干燥。有时，必须将另外的溶剂加入混合物中以促进冷冻干燥。该冻干产物可以储存长时间并将保持稳定。
可以将冻干的产物重构从而获得分子-脂质复合物的溶液或混悬液。为此目的，可以用水溶液将冻干的粉末再水合到合适的体积(经常是方便于静脉内注射的5mgs化合物/ml)。在一个优选的实施方案中，用磷酸盐缓冲溶液或生理盐水溶液将冻干的粉末进行再水合。必须将所述混合物进行搅拌或涡流以促进再水合，并在大多数情况中，应在等于或大于复合物的脂质成分的相变温度的温度下进行重构步骤。在数分钟内，得到重构的脂质-蛋白质复合物的清澈制剂。
可以对得到的重构制剂的等分试样进行表征从而证实制剂中的复合物具有所需的大小分布；例如，HDL的大小分布。可以将凝胶过滤层析用于此目的。例如，可以使用Pharmacia Superose 6 FPLC凝胶过滤层析系统。所用的缓冲液包含在50mM，pH7.4的磷酸缓冲液中的150mM NaCl。典型样品体积是20-200微升的包含5mgs化合物/ml的复合物。柱的流动速度是0.5mls/分钟。将一系列已知分子量和Stokes直径的蛋白质以及人HDL优选地用作校准柱的标准。通过波长254或280nm的吸光度或光散射来监测蛋白质和脂蛋白复合物。
优选实施方案的RCT的介质可以与多种脂质复合，所述脂质包括饱和、不饱和、天然和合成脂质和/或磷脂。合适的脂质包括，但不限于，小烷基链磷脂，例如，卵磷脂酰胆碱，大豆磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱，1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱，1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱二油酰磷脂酰乙醇胺，二月桂酰磷脂酰甘油 磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，神经鞘磷脂，神经鞘脂类，磷脂酰甘油，二磷脂酰甘油，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，二棕榈酰磷脂酰甘油，二硬脂酰磷脂酰甘油，二油酰磷脂酰甘油，二肉豆蔻酰磷脂酸，二棕榈酰磷脂酸，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸，二棕榈酰磷脂酰丝氨酸，脑磷脂酰丝氨酸，脑神经鞘磷脂，二棕榈酰神经鞘磷脂，二硬脂酰神经鞘磷脂，磷脂酸，半乳糖脑苷脂，神经节苷脂，脑苷脂，二月桂基磷脂酰胆碱，(1，3)-D-mannosyl-(1，3)甘油二酯，氨基苯基糖苷，3-胆甾烯基-6′-(糖基硫代)己基醚糖脂，和胆固醇及其衍生物。
优选实施方案的药物制剂在适合于体内施用及传递的药用载体中包含作为活性组分的RCT的分子介质或分子-脂质复合物。因为所述化合物可能包含酸性和/或碱性末端和/或侧链，可以将所述化合物以游离酸或碱形式，或以药用盐形式包括在制剂中。
可注射的制剂包括在水性或油性赋形剂中的活性组分的无菌混悬液、溶液或乳状液。所述组合物还可以包含配方剂(formulating agents)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于注射的制剂可以以单位剂型，例如以安瓿或多剂量容器形式存在，并可以包含另外的防腐剂。
或者，可注射的制剂可以以在使用前用合适的赋形剂进行重构的粉末形式进行提供，所述赋形剂包括，但不限于无菌的无热原的水，缓冲液，葡萄糖溶液等。为此目的，可以冻干RCT的介质，或可以制备共-冻干的分子-脂质复合物。可以以单位剂型的形式提供贮存的制剂并在体内使用前进行重构。
对于延长的传递，可以将活性组分配制为通过植入进行施用的长效制剂；例如，皮下、皮内或肌内注射。因此，例如，可以将活性组分与合适的聚合或疏水性材料一起进行配制(例如，作为在可接受的油中的乳状液)或与离子交换树脂一起进行配制，或配制为少量可溶的衍生物；例如。作为RCT的介质的少量可溶的盐形式。
或者，可以使用被生产为缓慢释放活性组分以进行经皮吸收的粘着盘或贴片的透皮传递系统。为此目的，可以使用渗透增强剂以促进活性组分的透皮渗透。可以通过将优选实施方案的RCT的介质或分子-脂质复合物结合到硝化甘油贴片中以使用在患有局部缺血性心脏疾病和高胆固醇血症的患者中以获得特别的益处。
对于口服施用，药物组合物可以采取通过传统方式用药用赋形剂诸如粘合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)进行制备的片剂或胶囊形式。所述片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。进行口服施用的液体制剂可以采用，例如溶液、糖浆或混悬液的形式，或它们可作为在使用前用水或其它合适的赋形剂组构的干燥产品存在。这些液体制剂可以通过常规方法用药用添加剂诸如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性赋形剂(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分级分离的植物油)；和防腐剂(例如，对-羟基苯甲酸甲酯或对-羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)进行制备。所述制剂还可包含合适的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。可以将口服施用的制剂合适地配制以获得活性化合物的控释。
对于颊含施用，所述组合物可以采取以常规方法配制的片剂或锭剂的形式。对于直肠和阴道施用路径，可以将活性组分配制为溶液(对于滞留型灌肠剂)栓剂或软膏剂。
对于通过吸入进行施用，使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，以来自压缩包装或喷雾器的气溶胶喷雾剂形式来方便地传递活性组分。在压缩的气溶胶情形中，可以通过提供阀以传递计量来确定剂量单位。可以配制用在吸气器或吸入器中的例如，明胶的胶囊和药筒，其包含化合物的粉末混合物和合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉。
如果需要，所述组合物可以存在于包装或分配器装置中，其可以包含一个或多个单位剂型，所述剂型包含活性组分。所述包装可以例如，包含金属或塑料箔，诸如泡眼包装。所述包装或分配器可配有施用的说明书。
可以通过确保在循环中的生物利用度的任何合适的路径来施用优选实施方案的RCT的分子介质和/或分子-脂质复合物。这可以通过包括静脉内(IV)、肌内(IM)、皮内、皮下(SC)和腹膜内(IP)注射的施用的肠胃外路径来完成。然而，可以使用其它施用途径。例如，如果将合适的制剂(例如，肠溶包衣)用于避免或最小化活性组分在，例如口腔粘膜、胃和/或小肠的苛刻环境中的降解，经过胃肠道的吸收可以通过施用的口服路径(包括但不限于摄取、颊含和舌下路径)来完成。口服施用具有易于应用和因此提高顺应性的优势。或者，可以将经过粘膜组织的施用诸如阴道和直肠施用方式用于避免或最小化在胃肠道中的降解。在另一个备选方法中，可以将优选实施方案的制剂经过皮肤地(例如，透皮地)，或通过吸入进行施用。将理解的是优选的路径可以随受者的疾病、年龄和顺应性而变化。
所用的RCT的分子介质或分子-脂质复合物的实际剂量将随施用的路径而变化，并应被调整以获得1.0mg/l-2g/l的循环血浆浓度。本文所述的在动物模型系统中获得的数据显示优选实施方案的ApoA-I激动剂与HDL成分相关，并在人中具有约5天的预计的半衰期。因此，在一个实施方案中，可以通过以介于0.5mg/kg-100mg/kg之间的剂量，一星期一次的注射施用RCT的介质。在另一个实施方案中，理想的血清水平可通过持续的输注或通过提供约0.1mg/kg/小时-100mg/kg/小时的间歇输注来维持。
不同的RCT介质的毒性和治疗功效可以利用细胞培养或实验动物中用于确定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)的标准制药程序而确定。毒性和治疗效应之间的剂量比率是治疗指数并且可将其表示为比率LD50/ED50。优选显示大的治疗指数的ApoA-I分子激动剂。
其它应用可将优选实施方案的RCT激动剂的介质用在体外测定中以测量血清HDL，例如用于诊断目的。因为RCT的介质与血清的HDL和LDL成分相关，可以将激动剂用作HDL和LDL群体的“标记”。而且，可以将激动剂用作在RCT中有效的HDL的亚群的标记。为此目的，可将激动剂加入患者的血清样品中或与其混合；在合适的温育时间后，通过检测结合的RCT的介质可以测定HDL的成分。这可以通过使用标记的激动剂(例如，放射性标记，荧光标记，酶标记，染料等)，或使用特异于激动剂的抗体(或抗体片段)的免疫测定来完成。
或者，可以将标记的激动剂用在成像方法(例如，CAT扫描，MRI扫描)中以显现循环系统，或监测RCT，或显现HDL在脂条、动脉粥样硬化损伤等中的聚集。(其中HDL应在胆固醇流出中是有活性的)。
反向胆固醇转运的介质的分析的测定LCAT活性测定可通过各种体外测定，例如，通过它们在体外活化LCAT的能力来评价按照优选实施方案的RCT的介质的潜在临床功效。在LCAT测定中，用等量的化合物或ApoA-I(分离自人血浆)对由卵磷脂酰胆碱(EPC)或1-棕榈酰-2-油基-磷脂酰-胆碱(POPC)与放射性标记的胆固醇组成的底物小泡(小的单层小泡或“SUVs”)进行预温育。通过添加LCAT(纯化自人血浆)来起始反应。被用作阳性对照的天然ApoA-I，表现了100％的活化活性。可将分子介质的“比活”(即活性的单位(LCAT活化)/质量单位)计算为获得最大LCAT活化的介质的浓度。例如，可对一系列浓度的化合物(例如，有限稀释)进行测定以确定化合物的“比活”--分析中在特定时间点(例如1小时)获得最大LCAT活化(即，胆固醇向胆固醇酯的百分比转变)的浓度。当使用针对化合物的浓度在例如1小时时的胆固醇的标绘百分比转变时，可将“比活”确定为在标绘曲线上获得平稳期的化合物的浓度。
底物小泡的制备用在LCAT测定中的小泡是由摩尔比为20∶1的卵磷脂(EPC)或1-棕榈酰-2-油基-磷脂酰胆碱(POPC)与胆固醇组成的SUVs。为了制备足够40次测定的小泡贮存溶液，将7.7mg EPC(或7.6mg POPC；10μmol)，78μg(0.2μmol)4-14C-胆固醇，116μg胆固醇(0.3μmol)溶解于5ml的二甲苯中并进行冻干。其后，将4ml的测定缓冲液加入干燥粉末中并在氮气氛下于4℃超声处理。超声处理条件Branson 250超声波仪，10mm探头(tip)，6×5分钟；测定缓冲液10mM Tris，0.14M NaCl，1mM EDTA，pH7.4。将超声处理的混合物在14,000rpm(16,000×g)离心6次，每次5分钟以去除钛颗粒。将得到的澄清溶液用于酶测定。
LCAT的纯化对于LCAT的纯化，将葡聚糖硫酸酯/Mg2+处理的人血浆用于获得缺乏脂蛋白的血清(LPDS)，将其在苯基琼脂糖(Phenylsepharose)、Affigelblue、ConcanavalinA sepharose和抗-ApoA-I亲和层析法上顺序进行色谱分析。
制备LPDS为了制备LPDS，将500ml的血浆加入50ml葡聚糖硫酸酯(分子量＝500,000)溶液。搅拌20分钟。在3000rpm(16,000×g)于4℃离心30分钟。应用上清液(LPDS)进行进一步纯化(ca.500ml)。
苯基琼脂糖(Phenylsepharose)层析法将下列材料和条件用于苯基琼脂糖层析法。固相苯基琼脂糖快速流动，高subst.级，PharmaciacolumnXK26/40，凝胶床高度33cm，V＝ca，175ml流动速度200ml/小时(样品)洗涤200ml/小时(缓冲液)洗脱80ml/小时(蒸馏水)缓冲液10mM Tris，140mM NaCl，1mM EDTA pH7.4，0.01％叠氮化钠。
在Tris-缓冲液中平衡柱，将29g NaCl加入500ml的LPDS中并加样到柱上，用数体积的Tris缓冲液洗涤直到在280nm波长的吸收大约处于基线，然后用蒸馏水开始洗脱。合并包含蛋白质的级分(合并大小180ml)并将其用于Affigelblue层析法。
Affigelblue层析法将苯基琼脂糖合并物对着20mM Tris-HCl，pH7.4，0.01％叠氮化钠于4℃透析过夜。通过超滤(Amicon YM30)，将合并的体积减少到50-60ml，并装载到Affigelblue柱上。固相Affigelblue，Biorad，153-7301柱，XK26/20，凝胶床高度ca.13em；柱体积约70ml。流动速度装载15ml/小时洗涤50ml/小时。在Tris-缓冲液中平衡柱。将苯基琼脂糖合并物加样到柱上。平行开始以收集级分。用Tris-缓冲液进行洗涤。将合并的级分(170ml)用于ConA层析法。
ConA层析法通过Amicon(YM30)将Affigelblue合并物减少到30-40ml并对着ConA起始缓冲液(1mM Tris HCl pH7.4；1mM MgCl2，1mM MnCl2，1mMCaCl2，0.01％叠氮化钠)在4℃透析过夜。固相ConA sepharose(Pharmacia)柱XK26/20，凝胶床高度14cm(75ml)。流动速度装载40ml/小时，洗涤(用起始缓冲液)90ml/小时，洗脱50ml/小时，在1mM Tris，pH7.4中的0.2M甲基-α-D-甘露糖苷。收集甘露糖苷洗脱液的蛋白质级分(110ml)，并通过超滤(YM 30)将体积减少到44ml。将ConA合并物分成贮存于-20℃的2ml的等分试样。
抗-ApoA-I亲和层析法在已经与抗-ApoA-I abs共价偶联的Affigel-Hz材料(Biorad)上进行抗-ApoA-I亲和层析法。柱XK16/20，V＝16ml。用pH7.4的PBS平衡柱。在装载到柱上之前，将2ml的ConA合并物向着PBS进行透析2小时。流动速度装载15ml/小时洗涤(PBS)40ml/小时。将合并的蛋白质级分(V＝14ml)用于LCAT测定。用0.1M的柠檬酸缓冲液(pH4.5)再生柱以洗脱结合的A-I(100ml)，并在该方法后立即用PBS再次平衡。
RCT的介质的药物代谢动力学可以将随后的实验流程用于证实RCT的介质在循环中是稳定的并与血浆的HDL成分缔合。
化合物激动剂的合成和/或放射性标记通过达到500-900cpm/ng的比活的一氯化碘方法来制备125I-标记的LDL(Goldstein和Brown 1974 J.Biol.Chem.2495153-5162)。如所述(Goldstein和Brown 1974 J.Biol.Chem.2495153-5162)在500-900cpm/ng的终比活上，确定培养的人成纤维细胞的低密度脂蛋白的结合和降解。在每种情形中，通过用10％(wt/vol)的三氯乙酸(TCA)于4℃温育脂蛋白，＞99％的放射性是可沉淀的。将酪氨酸残基与每种化合物的N-末端连接以使其能被放射性碘标记。使用Iodo-Beads(Pierce Chemicals)，并按照生产商的手册，用Na125I(ICN)将化合物放射性碘标记到800-1000cpm/ng的比活。透析后，化合物的可沉淀的放射性(10％TCA)一直是＞97％。
或者，可以通过将14C-标记的Fmoc-脯氨酸偶联为N-末端氨基酸来合成放射性标记的化合物。可以将L-[U-14C]X，比活9.25GBq/mmol用于合成包含X的标记的激动剂。可以按照Lapatsanis，Synthesis，1983，671-173进行合成。简而言之，将250μM(29.6mg)未标记的L-X溶解于225μl的9％Na2CO3溶液并加入9.25MBq(250μM)14C-标记的L-X的溶液(9％Na2CO3)中。将液体冷却至0℃，与在0.75ml DMF中的600μM(202mg)的9-芴基甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-OSu)混合，并于室温摇动4小时。其后，用二乙醚(2×5ml)和氯仿(1×5ml)抽提所述混合物，用30％HCl酸化剩余的水相并用氯仿(5×8ml)抽提。通过Na2SO4干燥有机相，将其过滤除去并将体积在氮流动下减到5ml。通过用UV检测的TLC(CHCl3∶MeOH∶Hac，9∶1∶0.1v/v/v，固定相HPTLC硅胶60，Merck，Germany)估计纯度，例如放射化学纯度线性分析器，Berthold，Germany；反应产率可以是约90％(如通过LSC所确定)。
将包含14C-肽X的氯仿溶液直接用于肽的合成。如上所述，可以自动合成包含氨基酸2-22的树脂并将其用于合成。通过Edman降解来确定肽的序列。偶联的进行如前面所述，除了优选使用替代TBTU的HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(uroniumhexafluorophosphate))以外。手动进行用未标记的Fmoc-L-X进行的第二次偶联。
小鼠中的药物代谢动力学在每个实验中，可将300-500μg/kg(0.3-0.5mg/kg)[或更多诸如2.5mg/kg]放射性标记的化合物腹膜内注射到小鼠中，用正常小鼠食物(Chow)或导致动脉粥样硬化的Thomas-Harcroft改进的食物(导致VLDL和IDL胆固醇的剧烈升高)对所述小鼠进行喂养。在多个时间间隔取血液样品以进行血浆中放射性的评价。
在人血清中的稳定性可将100μg标记的化合物可与2ml新鲜人血浆(于37℃)混和，并被立即去脂质化(delipidated)(对照样品)或在于37℃温育8天后被去脂质化(测试样品)。通过用等体积的2∶1(v/v)氯仿∶甲醇抽提脂质来进行去脂质化。将样品装载到反相C18HPLC柱上并用线性梯度(在33分钟内25-58％)的乙腈(包含0.1％w的TFA)进行洗脱。洗脱图谱根据吸光度(220nm)和放射性绘制。
前-β样颗粒的形成可通过在密度d＝1.21g/ml处的KBr密度超离心来分离人HDL以获得上层级分，随后通过Superose 6凝胶过滤层析法来从其它脂蛋白中分离HDL。基于Bradford蛋白测定所确定的蛋白质含量，用生理盐水将分离的HDL调整为1.0mg/ml的终浓度。从分离的HDL制备物中移出300μl的等分试样，并用100μl标记的化合物(0.2-1.0μg/μl)于37℃温育2小时。分析多个单独的温育物，包括包含100μl的生理盐水的空白和四个稀释度的标记的化合物。例如(i)0.20μg/μl的化合物HDL比率＝1∶15；(ii)0.30μg/μl化合物HDL比率＝1∶10；(iii)0.60μg/μl的化合物∶HDL比率＝1∶5；和(iv)1.00μg/μl的化合物∶HDL比率＝1∶3。2小时温育后，将200μl的样品的等分试样(总体积＝400μl)装载到Superose 6凝胶过滤柱上以进行脂蛋白分离和分析并将100μl用于确定总的装载的放射性。
介质与人脂蛋白的关联可通过与每个脂蛋白类别(HDL、LDL和VLDL)和不同脂蛋白类别的混合物一起温育标记的化合物来确定分子介质与人脂蛋白级分之间的关联。通过在d＝1.21g/ml的KBr密度梯度超离心来分离HDL、LDL和VLDL，并通过在Superose 6B柱大小排阻柱上的FPLC进行纯化(用0.7ml/分钟的流速和1mM Tris(pH8)，115mM NaCl，2mM EDTA和0.0％NaN3的运行缓冲液进行层析法)。标记的化合物与HDL，LDL和VLDL一起在1∶5的化合物∶磷脂比率(质量比率)下于37℃温育2小时。所需量的脂蛋白(基于产生1000μg所需的量的体积)与0.2ml的化合物贮存液(1mg/ml)混和并使用0.9％NaCl使溶液达到2.2ml。
于37℃温育2小时后，移出等分试样(0.1ml)以确定总放射性(例如，取决于标记的同位素，通过液体闪烁计数或γ计数)，用KBr将剩余的温育混合物的密度调整到1.21g/ml，并使用Beckman台式超速离心机在TLA100.3转子中将所述样品在100,000rpm(300,000g)于4℃离心24小时。通过从每个样品的上层移出0.3ml的等分试样将得到的上清液进行分级分离，共5个级分，并将0.05ml的每个级分用于计数。上两个级分包含漂浮脂蛋白，其它的级分(3-5)对应于溶液中的化合物。
与HDL脂质的选择性结合将人血浆(2ml)与20、40、60、80和100μg的标记的化合物一起于37℃温育2小时。通过将密度调整为1.21g/ml并在TLA 100.3转子中于100,000rpm(300,000g)，4℃离心36小时分离脂蛋白。取上层900μl(在300μl级分中)进行分析。计算来自每个300μl级分的50μl的放射性并通过FPLC(Superose 6/Superose 12组合柱)分析来自每个级分的200μl。
将反向胆固醇转运的介质应用在动物模型系统中可在兔或其它合适的动物模型中证实优选实施方案的RCT的介质的功效。
制备磷脂/化合物复合物按照胆酸盐(cholate)透析方法制备由磷脂(DPPC)和化合物组成的小的盘状颗粒。将磷脂溶解于氯仿并在氮气流下干燥。将化合物以1-2mg/ml的浓度溶解在缓冲液(盐水)中。将脂质薄膜再溶解(43℃)于包含胆酸盐的缓冲液中并以3∶1的磷脂/化合物重量比率将化合物溶液加入。于43℃过夜温育所述混合物并于43℃(24小时)、室温(24小时)和4℃(24小时)进行透析，在温度点缓冲液(大体积)变化3次。将所述复合物过滤除菌(0.22μm)以进行注射并贮存于4℃。
化合物/磷脂颗粒的分离和表征将所述颗粒在凝胶过滤柱上(Superose 6 HR)进行分离。通过在每个级分中测量磷脂浓度来鉴定包含所述颗粒的峰的位置。从洗脱体积，可确定斯托克斯半径(Stokes radius)。通过在16小时酸水解后测量苯丙氨酸的含量(通过HPLC)来确定复合物中化合物的浓度。
兔的注射用一剂量的磷脂/化合物复合体(5或10mg/kg体重，表示为化合物)以不超过10-15ml的单一推注形式静脉注射雄性新西兰白兔(2.5-3kg)。在操作之前使所述动物稍微镇静。在注射之前和之后5、15、30、60、240和1440分钟取血液样品(在EDTA上收集)。确定每个样品的血细胞比容(Hct)。在分析前将样品等分，并存于-20℃。
兔血清的分析使用商购分析，例如按照生产商的手册(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany和Biomerieux，69280，Marcy-L′etoile，France)酶促测定总血浆胆固醇，血浆三酰甘油和血浆磷脂。
可通过在蔗糖密度梯度中旋转来确定在血浆分离成其脂蛋白级分后所获得的级分的血浆脂蛋白轮廓。例如，收集级分并通过常规酶促分析在对应于VLDL、ILDL、LDL和HDL脂蛋白密度的级分中测量磷脂和胆固醇的水平。
合成带有生物电子等排体的RCT介质使用Sasrin树脂(4-羟基-2-甲氧基苄基醇，Aldrich)和Rink酰胺MBHA树脂，通过使用标准的SPPS方案制备出这些化合物。
SASRIN树脂(100-200目)(1G)(取代0.6-1.1mmol/g)
RINK酰胺MBHA树脂(1G)(取代0.66mmol/g)Fmoc-HN-树脂
合成的化合物的实例包括下列各项生物电子等排体序列L-氨基酸序列D-氨基酸序列 通用分析方法全部试剂属于商业品质。溶剂是通过标准方法干燥和纯化的。氨基酸衍生物是从商业来源获得的。分析的TLC在涂覆有0.2mm的硅胶60F254层，Merck的铝板上进行，以及制备的TLC在涂覆有2mm的硅胶PF254层，Merck的20cm×20cm玻璃板上进行。硅胶60(230-400目)，Merck用于快速色谱法。在micro-hot-stage设备上获得熔点并且是未修正的。用Brucker400分光计记录1H NMR光谱，在400MHz操作，利用TMS或溶剂作为参比。在NuMega Resonance Laboratories，San Diego上进行元素分析。终产物的制备反相HPLC(Glison)在Phenomenex Luna 5μC18(2)(60mm×21.2mm)柱上进行，流速为15mL/分钟，利用可调的设定在254nm的UV检测器。CH3CN和H2O的混合物用作梯度方式中的流动相(CH3CN＝5％-95％)。LC/UV/ELSD/MS的分析利用获自PE Sciex的API 150 EX仪器进行。在正模式中进行ESI-MS实验。
通用程序A(酰胺偶联)向酸(1.05当量)、胺(1.00当量)和HOBt(1.05当量)在无水CH2Cl2(20mL)中的混合物中，加入Et3N(1.5当量)。加入EDCI(1.05当量)，并且在氮气下于室温搅拌过夜(16小时)。然后，加入水(15mL)，并且于室温搅拌5分钟。进行层分离，并且将水层用CH2Cl2(2×15mL)萃取。将合并的有机层相继用水(15mL)、盐水(15mL)洗涤，并且干燥(Na2SO4)。过滤后，在旋转蒸发器中除去溶剂，并且真空干燥，得到期望的产物。
在少数情况下，在反应完成后在旋转蒸发器中除去挥发物，并且将残余物用水(25mL)于室温搅拌15分钟。过滤非均相混合物，用水(3×25mL)洗涤，并且干燥，得到所希望的酰胺。
通用程序B(Fmoc脱保护)向在CH2Cl2(20mL)中的N-Fmoc衍生物(1.0mmol)，加入4-氨基甲基哌啶(4-AMP)(5mL)，并且于室温搅拌16h小时。在旋转蒸发器中除去挥发物。将粗产物重新放入CH2Cl2(50mL)中，并且相继用磷酸盐缓冲液pH5.5(4×25mL)、水(25mL)、盐水(25mL)洗涤，并且干燥(Na2SO4)。过滤后，在旋转蒸发器中除去溶剂，并且真空干燥，得到期望的胺产物。
通用程序C(胺与酸酐的反应)向在THF(25mL)中的胺(1.0mmol)，加入酸酐(1.5至2.0mmol)，并且在氮气下于室温搅拌24小时。在旋转蒸发器中除去挥发物。将粗产物用于随后的反应，或由反相HPLC柱纯化。
通用程序D(N-Boc基团的脱保护)将N-Boc衍生物(1.0mmol)在1∶1三氟乙酸(TFA)/CH2Cl2(10mL)中、在氮气下于室温搅拌4小时。在旋转蒸发器中除去挥发物。将粗产物用NaHCO3水溶液(15mL)搅拌1小时(小心！CO2气体逸出)。在少数情况下，为了得到细小的固体，可能需要更长的搅拌时间。将固体滤出，用水(3×25mL)洗涤，并且干燥，提供游离胺。
当未形成固体或材料通过用NaHCO3搅拌形成胶状时，用CH2Cl2(2×25mL)萃取产物，并且将合并的有机物相继用水(25mL)、盐水(25mL)洗涤，并且干燥(Na2SO4)。过滤后，在旋转蒸发器中除去溶剂，并且真空干燥，得到期望的胺产物。
通用程序E(酯水解)向酯(1.0mmol)在MeOH-THF(3∶2，15mL)中的搅拌溶液中，加入1NNaOH水溶液(4.0mL，4.0mmol)，并且于室温在氮气下搅拌过夜(16小时)。然后在旋转蒸发器中除去挥发物，并且加入2M NaHSO4(2mL)，以中和碱。用EtOAc(3×15mL)萃取酸。将合并的有机萃取物相继用水(20mL)，盐水(20mL)洗涤，并且干燥(Na2SO4)。过滤后，在旋转蒸发器中除去溶剂，并且真空干燥，得到期望的酸产物。
通用程序F(胺的胍基化)向胺(1.0mmol)在CHCl3(15mL)中的溶液中，加入Et3N(1.5mmol)，接着加入1，3-二-Boc-2-(三氟甲磺酰基)胍(Goodman′s试剂)(1.5mmol)。将该均相反应在氮气下于室温搅拌3天，然后加入另外量的Et3N(1.5mmol)和1，3-二-Boc-2-(三氟甲磺酰基)胍(1.5mmol)，并且再搅拌3天。将反应内容物相继用2M NaHSO4(10mL)、NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤。将溶剂蒸发至干燥，得到双-Boc-胍衍生物。
通用程序G(硝基的还原)向硝基化合物(1.0mmol)在MeOH(25mL)或MeOH-THF(2∶1，25mL)中的溶液中，在氩气下加入10％Pd/C(0.075g)。在氢气鼓泡下，将反应搅拌过夜(16小时)。然后，将反应脱气，用氩气吹扫，并且通过Celite545过滤。将反应烧瓶用MeOH漂洗，并且通过滤饼。将合并的洗涤物浓缩，以制备胺产物。
方案-5 4-(1-(4-胍基丁基氨基甲酰基)-2-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)乙基氨基甲酰基)丁酸向外消旋的2-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-丙酸(2.10g，9.62mmol)和NaHCO3在175mL H2O-二噁烷(1∶2)中的搅拌悬浮液中，加入Fmoc-OSu，并且于室温搅拌(方案5)。在旋转蒸发器中除去挥发物，并且将残余物放入100mL冰-水中，并且用5N HCl(水溶液)酸化至pH～3.0。过滤沉淀物，用水(3×50mL)洗涤，干燥，并且用乙醚(30mL)研制，得到2-(Fmoc-氨基)-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-丙酸，为灰白色松软固体(3.40g，80％)。
根据通用程序A，将2-(Fmoc-氨基)-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-丙酸(0.463g，1.05mmol)与(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍丁胺(0.331g，1.00mmol)、EDCI(0.23g，1.20mmol)、HOBt(0.142g，1.05mmol)和Et3N(0.152g，1.50mmol)反应。分离出N-Fomc-(1-(4-(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍基丁基氨基甲酰基)-2-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)乙基胺)，产率为81％(0.64g)。
根据通用程序B，将上述N-Fmoc衍生物(1.10g，1.46mmol)通过用哌啶(5mL)处理，得到1.28g的粗产物。它被Fmoc-衍生的副产物污染，并且在没有进一步纯化的情况下用于下面的步骤。
根据通用程序C，将上述在THF(10mL)中的粗胺[1-(4-(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍基丁基氨基甲酰基)-2-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)乙基胺]](0.36g，0.68mmol)与戊二酸酐(0.116g，1.02mmol)反应。根据通用程序D，将粗(双-Boc衍生物)用TFA处理。在旋转蒸发器中除去挥发物。将粗产物放入DMSO中，并且用NaHCO3(0.15g)处理1小时。然后，加入极少量的水(0.7mL)，并且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。将含有纯物质的级分合并，并且冻干，得到0.03g的4-(1-(4-胍基丁基氨基甲酰基)-2-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)乙基氨基甲酰基)丁酸，为白色固体。Mp291℃。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝7.53分钟(CH3CN-H2O＝45∶55)。1HNMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)9.97(s，1H)，8.12(d，J＝4.0Hz，1H)，8.02(d，J＝8.8Hz，1H)，7.58(d，J＝8.4Hz，1H)，7.35(d，J＝7.2Hz，1H)，7.04(t，J＝7.4Hz，1H)，7.00(s，1H)，6.92(d，J＝7.4Hz，2H)，4.37(dt，J＝8.8，4.0Hz，1H)，3.63(s，3H)，3.30-3.00(m，3H)，2.95-2.85(m，3H)，2.15-2.08(m，1H)，1.94-1.85(m，2H)，1.81-1.74(m，1H)，1.68-1.52(m，3H)，1.42-1.34(m，3H)。MS[EI]m/e 445.5[M+H]+。分析(C22H32N6O4+1.89 H2O+0.18CF3CO2H)C，H，N。
方案-6
方案-7 (R)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}根据通用程序A(方案6)，允许Fmoc-D-Phe-OH(3.50g，9.0mmol)与N-Boc-对苯二胺(1.79g，8.6mmol)、HOBt(1.22g，9.0mmol)、Et3N(1.04g，10.3mmol)和EDCI(1.73g，9.0mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中反应。在旋转蒸发器中除去挥发性物质，并且将残余物用水(25mL)于室温搅拌15分钟。过滤出灰白色固体，用水(3×25mL)洗涤，并且干燥，提供(R)-{2-苄基-N-(4-叔丁氧羰基氨基-苯基)-丙酰胺酸9H-芴-9-基甲酯}，产率为85.6％(4.47g)。
根据通用程序B，将上述Fmoc-衍生物(2.1g，3.63mmol)用4-AMP(2.07g，18.2mmol)处理60小时。通过萃取工序和蒸发，得到(R)-{[4-(2-氨基-3-苯基-丙酰氨基)-苯基]-氨基甲酸叔丁酯}，为淡黄色固体(1.1g，85％)。
然后根据通用程序A，允许对苯二甲酸一甲酯(0.51g，2.8mmol)与(R)-{[4-(2-氨基-3-苯基-丙酰氨基)-苯基]-氨基甲酸叔丁酯}(1.00g，2.8mmol)、HOBt(0.38g，2.8mmol)、Et3N(0.34g，3.4mmol)和EDCI(0.54g，2.8mmol)在无水CH2Cl2(20mL)中反应。在旋转蒸发器中除去挥发性物质，并且将残余物用水(15mL)于室温搅拌15分钟。过滤非均相混合物，用水(3×25mL)洗涤，并且干燥，提供所希望的酰胺(R)-{N-[1-(4-叔丁氧羰基氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(1.38g，94.8％)，为淡黄色固体。
根据通用程序D，将在(R)-{N-[1-(4-叔丁氧羰基氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(1.0g，1.93mmol)中的N-Boc基团进行3小时脱保护。过滤出固体，用水(3×25mL)洗涤，并且干燥，提供游离苯胺(0,76g，94％)。如在方案7中所示，还通过还原硝基化合物制备该胺。将0.075g的粗产物溶解于极少体积的DMSO(1.2mL)中，并且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝9.10分钟(CH3CN-H2O＝55∶45)。将含有纯物质的级分合并并且冻干，得到0.048g的(R)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}，为淡黄色固体。Mp 240-2℃。1H NMR(CDCl3，δ，按ppm计)8.03(d，J＝8.4Hz，2H)，7.72(d，J＝8.0Hz，2H)，7.28-7.15(m，7H)，6.93(d，J＝8.8Hz，2H)，4.91-4.82(m，1H)，3.88(s，3H)，3.29(dd，J＝14.0，6.4Hz，1H)，3.14(dd，J＝14.0，8.0Hz，1H)。MS[EI]m/e 418.5[M+H]+。分析(C24H23N3O4+0.25 H2O)C，H，N。
(R)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸}采用通用程序E，将在甲基(R)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.25g，0.60mmol)中的酯水解(方案6)。将粗反应混合物溶解于DMSO(1.5mL)中，并且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝3.47分钟(CH3CN-H2O＝25∶75)。将含有纯物质的级分合并并且冻干，得到0.06g标题化合物的Na-盐。Mp 220℃(分解)。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)9.88(s，1H)，8.61(d，J＝8.4Hz，1H)，7.85(d，J＝9.2Hz，2H)，7.73(d，J＝8.8Hz，2H)，7.44(d，J＝7.6Hz，2H)，7.26-7.18(m，4H)，7.11(d，J＝7.4Hz，2H)，6.54(d，J＝7.6Hz，2H)，4.82(br.s，IH)，4.73-4.68(m，1H)，3.07-3.01(m，2H).MS[EI]m/e 404.5[M(相应酸)+H]+。分析(C23H20N3NaO4+2.4 H2O+0.06CF3CO2Na)C，H，N。
(R)-(N-[1-(4-胍基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸)根据通用程序F，允许在(R)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.30g，0.72mmol)中的胺与1，3-二-Boc-2-(三氟甲磺酰基)胍和Et3N反应，得到(R)-{N-[1-(4-(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}，产率为90％(0.427g)。将其用于随后的反应(方案6)。
采用通用程序E，将(R)-{N-[1-(4-(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.40g，0.61mmol)中的酯基水解。将含有N2，3-二-叔丁氧羰基的粗反应混合物(0.45g)在通用程序D下进行5小时。将浓缩的粗物质溶解于DMSO(1.5mL)中，并且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。将含有纯物质的级分合并并且冻干，0.095g的(R)-{N-[1-(4-胍基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸}，为白色固体。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝6.20分钟(CH3CN-H2O＝25∶75)。Mp 242℃(分解)。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)10.92(br.s，1H)，10.39(s，1H)，8.55(d，J＝7.6Hz，1H)，7.91(d，J＝8.4Hz，2H)，7.79(d，J＝8.4Hz，2H)，7.77(br.s，3H)，7.67(d，J＝8.8Hz，2H)，7.39(d，J＝7.2Hz，2H)，7.27(t，J＝7.6Hz，2H)，7.18(d，J＝8.8Hz，2H)，7.17(t，J＝7.2Hz，1H)，4.82(表观q，J＝6.0Hz，1H)，3.15-3.04(m，2H)。MS[EI]m/e 446.4[M+H]+。分析(C24.6H27.6F0.9N5Na0.3O6.9)C，H，N。
方案-8 (S)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸}根据通用程序A(方案8)，允许Boc-L-Bip-OH(3.00g，8.8mmol)与对硝基苯胺(1.34g，9.7mmol)、HOBt(1.19g，8.8mmol)、Et3N(1.07g，10.5mmol)和EDCI(1.68g，8.8mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中反应。在旋转蒸发器中除去挥发性物质，并且将残余物用水(50mL)于室温搅拌15分钟。过滤出固体，用水(2×25mL)洗涤，并且干燥，提供(S)-{[1-(4-硝基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-氨基甲酸叔丁酯}，产率为84％(4.4g)。
根据通用程序D，将上述Boc-衍生物(2.1g，3.63mmol)用TFA处理。通过过滤、水洗涤和干燥，得到(S)-{2-氨基-3-联苯基-4-基-N-(4-硝基-苯基)-丙酰胺)，为淡黄色固体(1.75g，97％)。
然后根据通用程序A，允许对苯二甲酸一甲酯(0.90g，5.02mmol)与上述胺(1.65g，4.56mmol)、HOBt(0.68g，5.02mmol)，Et3N(0.55g，5.48mmol)和EDCI(0.96g，5.02mmol)在无水CH2Cl2(20mL)中反应。在旋转蒸发器中除去挥发性物质，并且将残余物用水(15mL)于室温搅拌15分钟。过滤非均相混合物，用水(3×25mL)洗涤，并且干燥，提供(S)-{N-[1-(4-硝基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(2.23g，93％)，为淡黄色固体。
按照通用程序G，将上述硝基化合物(0.90g，1.72mmol)在MeOH-THF(2∶1，25mL)中还原，提供(S)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.81g，95％)。
采用通用程序E，将在(S)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.12g，0.24mmol)中的酯水解。将粗反应混合物溶解于DMSO(1.5mL)中，并且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。将含有纯物质的级分合并并且冻干，得到0.03g标题化合物的Na-盐，为灰白色固体。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝8.92分钟(CH3CN-H2O＝55∶45)。Mp 251℃(分解)。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)9.98(s，1H)，8.97(d，J＝8.0Hz，1H)，8.00(d，J＝8.8Hz，2H)，7.97(d，J＝8.4Hz，2H)，7.61(d，J＝8.8Hz，2H)，7.58(d，J＝7.2Hz，2H)，7.48(d，J＝8.0Hz，2H)，7.40(d，J＝8.2Hz，2H)，7.32(t，J＝7.6Hz，1H)，7.30(d，J＝7.0Hz，2H)，6.68(d，J＝8.4Hz，2H)，4.89-4.83(m，1H)，3.16-3.06(m，2H)。MS[EI]m/e 480.4[M(相应酸)+H]+。分析(C29H27.2N3NaO5.6)C，H，N。
(S)-{N-[2-联苯基-4-基-1-(4-胍基-苯氨羰基)-乙基]-对氨甲酰苯甲酸}根据通用程序F，允许(S)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.23g，0.466mmol)与1，3-二-Boc-2-(三氟甲磺酰基)胍[2×(0.54g，1.4mmol)]和Et3N[2×(0.14g，1.4mmol)]反应，得到(S)-{N-[1-(4-(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}，产率为87.5％(0.30g)。将其用于下面的反应(方案8)。
采用通用程序E，将在(S)-{N-[1-(4-(N2，3-二-叔丁氧羰基)胍基-苯氨羰基)-2-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯}(0.29g，0.39mmol)中的酯基水解。将含有N-Boc基团的粗反应混合物在通用程序D下进行5小时。将浓缩的粗物质溶解于DMSO(1.5mL)中，并且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。将含有纯物质的级分合并并且冻干，得到0.06g的标题化合物，为白色固体。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝6.92分钟(CH3CN-H2O＝40∶60)。Mp 238-40℃(分解)。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)10.85(br.s，1H)，10.47(s，1H)，9.05(d，J＝6.4Hz，1H)，8.02(d，J＝7.2Hz，2H)，7.94(d，J＝7.6Hz，2H)，7.79(s，3H)，7.78(d，J＝7.2Hz，2H)，7.70(t，J＝8.4Hz，4H)，7.58(d，J＝7.2Hz，2H)，7.50(t，J＝7.2Hz，2H)，7.39(t，J＝8.0Hz，1H)，7.27(d，J＝7.6Hz，2H)，4.96(q，J＝6.8Hz，1H)，3.24(d，J＝5.6Hz，2H)。MS[EI]m/e 522.8[M+H]+。分析(C30H35.2N5O8.1)C，H，N。
方案-9 3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸根据通用程序A，允许Boc-D-Phe-OH(2.00g，7.54mmol)与N，N-二甲基-对苯二胺(0.98g，7.18mmol)、HOBt(1.02g，7.54mmol)、Et3N(1.09g，10.77mmol)和EDCI(1.44g，7.54mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中反应，提供叔丁基(R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酸叔丁酯(2.85g，98.6％)，为灰色固体(方案9)。
根据通用程序D，将上述Boc-衍生物(1.85g，4.82mmol)用TFA处理。通过过滤、水洗和干燥，得到(R)-2-氨基-N-(4-(二甲基氨基)苯基)-3-苯基丙酰胺，为灰色固体(1.29g，94％)。
根据通用程序C，将上述在THF(5mL)中的胺(0.12g，0.42mmol)与琥珀酸酐(0.051g，0.51mmol)反应。将粗产物放入DMSO(1.5mL)中，并且过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。将含有纯物质的级分合并并且冻干，得到0.105g的3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸，为淡灰色固体。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝8.32分钟(CH3CN-H2O＝45∶55)。Mp 197-8℃。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)12.21(br.s，1H)，9.86(s，1H)，8.42-8.25(m，1H)，7.50-7.25(m，9H)，6.89(br.s，1H)，4.69-4.61(m，1H)，3.16-3.04(m，2H)，2.95(s，6H)，2.45-2.33(m，4H)。MS[EI]m/e 384.4[M+H]+。分析(C21H25.5N3O4.25)C，H，N。
4-((R)-1-(4-二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g(0.42mmol)的(R)-2-氨基-N-(4-(二甲基氨基)苯基)-3-苯基丙酰胺和戊二酸酐(0.058g，0.51mmol)，得到0.089g的4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸，为淡灰色固体(方案9)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝8.81分钟(CH3CN-H2O＝48∶52)。Mp 205-7℃。1HNMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)12.21(br.s，1H)，9.86(s，1H)，8.42-8.25(m，1H)，7.50-7.25(m，9H)，6.84(br.t，J＝8.2Hz，1H)，4.69-4.61(m，1H)，3.16-2.95(m，2H)，2.93(s，6H)，2.15(t，J＝6.6Hz，4H)，1.68(t，J＝6.6Hz，2H)。MS[EI]m/e 398.5[M+H]+。分析(C22H27.5N3O4.25)C，H，N。
4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-2-氨基-N-(4-(二甲基氨基)苯基)-3-苯基丙酰胺和3，3-(二甲基)戊二酸酐(0.072g，0.51mmol)，得到0.10g所期望的酸，为淡灰色固体(方案9)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝9.60分钟(CH3CN-H2O＝55∶45)。Mp 85-6℃。1NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)12.21(br.s，1H)，9.86(s，1H)，8.42-8.25(m，1H)，7.50-7.25(m，9H)，6.84(br.t，J＝8.2Hz，1H)，4.69-4.61(m，1H)，3.16-2.95(m，2H)，2.93(s，6H)，2.26-2.14(m，4H)，0.92(s，6H)。MS[EI]m/e 426.5[M+H]+。分析(C24.2H32.3N3.1O4.5)C，H，N。
4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(四亚甲基)丁酸的合成其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-2-氨基-N-(4-(二甲基氨基)苯基)-3-苯基丙酰胺和3，3-(四亚甲基)戊二酸酐(0.085g，0.51mmol)，得到0.076g所期望的酸，为淡灰色固体(方案9)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝9.54分钟(CH3CN-H2O＝62∶38)。Mp91-2℃。1NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)12.21(br.s，1H)，9.86(s，1H)，8.42-8.25(m，1H)，7.50-7.25(m，9H)，6.84(br.s，1H)，4.83(表观q，J＝7.4Hz，1H)，3.20-3.02(m，2H)，2.91(s，6H)，2.27(s，2H)，2.23(d，J＝13.2Hz，1H)，2.09(d，J＝13.2Hz，1H)，1.55-1.30(m，8H)。MS[EI]m/e452.4[M+H]+。分析(C26H33.5N3O4.25)C，H，N。
4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(亚戊基)丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-2-氨基-N-(4-(二甲基氨基)苯基)-3-苯基丙酰胺和3，3-(亚戊基)戊二酸酐(0.092g，0.51mmol)，得到0.119g所期望的酸，为淡灰色固体(方案9)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝11.02分钟(CH3CN-H2O＝66∶34)。Mp110-1℃。1HNMR(CDCl3+DMSO-d6，δ，按ppm计)12.21(br.s，1H)，9.86(s，1H)，8.42-8.25(m，1H)，7.50-7.25(m，9H)，6.84(br.s，1H)，4.83(表观q，J＝7.4Hz，1H)，3.20-3.02(m，2H)，2.83(s，6H)，2.27(s，2H)，2.32-2.11(m，4H)，1.32(br.s，6H)，1.21(br.s，2H)，1.11(br.s，2H)。MS[EI]m/e 466.6[M+H]+。分析(C27.12H35.4F0.18N3Na0.06O4.32)C，H，N。
方案-10 3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸根据通用程序A，允许Boc-D-Phe-OH(2.00g，7.54mmol)与4-N，N-二甲基氨基苄基胺二盐酸盐(1.60g，7.18mmol)、HOBt(1.02g，7.54mmol)、Et3N(2.54g，25.1mmol)和EDCI(1.44g，7.54mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中反应，提供(R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酸叔丁酯(2.79g，95.5％)，为灰白色固体(方案10)。
根据通用程序D，将上述(R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酸叔丁酯(1.80g，4.53mmol)用TFA处理。通过过滤、水洗和干燥，得到游离胺[(R)-N-(4-(二甲基氨基)苄基)-2-氨基-3-苯基丙酰胺]，为淡黄色固体(1.30g，96.5％)。
根据通用程序C，将在THF(5mL)中的(R)-N-(4-(二甲基氨基)苄基)-2-氨基-3-苯基丙酰胺(0.12g，0.40mmol)与琥珀酸酐(0.048g，0.48mmol)反应。将粗产物放入DMSO(1.5mL)中，且通过注射过滤器-盘(Whatman，PTFE，0.45μm，13mm)，然后由反相HPLC柱纯化。将含有纯物质的级分合并并且冻干，得到0.10的3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸，为白色固体。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝8.03分钟(CH3CN-H2O＝45∶55)。Mp 194-6℃。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)12.18(br.s，1H)，8.36(br.s，1H)，8.10(d，J＝8.0Hz，1H)，7.25-7.15(m，5H)，6.95(d，J＝7.2Hz，2H)，6.67(br.s，1H)，4.44-4.28(m，1H)，4.08(s，2H)，3.00(d，J＝1 2.4Hz，1H)，2.69(dd，J＝12.4，7.8Hz，1H)，2.91(s，6H)，2.45-2.22(m，4H)。MS[EI]m/e 398.5[M+H]+。分析(C22H28.56N3O4.78)C，H，N。
4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-N-(4-(二甲基氨基)苄基)-2-氨基-3-苯基丙酰胺和戊二酸酐(0.055g，0.48mmol)，得到0.086g所期望的酸，为白色固体(方案10)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15 mL/分钟]tR＝7.97分钟(CH3CN-H2O＝47∶53)。Mp208-9℃。1H NMR(DMSO-d6，δ，按ppm计)12.18(br.s，1H)，8.42(br.s，1H)，8.04(d，J＝8.4Hz，1H)，7.25-7.15(m，5H)，6.95(d，J＝7.6Hz，2H)，6.65(br.s，1H)，4.44(表观q，J＝8.4Hz，1H)，4.19(d，J＝4.4Hz，2H)，2.90(dd，J＝13.6，4.4Hz，1H)，2.91(s，6H)，2.65(dd，J＝12.6，10.8Hz，1H)，2.16(表观t，J＝7.0，4H)，1.54(表观t，J＝7.0，2H)。MS[EI]m/e 412.5[M+H]+。分析(C23H29.66N3O4.33)C，H，N。
4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-N-(4-(二甲基氨基)苄基)-2-氨基-3-苯基丙酰胺和3，3-(二甲基)戊二酸酐(0.069g，0.48mmol)，得到0.097g所期望的酸，为白色固体(方案10)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝9.55分钟(CH3CN-H2O＝55∶45)。Mp 76-7℃。1H NMR(CDCl3，δ，按ppm计)7.48(d，J＝7.6Hz，1H)，7.18-7.11(m，6 H)，6.92(d，J＝8.4Hz，2H)，6.67(br.s，2H)，6.43(br.s，1H)，4.44(表观q，J＝7.6Hz，1H)，4.16(d，J＝4.8Hz，2H)，3.05-2.95(m，2H)；2.85(s，6H)，2.18(d，J＝2.4Hz，2H)，2.16(d，J＝13.0，1H)，2.04(d，J＝13.0，1H)，0.92(s，3H)，0.87(s，3H)。MS[EI]m/e 440.6[M+H]+。分析(C25H33N3O4)C，H，N。
4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(四亚甲基)丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-N-(4-(二甲基氨基)苄基)-2-氨基-3-苯基丙酰胺和3，3-(四亚甲基)戊二酸酐(0.081g，0.48mmol)，得到0.105g所期望的酸，为白色固体(方案10)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝9.56分钟(CH3CN-H2O＝62∶38)。Mp 88-90℃。1H NMR(CDCl3，δ，按ppm计)7.60(d，J＝8.0Hz，1H)，7.18-7.13(m，6H)，6.91(d，J＝8.4Hz，2H)，6.62(d，J＝8.0Hz，2H)，4.66(表观q，J＝7.8Hz，1H)，4.15(两套dd，J＝14.4，5.6Hz，2H)，3.05-2.94(m，2H)，2.84(s，6H)，2.29(d，J＝13.6Hz，1H)，2.18(表观t，J＝12.2，2H)，2.04(d，J＝13.6，1H)，1.53(br.s，4H)，1.40(br.s，2H)，1.31(br.s，2H)。MS[EI]m/e466.6[M+H]+。分析(C27H35.5N3O4.25)C，H，N。
4-(R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(亚戊基)丁酸其根据通用程序C制备。由0.12g的(R)-N-(4-(二甲基氨基)苄基)-2-氨基-3-苯基丙酰和3，3-(亚戊基)戊二酸酐(0.088g，0.48mmol)，得到0.12g所期望的酸，为白色固体(方案10)。HPLC[Phenomenex Luna 5μC18(2)(梯度，CH3CN/H2O)，φ＝15mL/分钟]tR＝9.57分钟(CH3CN-H2O＝66∶34)。Mp 100-2℃。1H NMR(CDCl3，δ，按ppm计)7.37(br.，1H)，7.18-7.11(m，6H)，6.95(br.t，J＝6.8Hz，2H)，6.68(br.s，2H)，6.43(br.s，1H)，4.66(表观t，J＝7.2Hz，1)，4.17(br.s，2H)，3.05-2.95(m，2H)，2.86(s，6H)，2.25-2.12(m，4H)，1.32(br.s，6H)，1.21(br.s，2H)，1.11(br.s，2H)。MS[EI]m/e480.5[M+H]+。分析(C28H37.5N3O4.25)C，H，N。
方案-11
(S)-{4-[2-(9H-芴-9-基氧基羰基氨基)-2-苯基-乙酰氨基]-苯基}-氨基甲酸叔丁酯(7B)向Fmoc-L-Phe-OH(7A，2g，5mmol)在DMF(20mL)中的溶液中，加入HOBt(800mg，5mmol)、EDCI(1.1g，5.7mmol)，并且将混合物于室温搅拌20分钟。加入N-Boc-1，4-苯二胺(1.1g，5mmol)，接着加入TEA(525mg，724μL)，将混合物于室温搅拌5小时。将溶液在减压下浓缩，并且加入水，将混合物超声处理，以沉淀产物，将其通过过滤收集，得到灰白色固体(2.9g，5mmol)。
(S)-(4-(2-氨基-2-苯基-乙酰基氨基)-苯基]-氨基甲酸叔丁酯(7C)向{4-[2-(9H-芴-9-基氧基羰基氨基)-2-苯基-乙酰氨基]-苯基}-氨基甲酸叔丁酯(7B)(2.8g，5mmol)在DMF(50mL)中的溶液中，加入4-氨基甲基哌啶(10x，5.7g，50mmol)，并且将溶液于室温搅拌18小时。将混合物过滤以除去固体，并且将滤液在减压下浓缩。将残余物放入DCM中，并且用饱和NaCl、5.5磷酸盐缓冲液(3×25mL)、饱和NaCl洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤和浓缩，得到固体产物(3.48mmol，1.24g)，将其原样使用。
(S)-{N-[(4-氨基-苯氨羰基-苯基-甲基)-对氨甲酰苯甲酸](7D)向对苯二甲酸一甲酯(133mg，0.74mmol)在无水DCM(50mL)中的溶液中，加入EDCI(142mg，0.74mmol)和HOBt(114mg，0.74mmol)，并且将反应混合物于室温搅拌3小时。加入[4-(2-氨基-2-苯基-乙酰氨基)-苯基]-氨基甲酸叔丁酯(7C)(288mg，0.67mmol)，接着加入TEA(75mg，103μL)，并且将混合物于室温搅拌15小时。用水和饱和NaCl溶液萃取DCM，并且干燥，得到残余物。将残余物溶解于DCM(3mL)中，并且加入TFA(2mL)，将混合物于室温搅拌3小时。将溶液浓缩，得到褐色油状残余物。将该油溶解于MeOH(5mL)中，加入10％KOH(3mL)，并且将混合物于室温搅拌3小时。将溶液调节至pH～5，浓缩甲醇，并且收集得到的固体并且干燥，得到150mg的固体。将此粗产物由反相HPLC使用ACN/H2O(5-95％ACN)纯化，并且冻干，得到产物，为白色固体(42mg)。MP151℃。1H NMR(400MHz)δ9.83(s，1H)，8.87(d，J＝8.4Hz，1H)，7.98(d，J＝8.4Hz，2H)，7.90(d，J＝8.8Hz，2H)，7.39(d，J＝7.2Hz，2H)，7.22(m，5H)，6.5(m，2H)，4.80(m，1H)，3.10(m，4H)。M+1404.5。分析C23H21N3O4+1H2O(S)-{4-[2-(4-氰基-苯甲酰氨基)-3-苯基-丙酰氨基]-氨基甲酸叔丁酯(7E)向4-氰基苯甲酸(1.54mmol，227mg)在DMF(15mL)中的溶液中，加入EDCI(296mg，1.54mmol)和HOBt(236mg，1.54mmol)，并且将溶液于室温搅拌30分钟。加入[4-(2-氨基-2-苯基-乙酰氨基)-苯基]-氨基甲酸叔丁酯(7C)(500mg，1.4mmol)，接着加入TEA(214μL)，并且将混合物于室温搅拌4小时。将溶液倾倒入水(250mL)中，通过过滤收集固体，并且在减压下干燥，得到产物，为白色固体(638mg，1.32mmol)，将其原样使用。
(S)-(4-{3-苯基-2-[4-(1H-四唑-5-基)-苯甲酰氨基]-丙酰氨基}-苯基)-氨基甲酸叔丁酯(7F)向{4-[2-(4-氰基-苯甲酰氨基)-3-苯基-丙酰氨基]-氨基甲酸叔丁酯(7E)(100mg，0.21mmol)在DMF(2mL)中的溶液中，加入NaN3(3x，40mg，0.62mmol)和NH4Cl(0.68mmol，38mg)，并且将混合物于90℃加热18小时。减压下除去DMF，并且通过反相HPLC在C18上使用ACN/H2O(20％-95％ACN)纯化残余物，得到产物，在冻干后为白色粉末固体(31mg)。
(S)-{N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-苯基-乙基]-4-(1H-四唑-5-基)苯甲酰胺}(7G)向(4-{3-苯基-2-[4-(1H-四唑-5-基)-苯甲酰氨基]-丙酰氨基}-苯基)-氨基甲酸叔丁酯(7F)(31mg，0.06mmol)在DCM(4mL)中的悬浮液中，加入TFA(1mL)，并且将混合物于室温搅拌1.5小时。浓缩溶液，并且通过反相HPLC在C18上使用ACN/H2O(20％-95％ACN)纯化，得到产物，在冻干后为白色粉末(4.5mg)。MP137℃。1H NMR(400MHz)δ9.88(s，1H)，8.86(d，J＝8.0Hz，1H)，8.06(d，J＝8.0Hz，2H)，7.97(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝7.6Hz，2H)，7.24(m，4H)，7.14(m，1H)，6.56(d，J＝8.4Hz，2H)，5.70 s，1H)4.78(m，1H)，3.07(m，6H).M+1428.5。分析C23H21N7O2+2H2O0.4TFA
方案-12 (N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-D-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯(8E)该化合物以类似于N-[(4-氨基-苯氨羰基)-苯基-甲基]-对氨甲酰苯甲酸(7D)的方式，通过取代D-联苯基丙氨酸(8A)，并且进行如方案8中所示的皂化步骤来制备。(32mg)Mp289℃。1H NMR(400MHz)δ9.88(s，1H)，8.86(d，J＝8.0Hz，1H)，8.02(m，2H)，7.95(m，2H)，7.62(m，4H)，7.49(d，J＝8.0Hz，2H)，7.43(m，2H)，7.32(m，1H)，7.24(m，2H)6.51(m，2H)，4.85(m，3H)，3.86(s，3H)，3.14(m，2H)。M+1494.6。分析C30H27N3O4。
N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-D-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸(8F)向N-[1-(4-氨基-苯氨羰基)-2-D-联苯基-4-基-乙基]-对氨甲酰苯甲酸甲酯(8E)在MeOH中的溶液中，加入10％KOH，并且将溶液于室温搅拌7天。减压下除去MeOH，并且用20％HCl将水性混合物调节至pH5-7。收集得到的固体，通过反相HPLC使用C18，用ACN/H2O(5％-95％ACN)洗脱而纯化，将适当的级分冻干，得到产物，为白色固体(13mg)。Mp282℃。1H NMR(400MHz)δ9.87(s，1H)，9.92(d，J＝8.0Hz，1H)，7.99(d，J＝8.4Hz，2H)，7.92(d，J＝8.4Hz，2H)，7.61(m，2H)，7.48(m，1H)，7.43(m，1H)，7.32(m，1H)，7.24(d，J＝8.8Hz，1H)6.51(d，J＝8.4Hz，1H)，4.84(m，1H)，3.15(m，3H)。M+1480.3。分析C29H25N3O2在不背离所述范围的情况下，可以对这里描述的实施方案进行许多修改和变更，这对于本领域技术人员是明显的。这里描述的特定实施方案仅是通过实例的方式提供。
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1.一种反向胆固醇转运的介质，其包含下面的结构 其中A、B和C可以处于任何顺序，并且其中A包含酸性氨基酸或其分子生物电子等排体；B包含芳族或亲脂性氨基酸或其类似物；并且C包含碱性氨基酸或其分子生物电子等排体，其中A或C中的至少一个包含其分子生物电子等排体。
2.权利要求1的介质，其中A或C中只有一个包含生物电子等排体，并且从不包含生物电子等排体的A或C氨基酸上去除了α氨基或α羧基。
3.权利要求1的介质，其中如果存在，来自所述氨基末端的α氨基用保护基加帽，所述的保护基选自由以下组成的组甲酰基、乙酰基、苯乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基(pivolyl)、9-芴基甲氧基羰基、2-萘酸、烟酸、其中n范围为1至20的CH3-(CH2)n-CO-、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、和取代的饱和的杂芳基。
4.权利要求1的介质，其中如果存在，来自所述羧基末端的α羧基用保护基加帽，所述的保护基选自由以下组成的组胺如其中R＝H的RNH2、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、联苯基、取代的苯基、取代的杂环、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、和取代的饱和的杂芳基。
5.权利要求1的介质，其中A的酸性基团包含选自由以下组成的组的生物电子等排体
6.权利要求1的介质，其中C的碱性基团包含选自由以下组成的组的生物电子等排体
7.权利要求1的介质，其中A的生物电子等排体选自由以下组成的组
8.权利要求1的介质，其中C的生物电子等排体选自由以下组成的组
9.权利要求1的介质，其中所述的介质选自由以下组成的组 其中R为H、甲基、环烷基(C3-C7)，并且n＝1-10 其中R为H、甲基、环烷基(C3-C7)，并且n＝1-10
10.化合物BenOMe-bip-苯胺。
11.化合物4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸。
12.化合物4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸。
13.化合物4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苯氨羰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-(亚戊基)丁酸。
14.化合物4-((S)-1-(4-胍基苯氨羰基)-2-(联苯基)乙基氨基甲酰基)苯甲酸。
15.化合物3-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丙酸。
16.化合物4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)丁酸。
17.化合物4-((R)-1-(4-(二甲基氨基)苄基氨基甲酰基)-2-苯乙基氨基甲酰基)-3，3-二甲基丁酸。
全文摘要
本发明提供适合于增加哺乳动物中反向胆固醇转运的组合物。所述组合物适合于口服递送，并且在治疗和/或预防高胆固醇血症，动脉粥样硬化和相关心血管疾病中是有用的。
文档编号A61K31/198GK1964955SQ200580018581
公开日2007年5月16日 申请日期2005年6月9日 优先权日2004年6月9日
发明者J·C·索卡, V·C·瓦萨, I·尼库林, K·阿利萨拉 申请人:阿文尼尔药品公司
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