应用腺病毒载体诱导免疫应答的方法

专利名称：应用腺病毒载体诱导免疫应答的方法
相关申请的交叉参考本专利申请要求2004年4月12日提交的美国临时专利申请号60/561,341的利益。
关于联邦政府资助的研究和研发的陈述在由GenVec，Inc.和代表敏感和传染病国家机构(National Institute ofAllergy and Infectious Diseases)的美国公共卫生局之间签署的合作研究和研发协议(Coorperative Reasearch and Development Agreement，CRADA)号AI-1034及其修改下，本发明部分由政府支持完成。在本发明中政府可以拥有某些权利。
背景技术：
疾病控制和预防中心(CDC)估计，在美国，850,000-950,000人正承受着HIV感染，并且大约25％的人没有觉察到他们的感染(CDC，Morb.Mortal.Wkly.Rep.，52(47)，1145-8(2003))。在全世界，HIV新感染率以难以接受的高水平持续增长。尽管由于高度活性的抗反转录病毒治疗(HAART)的出现，在发达国家，新的AIDS诊断和死亡已经显著下降，但是在发展中国家，HIV/AIDS流行性继续加剧。所述流行病的全球性影响是相当大的。按照关于HIV/AIDS的联合国计划(Joint United NationsProgramme on HIV/AIDS)和世界卫生组织，到2002年底时，估计有4000-4200万人正承受HIV/AIDS，其中全世界总人数的95％居住在发展中国家(WHO，Treating 3 Million by 2005The WHO Strategy，Geneva，Switzerland.第1-53页(2003)，和UNAIDS，AIDS Epidemic UpdateDecember 2003)。2003年，全世界估计有250-350万例由HIV/AIDS导致的死亡(UNAIDS，AIDS Epidemic Update December 2003)，并且自从这种流行病的开始，已经有多达3000万例由HIV感染导致的死亡(WHO，Treating3 Million by 2005The WHO Strategy，Geneva，Switzerland.第1-53页(2003))。除了HIV/AIDS的人类灾难，所述流行病的代价对许多国家的经济增长和政治稳定造成显著的阻碍。在发展中国家以及在美国人口的部分地区中，抗HIV治疗经常超出财政范围。因此，迫切地需要用于HIV预防的有效的、低成本的工具，诸如疫苗，以使得HIV流行病得到控制。
几十年来，以生物相应量运送蛋白作为疗法或者用于诱导免疫应答已成为药物和疫苗开发的障碍。已经证明为传统抗原运送途径的成功备选的一种解决方案是运送外源核酸序列用于在体内产生抗原分子。理想地，基因转移载体进入广泛种类的细胞类型，具有接纳巨大的核酸序列的能力，是安全的，并且可以以治疗患者需要的量生产。病毒载体具有这些有利特征，并且被用于治疗或预防生物疾病的许多方法中。
除了它们的有利特征，病毒基因转移载体的广泛应用受到一些因素的阻碍。在这方面，某些细胞不易接受通过目前可用的病毒载体运送基因。例如，摄入腺病毒时，淋巴细胞被损害(Silver等.，Virology 165，377-387(1988)；Horvath等.，J.Virology，62(1)，341-345(1988))。
病毒基因转移载体的应用还受到病毒载体免疫原性的阻碍。大多数的美国人口已经暴露于目前处于作为基因转移载体的研发中的许多病毒(例如，腺病毒)的野生形式。因此，许多美国人口已发展了针对某些基于病毒的基因转移载体的现有的免疫性。这样的载体被迅速地从血流中清除，因此降低了所述载体在运送生物相应量的基因产物中的功效。并且，某些病毒载体的免疫原性防止有效的重复给药，其可以有利“增强”针对病原体的免疫系统，并且导致只有少部分剂量的病毒载体将其有效负荷运送到宿主细胞。
另外，设计作为HIV疫苗的病毒载体中的主要挑战是识别和靶向病毒结构，所述病毒结构是多样性的最广泛的可能范围内的保护性体液和细胞免疫应答的关键决定簇。多价疫苗的应用，其包含来自许多流行HIV亚型的免疫原的明确的混合物，可能是获得广泛保护性HIV疫苗的可行途径。
因此，存在对于改进的方法和用于诱导针对HIV的免疫应答的组合物的需要。本发明提供这样的方法和组合物。本发明的这些和其它优点，以及附加的发明特征，将通过本文提供的发明详述而显而易见。
发明简述本发明提供在哺乳动物中诱导针对人类免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答的方法。所述方法包括给所述哺乳动物施用腺病毒载体组合物，其中所述腺病毒载体组合物包括编码两种或多种不同的HIV抗原的一种或多种腺病毒载体，因此在哺乳动物中产生所述HIV抗原，并且诱导针对HIV的免疫应答。
本发明还提供腺病毒载体组合物，其包括(a)包括编码HIV分化体AEnv蛋白的核酸的腺病毒载体，(b)包括编码HIV分化体B Env蛋白的核酸的腺病毒载体，(c)包括编码HIV分化体C Env蛋白的核酸的腺病毒载体，和(d)包括编码融合蛋白的核酸的腺病毒载体，所述融合蛋白包括HIV分化体B Gag蛋白和Pol蛋白。
发明详述本发明提供在哺乳动物中诱导针对人类免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答的方法。所述方法包括给所述哺乳动物施用腺病毒载体组合物，其中所述腺病毒载体组合物包括编码两种或多种不同的HIV抗原的一种或多种腺病毒载体。
本发明还提供腺病毒载体组合物。所述腺病毒载体组合物包括(a)包括编码HIV分化体A Env蛋白的核酸的腺病毒载体，(b)包括编码HIV分化体B Env蛋白的核酸的腺病毒载体，(c)包括编码HIV分化体C Env蛋白的核酸的腺病毒载体，和(d)包括编码融合蛋白的核酸的腺病毒载体，所述融合蛋白包括HIV分化体B Gag蛋白和Pol蛋白。
“抗原”是在哺乳动物中引发免疫应答的分子。“免疫应答”可以承担(entail)，例如，抗体产生和/或免疫效应细胞的激活。在本发明上下文中，HIV抗原可以包括在哺乳动物中激发免疫应答的任何蛋白质HIV分子或者其部分。“HIV分子”是这样一种分子，即，其为人类免疫缺陷病毒的一部分，由人类免疫缺陷病毒的核酸序列编码，或者衍生于或合成地基于任何这样的分子。按照本发明激发免疫应答的HIV抗原的施用优选地导致针对HIV的保护性免疫。在这方面，针对HIV的“免疫应答”是针对任何一种或多种HIV抗原的免疫应答。
适合的HIV抗原的实例包括全部或部分的HIV Gag，Env，Pol，Tat，反转录酶(RT)，Vif，Vpr，Vpu，Vpo，整合酶，或Nef蛋白。优选地，所述两种或多种HIV抗原的每一种包括全部或部分的HIV Gag，Env，和/或Pol蛋白。适合的Env蛋白在本领域内已知，并且包括，例如，gp160，gp120，gp41，gp145和gp140。另外，HIV抗原可以为在体内展现出增强的免疫原性的修饰的Env蛋白。例如，所述抗原可以为在Env蛋白的切割位点、融合肽、或者螺旋间卷曲的卷曲结构域包括突变的Env蛋白(△CFI Env蛋白)(参见，例如，Cao等.，J.Virol.，71，9808-9812(1997)，和Yang等.，J.Virol.，78，4029-4036(2004))。
HIV的任何分化体适用于抗原选择，其包括HIV分化体A，B，C，D，E，MN等。因此，应该理解下述HIV抗原可以用于本发明的方法HIV分化体A gp140，Gag，Env，和/或Pol；HIV分化体B gp140，Gag，Env，和/或Pol蛋白；HIV分化体C gp140，Gag，Env，和/或Pol蛋白；以及HIV分化体MN gp140，Gag，Env，和/或Pol蛋白。尽管优选地所述抗原为Gag，Env，和/或Pol蛋白，能够在哺乳动物中诱导免疫应答的任何HIV蛋白或者其片段可以与本发明的方法联合应用。来自不同HIV分化体(例如，HIV分化体A，B，C，MN，等)的HIV Gag，Env和Pol蛋白，以及编码这些蛋白的核酸序列，和用于将所述核酸序列操作和插入载体的方法，是已知的(参见，例如，HIV Sequence Compendium，Division of AIDS，National Institute ofAllergy and Infectious Diseases(2003)，HIV Sequence Database(http://hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/mainpage.html)，Sambrook等.，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，和Ausubel等.，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons，New York，N.Y.(1994))。
应该理解产生免疫应答不需要全部的、完好无缺的HIV蛋白。事实上，HIV蛋白的大部分抗原表位大小相对较小。因此，HIV蛋白，诸如本文所描述的任何HIV蛋白的片段(例如，表位或其它抗原片段)，可以被用作HIV抗原。HIV Gag，Env，和Pol蛋白的抗原片段和表位，以及编码这些抗原片段和表位的核酸序列是已知的(参见，例如，HIV Immunology andHIV/SIV Vaccine Databases，卷1，Division of AIDS，National Institute ofAllergy and Infectious Diseases(2003))。
HIV抗原还包括融合蛋白和多蛋白(ployproteins)。融合蛋白可以包括融合到另外一种，或者融合到全部或部分的不同HIV蛋白或其它多肽上的一种或多种抗原性HIV蛋白片段(例如，表位)。所述融合的蛋白可以包括本文所描述的任何HIV抗原的全部或部分。例如，全部或部分的HIVEnv蛋白(例如，gp120或gp160)，可以融合到全部或部分的HIV Pol蛋白上，或者全部或部分的HIV Gag蛋白可以融合到全部或部分的HIV Pol蛋白上。这样的融合蛋白有效地提供本发明的上下文中的多种HIV抗原，并且与由单一HIV抗原产生的免疫应答相比，所述融合蛋白可以用于产生针对给出的HIV病原体的更加完整的免疫应答。相似地，多蛋白也可以提供多种HIV抗原。与本发明联合应用的多蛋白包括提供两种或多种HIV抗原，诸如本文所描述的两种或多种任何HIV抗原的那些蛋白。应用单独的核酸序列，通过腺病毒载体将融合蛋白或多蛋白运送到哺乳动物，允许将免疫系统暴露于多种抗原，并且因此，便利地允许单一组合物提供针对多种HIV抗原或单一抗原的多种表位的免疫性。可以通过已知的方法制备编码HIV抗原的融合蛋白和多蛋白的核酸序列，并将其插入载体中(参见，例如，美国专利5,130,247和5,130,248，Sambrook等.，如上文所述，和Ausubel等.，如上文所述)。
所述腺病毒载体组合物包括编码两种或多种不同HIV抗原的一种或多种腺病毒载体。应该明白腺病毒载体通过已被插入所述腺病毒载体的核酸序列的方式“编码”抗原。如果它们包括不同的抗原性氨基酸序列，那么HIV抗原是“不同的”。所述两种或多种不同HIV抗原可以是任何HIV抗原，诸如本文所描述的两种或多种HIV抗原。优选地，所述腺病毒载体组合物包括一种或多种腺病毒载体，其编码三种或多种，或者甚至四种或更多种不同的HIV抗原。应该理解将哺乳动物的免疫系统暴露于不同的HIV抗原“混合物”，可以引起比将所述免疫系统仅暴露于单一的HIV抗原更广泛的和更有效的免疫应答。
所述两种或多种不同的HIV抗原可以由来自不同的HIV蛋白(例如，HIV Gag，Env，Pol，等)或不同的HIV分化体(例如，HIV分化体A，B，C，D，E，MN，等)的两种或多种抗原提供。例如，HIV Gap蛋白和Pol蛋白为不同的抗原。类似地，HIV分化体A Env蛋白和HIV分化体B Env蛋白为不同的HIV抗原。优选地，所述两种或多种不同的HIV抗原包括来自两种或多种不同的HIV分化体的HIV抗原。更优选地，所述腺病毒载体组合物包括腺病毒载体，其编码来自三种或多种不同的HIV分化体的三种或多种不同的HIV抗原，或者甚至是来自四种或多种不同的HIV分化体的四种或多种不同的HIV抗原。备选地，所述两种或多种HIV抗原的至少一种可以为嵌合抗原，其包括衍生于从两种或多种不同的HIV分化体获得的相同抗原的氨基酸序列。例如，嵌合Env蛋白可以包括从分化体A HIV获得的Env氨基酸序列的一部分，和从分化体B HIV获得的Env氨基酸序列的一部分。
例如，所述腺病毒载体组合物可以由下述组合物提供，即，包括一种或多种腺病毒载体(例如，单一的腺病毒载体)的组合物，其中每一种腺病毒载体编码两种或多种不同的HIV抗原，或者包括两种或多种腺病毒载体(例如，多腺病毒载体)的组合物，其中每一种腺病毒载体编码一种或多种不同的HIV抗原，并且因此，共同编码两种或多种不同的HIV抗原。当所述腺病毒载体组合物包括每一种编码两种或多种HIV抗原的一种或多种腺病毒载体(例如，单一腺病毒载体)时，每一种腺病毒载体可以包括(i)编码两种或多种不同HIV抗原(例如，多蛋白或融合蛋白)的核酸序列，或者(ii)两种或多种核酸序列，其中每一种编码不同的HIV抗原。与构型(i)一致，应用包括编码多于两种不同的HIV抗原(例如，三种或更多种，四种或更多种，或者甚至是五种或更多种不同的HIV抗原)或者编码同一抗原的多个拷贝的核酸序列的腺病毒在本发明的范围内，条件是其编码至少两种或多种不同的HIV抗原。同样地，与构型(ii)一致，应用包括每一种编码不同的HIV抗原或同一抗原的多个拷贝的一些核酸序列(例如，三种或更多种，四种或更多种，或者甚至是五种或更多种不同的核酸序列)的腺病毒载体在本发明的范围内，条件是所述腺病毒载体编码至少两种不同的HIV抗原。不论通过构型(i)或(ii)，所述腺病毒载体组合物优选地包括编码三种或更多种，或者甚至是四种或更多种不同的HIV抗原的一种或多种腺病毒载体(例如，其中所述的每一种载体包括编码三种或更多种，或者四种或更多种不同的HIV抗原的核酸序列，或者其中所述的每一种载体包括三种或更多种，或者四种或更多种核酸序列，并且每种核酸序列编码不同的HIV抗原)。理想地，所述两种或更多种，三种或更多种，或者四种或更多种不同的HIV抗原来自两种或更多种，三种或更多种，或者四种或更多种不同的HIV分化体。
优选地，所述腺病毒载体组合物包括编码两种或多种不同的HIV抗原的两种或多种腺病毒载体，并且每一种腺病毒载体包括编码所述两种或多种不同的HIV抗原的至少一种的核酸序列。尽管所述腺病毒载体组合物包括编码两种或多种不同HIV抗原的两种或多种腺病毒载体，对于所应用的腺病毒载体的数目，或者由此编码的不同HIV抗原的数目，没有上限。优选地，所述腺病毒载体组合物包括编码三种或多种不同HIV抗原的三种或多种腺病毒载体，并且每一种腺病毒载体包括编码所述三种或多种不同HIV抗原的至少一种的核酸序列。最优选地，所述腺病毒载体组合物包括编码四种或多种不同HIV抗原的四种或多种腺病毒载体，并且每一种腺病毒载体包括编码所述四种或多种不同HIV抗原的至少一种的核酸序列。理想地，所述两种或更多种，三种或更多种，或者四种或更多种不同HIV抗原是来自两种或更多种，三种或更多种，或者四种或更多种不同的HIV分化体。
当然，可以应用上述腺病毒载体构型的组合，而并不背离本发明的精神和范围。例如，按照本发明所应用的腺病毒载体组合物可以包括第一种腺病毒载体，其编码单一的HIV抗原，和第二种腺病毒载体，其编码不同于第一种腺病毒载体所编码的HIV抗原的两种或多种HIV抗原。其它类似的本文所公开的腺病毒载体构型的组合和排列是显而易见的，并且可以按照本发明应用。
当所述腺病毒载体组合物包括两种或多种腺病毒载体时，包含在所述组合物中的两种或多种腺病毒载体中的每一种的相对量将取决于许多因素，其包括与其它HIV抗原相比的具体的HIV抗原的免疫原性。所述腺病毒载体组合物可以包括等量的所述两种或多种腺病毒载体的每一种。备选地，所述腺病毒载体组合物可以包括不同量的所述两种或多种腺病毒载体的每一种。
在本发明特别优选的实施方案中，所述腺病毒载体组合物包括4种腺病毒载体，其中每一种分别包括编码分化体B Gag-Pol融合蛋白，分化体A gp140，分化体B gp140和分化体C gp140的核酸序列。最优选地，所述腺病毒载体组合物包括具有核酸序列SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的4种腺病毒载体。SEQ ID NO4是编码分化体B Gag-Pol融合蛋白的E1/E4-缺失腺病毒载体的核酸序列。SEQ IDNO5是编码分化体A gp140蛋白的E1/E4-缺失腺病毒载体的核酸序列。SEQ ID NO6是编码分化体B gp140蛋白的E1/E4-缺失腺病毒载体的核酸序列。SEQ ID NO7是分化体C gp140蛋白的核酸序列。理想地，所述腺病毒载体组合物以3∶1∶1∶1的重量比例包括下述腺病毒载体，分别为包括编码分化体B Gag-Pol融合蛋白的核酸序列的腺病毒载体，包括编码分化体A gp140的核酸序列的腺病毒载体，包括编码分化体B gp140的核酸序列的腺病毒载体，和包括编码分化体C gp140的核酸序列的腺病毒载体。
典型地，所述腺病毒载体包括编码一种或多种HIV抗原的核酸作为表达盒的一部分，即，拥有有助于核酸序列的亚克隆和回收(例如，一个或多个限制性酶切位点)或核酸序列的表达(例如，多聚腺苷化作用或剪接位点)功能的具体核苷酸序列。所述核酸优选地位于腺病毒基因组的E1区(例如，完全或部分地置换E1区)或E4区。例如，E1区可以由包括编码抗原的核酸的可用启动子表达盒置换。所述表达盒任选地可以以3′-5′方向插入，例如，以所述表达盒的转录方向与周围临近的腺病毒基因组的方向相反这样的方向导向。然而，对于所述表达盒，以与周围基因组的转录方向相关的5′-3′方向插入也是适当的。除了包括编码抗原的核酸的表达盒，所述腺病毒载体包括包含其它外源核酸的其它表达盒，所述表达盒可以置换腺病毒基因组的任何删除的区域。将表达盒插入所述腺病毒基因组(例如，插入基因组的E1区)可以通过已知方法实现，例如，通过在腺病毒基因组的给出位置引入独特的限制性酶切位点。如上文所提出的，优选地所述腺病毒载体的全部或部分E3区也被删除。
优选地，将所述编码抗原的核酸可操作地连接到(即，在其转录控制下)一种或多种启动子和/或增强子元件上，例如，作为可用启动子表达盒的一部分。在本领域，用于有效地将序列连接到一起的技术是公知的。“启动子”是指导RNA聚合酶的结合并且由此启动RNA合成的DNA序列。将核酸序列“可操作地连接”到启动子上，此时所述启动子能够指导核酸序列的转录。对于可操作连接的核酸序列的启动子可以是天然的或非天然的。
任何启动子(即，不管是从天然分离的还是通过重组DNA或合成技术产生的)可以与本发明结合应用以提供核酸序列的转录。所述启动子优选地能够在真核(理想地哺乳动物)细胞中指导转录。所述启动子的功能可以被在载体上存在的一种或多种增强子和/或沉默基因而改变。“增强子”为激活或抑制相邻基因的转录的DNA的顺式作用元件。抑制转录的增强子也叫做“沉默基因”。增强子与用于只在启动子中发现的序列特异性DNA结合蛋白的DNA结合位点不同(其也叫做“启动子元件”)，原因在于增强子可以以任何方向，并且在多达几千碱基对(kb)的距离，甚至从转录区的下游位置起作用。
启动子区可以在长度和序列上不同，并且还可以包括用于序列特异性DNA结合蛋白的一种或多种DNA结合位点和/或增强子或沉默基因。增强子和/或沉默基因可以类似地存在于本质上在启动子外的核酸序列上。理想地，细胞或病毒增强子，诸如巨细胞病毒(CMV)早期增强子，位于接近启动子的地方，以增强启动子活性。另外，核酸序列上可以存在剪接受体和供体位点，以增强转录。
在本发明的上下文中任何适当的启动子或增强子序列都可以应用。在这方面，编码抗原的核酸序列可以可操作地连接到病毒启动子上。适当的病毒启动子包括，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子，诸如CMV早期启动子(例如，在美国专利5,168,062和5,385,839中所描述)，衍生于人类免疫缺陷病毒(HIV)的启动子，诸如HIV长末端重复启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子，诸如RSV长末端重复，小鼠乳癌病毒(MMTV)启动子，HSV启动子，诸如Lap2启动子或疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等.，Proc.Natl.Acad.Sci.，78，144-145(1981))，衍生于SV40或埃巴病毒的启动子，腺伴随病毒启动子，诸如p5启动子，等等。
备选地，本发明应用细胞启动子，即，促进细胞蛋白表达的启动子。优选地用于本发明的细胞启动子将取决于产生抗原的理想的表达模式。一方面，所述细胞启动子优选地为在多种细胞类型，诸如本文所述的免疫细胞中作用的组成型启动子。适当的组成型启动子可以促进编码转录因子的基因，持家基因，或者真核细胞常见的结构基因的表达。例如，Ying Yang1(YY1)转录因子(也叫做NMP-1，NF-E1和UCRBP)是一种普遍存在的核转录因子，其为核基质的固有组分(Guo等.，PNAS，92，10526-10530(1995))。尽管认为本文所描述的启动子是组成型启动子，在本领域应该明白组成型启动子可以被上调节。启动子分析表明，相对于从启动子的转录起始位点，基础转录的关键元件位于YY1基因的-277到+475，并且包括TATA和CCAAT盒。JEM-1(也叫做HGMW和BLZF-1)也是在正常和肿瘤组织中鉴别出的普遍存在的核转录因子(Tong等.，Leukemia，12(11)，1733-1740(1998)，和Tong等.，Genomics，69(3)，380-390(2000))。JEM-1参与细胞生长控制和成熟，并且可以通过视黄酸上调节。相对所述启动子的转录起始位点，负责JEM-1启动子最大活性的序列位于JEM-1基因的-432到+101。与YY1启动子不同，JEM-1启动子不包括TATA盒。遍在蛋白启动子(ubiquitin promoter)，特别地UbC，是在一些物种中有作用的强组成型活性启动子。在Marinovic等.，J.Biol.Chem.，277(19)，16673-16681(2002)中进一步特征性描述UbC启动子。
许多上文所述的启动子为组成型启动子。除了为组成型启动子，所述启动子可以为可调节启动子，即，应答适当的信号上调和/或下调的启动子。可调节启动子或表达控制序列的应用特别适用于作为抗原蛋白的DNA疫苗开发，所述抗原蛋白包括病毒和寄生虫抗原，通常对互补细胞系是毒性的。在一个实施方案中，可操作地连接到编码抗原的核酸序列的调节序列包括四环素表达系统组分，例如，tet操纵子位点。例如，将编码抗原的核酸序列可操作地连接到启动子上，所述启动子可操作地连接一种或多种tet操纵子位点。包括这样的表达盒的腺病毒载体可以在互补细胞系中繁殖，诸如例如在美国专利5,994,106和国际专利申请公布WO95/34671中描述的293-ORF6，其包括编码tet阻抑蛋白的核酸序列。通过在所述互补细胞系中产生tet阻抑蛋白，抑制抗原产生，并且获得繁殖，而没有任何抗原介导相关的毒性。适当的可调节启动子系统还包括，但不限于，IL-8启动子；金属硫蛋白可诱导的启动子系统，细菌lacZYA表达系统，和T7聚合酶系统。此外，可以应用在不同发育阶段选择性地激活的启动子(例如，在胚胎和成人中，球蛋白基因从球蛋白相关的启动子差异转录)。所述启动子序列可以含有应答外源试剂的调节的至少一种调节序列。所述调节序列优选地应答外源试剂，诸如，但不限于，药物，激素，放射，或其它基因产物。
启动子可以为组织特异性启动子，即，优先在给定的组织中激活并且在所激活的组织中引起基因产物表达的启动子。基于目标组织或细胞型，适用于本发明的组织特异性启动子可以由普通技术人员选择。用于本发明方法的优选的组织特异性启动子是对免疫细胞特异的，诸如在Morita等.，Gene Ther.，8，1729-37(2001)中所描述的树突状细胞特异性Dectin-2启动子。
在另一个实施方案中，所述启动子可以为嵌合启动子。启动子是“嵌合的”，原因在于其包括至少两种核酸序列片段，所述核酸序列片段获得于，衍生于，或基于至少两种不同的来源(例如，生物体基因组的两个不同区域，两种不同的生物体，或者与合成序列组合的生物体)。优选地，所述两种不同的核酸序列片段表现出对于彼此少于约40％，更优选地少于约25％，并且更加优选地少于约10％的核酸序列同一性(其可以通过本文别处所描述的方法确定)。任何适当的嵌合启动子可以用于本发明的方法。
通过将其活性的具体模式与抗原表达的理想模式和水平相匹配，可以选择用于本发明的启动子。例如，在其中腺病毒载体包括编码不同抗原的两种或多种核酸序列的实施方案中，每种核酸序列可以可操作地连接到展示不同的表达模式的不同的启动子上。例如，选择第一种启动子来调控抗原产生的初始峰值，由此引发针对所编码的抗原的免疫系统。选择第二种启动子以促进相同的或不同的抗原的产生，以便在所述第一种启动子表达达到峰值后几天第二种启动子的表达到达最高点，由此“增强”针对所述抗原的免疫系统。备选地，可以构建组合多种启动子的理想特征(aspect)的嵌合启动子。例如，CMV-RSV杂合启动子，其组合了CMV启动子的初始活性急增(rush)和RSV启动子的活性高度维持水平，其特别优选用于本发明方法的许多实施方案中。由于抗原可能对真核细胞有毒性，在用于增殖所述腺病毒载体的互补细胞系中，修饰所述启动子可以有利地减少活性。
为了最优化蛋白生产，优选地所述编码抗原的核酸序列还包括多聚腺苷化位点，其紧接着所述编码抗原的核酸序列的编码序列。可以应用任何适当的多聚腺苷化序列，包括合成的最优化的序列，以及BGH(牛生长素)、多瘤病毒、TK(胸苷激酶)、EBV(埃巴病毒)、和乳头瘤病毒(包括人乳头瘤病毒和BPV(牛乳头瘤病毒))的多聚腺苷化序列。优选的多聚腺苷化序列为SV40(人肉瘤病毒-40)多聚腺苷化序列。并且，优选地，正确地排列所有正确转录信号(和翻译信号，在适当的情形)，以便所述核酸序列在其被引入的细胞中正确地表达。如果有必要，所述核酸序列还可以结合剪接位点(即，剪接受体和剪接供体位点)，以促进mRNA产生。
如果编码抗原的核酸序列编码已加工或分泌的蛋白或肽，或者在细胞内作用的蛋白，那么优选地所述编码抗原的核酸序列还包括用于加工、分泌、细胞内定位等的适当的序列。可以将所述编码抗原的核酸序列可操作地连接到信号序列上，所述信号序列将蛋白靶向用于分泌的细胞器。适当的信号序列包括，但不限于，免疫球蛋白重链和细胞因子的前导序列，(参见，例如，Ladunga，Current Opinions in Biotechnology，11，13-18(2000))。从宿主细胞分泌蛋白可能需要其它蛋白修饰，其可以用常规实验室技术确定。例如，在美国专利6,500,641中进一步描述制备编码抗原和信号序列的表达构建体。分泌非分泌蛋白的方法，例如，在美国专利6,472,176和国际专利申请公布WO 02/48377中进一步描述。
还可以修饰由所述腺病毒载体的核酸序列编码的抗原蛋白，以将所述抗原附着或结合到宿主细胞表面。在这方面，所述抗原可以包括用于缀合到细胞表面的膜锚着点，诸如gpi-锚着点。可以将跨膜结构域融合到所述抗原上，以将抗原蛋白的末端结合到细胞膜上。用于在细胞表面陈列肽的其它方法在本领域内已知，并且适当的用于本发明的上下文中。
按照本发明，所述腺病毒载体组合物施用给动物，优选地为哺乳动物(例如，人)，其中表达编码抗原的每种核酸序列，以诱导针对所述抗原的免疫应答。免疫应答可以是体液免疫应答，细胞介导的免疫应答，或者，理想地，体液和细胞介导的免疫的组合。理想地，用包括抗原的感染试剂后发激活时所述免疫应答提供保护。然而，本发明的上下文中并不要求保护性免疫。本发明的方法还可以用于抗体生产和收获。
为了增强针对HIV抗原产生的免疫应答，所述腺病毒载体组合物还可以包括编码免疫刺激物，诸如细胞因子、趋化因子或蛋白伴侣的核酸序列。细胞因子包括，例如，巨噬细胞集落刺激因子(例如，GM-CSF)，干扰素α(IFN-α)，干扰素β(IFN-β)干扰素γ(IFN-γ)，白介素(IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16和IL-18)，TNF家族蛋白，细胞间黏附分子-1(ICAM-1)，淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3)，B7-1，B7-2，FMS-相关的酪氨酸激酶3配体，(Flt3L)，血管活性肠肽(VIP)，和CD40配体。趋化因子包括，例如，吸引B细胞的趋化因子-1(BCA-1)，CXXXC趋化分子，促黑素瘤生长活性蛋白(MGSA)，血过滤CC趋化因子1(HCC-1)，白介素8(IL8)，促干扰素T细胞α化学引诱物(Interferon-stimulated T-cell alpha chemoattractant，I-TAC)，淋巴肌动蛋白，单核细胞趋化性蛋白1(MCP-1)，单核细胞趋化性蛋白3(MCP-3)，单核细胞趋化性蛋白4(MCP-4)，巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC)，巨噬细胞炎性蛋白(MIP)，血小板因子4(PF4)，RANTES，BRAK，eotaxin，exodus1-3，等等。蛋白伴侣包括，例如，热激蛋白Hsp170，Hsc70和Hsp40。细胞因子和趋化因子一般在本领域内描述，包括Invivogen目录(2002)，SanDiego，CA。
施用腺病毒载体组合物可以是在哺乳动物中诱导针对HIV的免疫应答的多步方案中的一个组成。在这方面，本发明的方法还包括给哺乳动物施用引发组合物(primer composition)，所述引发组合物包括编码至少一种HIV抗原的一种或多种核酸序列，所述HIV抗原与腺病毒载体组合物的腺病毒载体编码的HIV抗原相同，其中所述引发组合物的施用在施用腺病毒载体组合物前至少1周进行。因此，本发明的这一实施方案代表一组致敏(prime)并且增强的免疫方案，其中免疫应答通过施用引发组合物而“致敏”，并且通过施用所述腺病毒载体组合物而“增强”。所述引发组合物的一种或多种核酸序列可以作为基因转移载体的一部分或者作为裸DNA而施用。在所述引发组合物中，可以应用任何基因转移载体，包括病毒和非病毒基因转移载体。适当的病毒基因转移载体的实例包括，但不限于，反转录病毒载体，腺伴随病毒载体，牛痘病毒载体，疱疹病毒载体，或腺病毒载体。适当的非病毒载体的实例包括，但不限于，质粒，脂质体，和分子缀合物(例如，运铁蛋白)。理想地，所述基因转移载体为质粒或腺病毒载体。备选地，免疫应答可以通过施用抗原本身例如，抗原性蛋白，灭活的病原体，等等而致敏或增强。
尽管由所述引发组合物的一种或多种核酸序列编码的抗原优选地与由所述腺病毒载体组合物的腺病毒载体编码的HIV抗原相同，但是，在一些实施方案中，可以适当地应用包括编码与所述腺病毒载体组合物编码的抗原不同的HIV抗原的一种或多种核酸序列的引发组合物。优选地，所述引发组合物包括一种或多种核酸序列，其编码与由腺病毒载体组合物的一种或多种腺病毒载体编码的HIV抗原相同的两种或多种HIV抗原。更加优选地，所述引发组合物包括一种或多种核酸序列，其编码由所述腺病毒载体组合物的一种或多种腺病毒载体所编码的所有HIV抗原。
将所述引发组合物施用给哺乳动物，以引发针对HIV的免疫应答。多于一剂量的引发组合物可以以任何适当的时限提供(例如，在增强之前至少大约1周，2周，4周，8周，12周，16周，或者更久)。优选地，所述引发组合物在施用腺病毒载体组合物之前至少3个月(例如，3，6，9，12，或更多个月)施用给哺乳动物。最优选地，所述引发组合物在施用腺病毒载体组合物前至少大约6个月-大约9个月施用给哺乳动物。将所述腺病毒载体组合物施用给哺乳动物，以增强针对HIV的免疫应答。为了维持免疫性，多于一剂量的腺病毒载体组合物可以以任何适当的时限提供。
所述腺病毒载体组合物和/或所述引发组合物理想地以药用(例如，生理学可接受)组合物施用，所述药用组合物包括载体，优选地生理学上(例如，制药学上)可接受的载体，和腺病毒载体组合物。任何适当的载体可以用在本发明上下文内，并且在本领域内这样的载体是公知的。载体的选择将部分取决于所述组合物施用的具体位点和用来施用所述组合物的具体方法。理想地，在腺病毒载体的环境(context)中，所述药物组合物优选地没有复制型腺病毒。所述药物组合物可以任选地为无菌的，或者除了一种或多种腺病毒载体外为无菌的。
用于药物组合物的适当的制剂包括水性和非水性溶液，等渗无菌溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂，和水性和非水性无菌混悬液，其可以包括混悬剂，增溶剂，增稠剂，稳定剂和防腐剂。所述制剂可以以单位剂量或多剂量密封容器，诸如安瓿和小瓶的形式存在，并且可以以冷冻干燥(冻干)条件保存，在使用前仅需要立即加入无菌液体载体，例如，水。临时的溶液和混悬液可以从无菌粉剂、粒剂和片剂制备。优选地，所述载体为缓冲盐溶液。更加优选地，配制用于本发明方法的所述药物组合物，以保护所述腺病毒载体在施用前免受损坏。例如，可以配制所述药用组合物，以减少腺病毒在用来制备、存储、或施用所述表达载体的装置，诸如玻璃器皿、注射器或针头上的损失。可以配制所述药物组合物，以减少腺病毒载体的光敏感性和/或温度敏感性。为了这一目的，所述药物组合物优选地包括药用液体载体，诸如，例如，上文所描述的那些，和选自由下列物质组成的组的稳定剂聚山梨酸酯80，L-精氨酸，聚乙烯吡咯烷酮，海藻糖，和它们的组合物。这样的组合物的应用将延长所述载体的保存寿命，帮助施用，并且增加本发明方法的功效。例如，对于含有腺病毒载体的组合物的制剂，在美国专利6,225,289，6,514,943，美国专利申请公布号2003/0153065 A1，和国际专利申请公布WO 00/34444中进一步描述。还可以配制药物组合物，以增强所述腺病毒载体的转导效率。另外，本领域的一名普通技术人员应该理解，所述药物组合物可以包括其它治疗性或生物活性药剂。例如，控制炎症的因子，诸如布洛芬或甾族化合物(steroids)，可以是所述药物组合物的部分，以减少与所述腺病毒载体的体内施用相关的肿胀和炎症。如本文所讨论的，可以施用免疫系统刺激剂，以增强针对抗原的任何免疫应答。可以存在抗生素，即，杀微生物剂和杀真菌剂，以治疗现存的感染和/或减少将来感染，诸如与基因转移流程相关的感染的风险。
可以应用任何施用途径来将所述药物组合物运送给哺乳动物。实际上，尽管可以应用多于一种途径来施用所述药物组合物，一种独特的途径可以比其它途径提供更直接的和更有效的反应。优选地，所述药物组合物通过肌内注射施用。所述药用组合物还可以应用或灌输到体腔内，通过皮肤吸收(例如，通过透皮贴片)，吸入，摄取，局部应用到组织，或者通过，例如，静脉内、腹膜、或动脉内施用进行肠胃外施用。
所述药物组合物可以在允许可控制的或者持续释放的装置之内或之上进行施用，所述装置诸如海绵，生物相容的网筛，机械储存库，或机械植入物。植入物(参见，例如，美国专利5,443,505)，装置(参见，例如，美国专利4,863,457)，诸如可移植的装置，例如，包括聚合组合物的机械储存库或植入物或装置，对于所述药物组合物的施用特别有效。所述药物组合物还可以以持续释放的制剂形式施用(参见，例如，美国专利5,378,475)，所述制剂包括，例如，凝胶泡沫，透明质酸，明胶，硫酸软骨素，聚磷酸酯，诸如双-2-羟乙基-对苯二酸酯(BHET)，和/或聚乳酸-乙二酸。
给哺乳动物施用的药物组合物的剂量将取决于许多因素，包括目标组织的大小，任何副作用的程度，施用的具体途径等。所述剂量理想地包括“有效量的”腺病毒载体组合物和/或引发组合物，即，一剂的腺病毒载体组合物和/或引发组合物，其在哺乳动物中激发需要的免疫应答。所述需要的免疫应答可以承受抗体产生，在后发刺激时的保护，免疫耐受性，免疫细胞活化，等等。在其中所述腺病毒载体组合物包括两种或多种腺病毒载体的实施方案中，应该理解，本发明方法的所述药物组合物包括一剂的腺病毒载体，其为其中所包含的两种或多种腺病毒载体的每一种的组合剂量。
理想地，所述腺病毒载体组合物包括单一剂量的腺病毒载体，其包括至少大约1×105个颗粒(其还叫做颗粒单位)的腺病毒载体。所述剂量优选地为至少大约1×106个颗粒(例如，大约1×106-1×1012个颗粒)，更加优选地至少大约1×107个颗粒，更加优选地至少大约1×108个颗粒(例如，大约1×108-1×1011个颗粒或大约1×108-1×1012个颗粒)，并且最优选地至少大约1×109个颗粒(例如，大约1×109-1×1010个颗粒或大约1×109-1×1012个颗粒)，或者甚至至少大约1×1010个颗粒(例如，大约1×1010-1×1012个颗粒)的腺病毒载体。备选地，所述剂量包括不多于大约1×1014个颗粒，优选地不多于大约1×1013个颗粒，甚至更加优选地不多于大约1×1012个颗粒，甚至更加优选地不多于大约1×1011个颗粒，和最优选地不多于大约1×1010个颗粒(例如，不多于大约1×109个颗粒)。换句话说，所述腺病毒载体组合物可以包括单一剂量的腺病毒载体，其包括，例如，大约1×106个颗粒单位(pu)，2×106pu，4×106pu，1×107pu，2×107pu，4×107pu，1×108pu，2×108pu，4×108pu，1×109pu，2×109pu，4×109pu，1×1010pu，2×1010pu，4×1010pu，1×1011pu，2×1011pu，4×1011pu，1×1012pu，2×1012pu或4×1012pu的腺病毒载体。
所述引发组合物理想地包括至少大约1mg的核酸，典型地和优选地为DNA。所述引发组合物优选地包括1mg或更多的核酸(例如，大约1mg，2mg，3mg，4mg，5mg或更多)。在优选的实施方案中，所述引发组合物包括约2mg-约5mg核酸(例如，约3mg或4mg)，更加优选地约3mg-约5mg核酸(例如，约3.5mg)，并且最优选地约4mg-约5mg核酸(例如，约4.5mg)。
已证明修饰的病毒是用于研究性和治疗性基因转移应用的便利的载体系统，并且腺病毒载体系统存在对于这些应用的一些优点。在人类中，腺病毒通常与良性病理相关，并且已经充分研究了36千对碱基(kb)的腺病毒基因组。腺病毒载体可以以高滴度(例如，大约1013个颗粒形成单位(pfu))产生，并且这样的载体可以将遗传物质转移到非复制，以及复制的细胞中；例如，和反转录病毒形成对比，所述反转录病毒仅将遗传物质转移到复制细胞中。可以处理所述腺病毒基因组，以携带大量的外源DNA(多达约8kb)，并且腺病毒壳体能够加强甚至更长的序列的转移(Curiel等.，Hum.Gene Ther.，3，147-154(1992))。并且，腺病毒通常不结合到宿主细胞染色体上，而是维持为线性附加体，因此将重组腺病毒干扰正常细胞功能的可能性最小化。除了作为用于将遗传物质转移到广泛种类的细胞类型的优良运载工具，腺病毒载体代表对于基因转移的安全选择，这是对于治疗应用的特别关注。
来自各种起源，亚型，或亚型混合物的腺病毒可以用作用于腺病毒载体的病毒基因组的来源。尽管非人类腺病毒(例如，猿，禽类，犬类，绵羊或牛腺病毒)可以用来产生腺病毒载体，但是优选将人类腺病毒用作用于本发明方法的腺病毒载体的病毒基因组的来源。腺病毒可以是各种亚组或血清型。例如，腺病毒可以是亚组A(例如，血清型12，18和31)，亚组B(例如，血清型3，7，11，14，16，21，34，35和50)，亚组C(例如，血清型1，2，5和6)，亚组D(例如，血清型8，9，10，13，15，17，19，20，22-30，32，33，36-39和42-48)，亚组E(例如，血清型4)，亚组F(例如，血清型40和41)，未分类的血清组(例如，血清型49和51)，或任何其它腺病毒血清型。腺病毒血清型1-51可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA)获得。优选地，在本发明方法的内容中，所述腺病毒载体为人亚组C，特别是血清型2或者甚至更加理想地是血清型5。然而，非组C腺病毒可以用来制备腺病毒基因转移载体，以将基因产物运送到宿主细胞。用于构建非组C腺病毒基因转移载体的优选腺病毒包括Ad12(组A)，Ad7和Ad35(组B)，Ad30和Ad36(组D)，Ad4(组E)，和Ad41(组F)。非组C腺病毒载体，生产非组C腺病毒载体的方法，和应用非组C腺病毒载体的方法，例如，在美国专利5,801,030，5,837,511和5,849,561，以及国际专利申请WO 97/12986和WO 98/53087中公开。
所述腺病毒载体可以包括亚型的混合物，并且因而成为“嵌合”腺病毒载体。嵌合腺病毒载体可以包括衍生于两种或多种(例如，2，3，4等)不同的腺病毒血清型的腺病毒基因组。在本发明的内容中，嵌合腺病毒载体可以包括大约等量的所述两种或多种不同腺病毒血清型的每一种的基因组。当所述嵌合的腺病毒载体基因组包括两种不同的腺病毒血清型的基因组时，所述嵌合的腺病毒载体基因组优选地包括一种腺病毒血清型的不多于约70％(例如，不多于约65％，约50％，或约40％)的基因组，其余的嵌合腺病毒基因组衍生于另一种腺病毒血清型的基因组。在一个实施方案中，所述嵌合腺病毒载体可以含有包括一部分血清型2基因组和一部分血清型5基因组的腺病毒基因组。例如，腺病毒血清型5基因组的5，区域(即，所述基因组5’区域到腺病毒E1区域)可以用腺病毒血清型2基因组的相应区域置换(例如，Ad5基因组5’区域到腺病毒基因组E1区域用Ad2基因组的核苷酸1-456置换)。
本发明的腺病毒载体可以是复制型的。例如，所述腺病毒载体可以在腺病毒基因组中具有不抑制病毒在宿主细胞中复制的突变(例如，缺失，插入，或置换)。本发明的腺病毒载体还可以是条件性复制型的。然而，优选地，所述腺病毒载体在宿主细胞中是复制缺陷型的。
“复制缺陷型”意为所述腺病毒载体需要互补于复制所需要的腺病毒基因组的一个或多个区域，这是由例如，至少一种复制必需基因功能的缺陷引起(即，以致所述腺病毒载体不能在典型的宿主细胞，特别是在本发明方法疗程中可能受到所述腺病毒载体感染的人类患者的那些细胞中复制)。在基因，基因功能，或基因组区域的缺陷，如本文所用，定义为删除所述病毒基因组的足够的遗传物质，以删除或消弱所述基因的功能(例如，以致所述基因产物的功能减少至少约2倍，5倍，10倍，20倍，30倍，或50倍)，其核酸序列全部或部分被删除。对于中断复制必需的基因功能，通常不需要删除整个基因区域。然而，对于在所述腺病毒基因组中为一种或多种转基因提供足够的空间的目的，移除大多数的基因区域可能是需要的。尽管优选删除遗传物质，但是通过添加或置换突变遗传物质也适用于中断基因功能。复制必需的基因功能是那些复制所需要(例如，增殖)的基因功能，并且，例如，由腺病毒早期区域(例如，El，E2和E4区域)，晚期区域(例如，L1-L5区域)，参与病毒包装的基因(例如，IVa2基因)和病毒相关的RNAs(例如，VA-RNA1和/或VA-RNA-2)编码。
所述复制缺陷型腺病毒载体理想地需要互补所述腺病毒基因组的一个或多个区域的至少一种复制必需基因功能。优选地，所述腺病毒载体需要互补于对于病毒复制所需要的腺病毒基因组的E1A区域，E1B区域或E4区域的至少一种基因功能(表示为E1-缺陷型或E4-缺陷型腺病毒载体)。除了在E1区域的缺陷型，所述重组腺病毒还可以在主要晚期启动子(MLP)中具有突变，如在国际专利申请公布WO 00/00628中所讨论的那样。最优选地，所述腺病毒载体缺失E1区域的至少一种复制必需基因功能(理想地所有复制必需的基因功能)，和非必需的E3区域的至少一种基因功能(例如，E3区域的Xba I缺失)(表示为E1/E3-缺陷型腺病毒载体)。关于E1区域，所述腺病毒载体可以缺失部分或全部的E1A区域和/或部分或全部的E1B区域，例如，缺失E1A和E1B区域每一区域的至少一种复制必需的基因功能，因此对于复制，需要互补于所述腺病毒基因组的E1A区域和E1B区域。对于复制，所述腺病毒载体还可以需要互补于所述腺病毒基因组的E4区域，诸如通过缺失E4区域的一种或多种复制必需的基因功能。
当所述腺病毒载体为E1缺陷型时，所述腺病毒载体基因组可以包括起始于核苷酸335-375之间的任何核苷酸(例如核苷酸356)，并且终止于核苷酸3,310-3,350之间的任何核苷酸(例如，核苷酸3,329)，或者甚至终止于3,490和3,530之间的任何核苷酸(例如，核苷酸3,510)的缺失(基于腺病毒血清型5基因组)。
当为E2A-缺陷型时，所述腺病毒载体基因组可以包括起始于核苷酸22,425-22,465之间的任何核苷酸(例如，核苷酸22,443)，并且终止于核苷酸24,010-24,050之间的任何核苷酸(例如，核苷酸24,032)的缺失(基于腺病毒血清型5基因组)。当为E3-缺陷型时，所述腺病毒载体基因组可以包括起始于核苷酸28,575-29,615之间的任何核苷酸(例如核苷酸28,593)，并且终止于核苷酸30,450-30,490之间的任何核苷酸(例如，核苷酸30,470)的缺失(基于腺病毒血清型5基因组)。
当所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组的一个区域的至少一种复制必需基因功能时(例如，E1-或E1/E3-缺陷型腺病毒载体)，所述腺病毒载体被称为“单一复制缺陷型”。特别优选的单一复制缺陷型腺病毒载体为，例如，为了增殖所述腺病毒载体(例如，为了形成腺病毒载体颗粒)，至多需要互补于腺病毒基因组的E1区域的复制缺陷型腺病毒载体。
本发明的所述腺病毒载体可以为“多复制缺陷型”，意为所述腺病毒载体在腺病毒基因组的两个或多个区域的每一区域缺失一种或多种复制必需的基因功能，并且复制需要互补于这些功能。例如，前述E1-缺陷型或E1/E3-缺陷型腺病毒载体还可以缺失E4区域的至少一种复制必需的基因功能(表示为E1/E4-或E1/E3/E4-缺陷型腺病毒载体)，和/或E2区域的至少一种复制必需的基因功能(表示为E1/E2-或E1/E2/E3-缺陷型腺病毒载体)，优选地E2A区域的至少一种复制必需的基因功能(表示为E1/E2A-或E1/E2A/E3-缺陷型腺病毒载体)。缺失整个E4区域的腺病毒载体可以引发更低的宿主免疫应答。当为E4-缺陷型时，所述腺病毒载体基因组可以包括，起始于，例如，核苷酸32,805-32,845之间的任何核苷酸(例如，核苷酸32,826)，并且终止于，例如，核苷酸35,540-35,580之间的任何核苷酸(例如，核苷酸35,561)的缺失(基于腺病毒血清型5基因组)，任选地除了在E1区域的缺失(例如，核苷酸356-3,329或核苷酸356-3,510)(基于腺病毒血清型5基因组)，和/或在E3区域的缺失(例如，核苷酸28,594-30,469或核苷酸28,593-30,470)(基于腺病毒血清型5基因组)。定义所缺失的核苷酸片段的端点可能很难精确地确定，并且典型地不会显著地影响所述腺病毒载体的性质，即，每种前述核苷酸数目可以是+/-1，2，3，4，5或者甚至10或20个核苷酸。
如果本发明所述腺病毒载体缺失E2A区域的复制必需基因功能，所述载体优选地不包括E2A区域的完全缺失，其缺失在长度上优选地少于约230个碱基对。一般地，腺病毒的E2A区域编码DBP(DNA结合蛋白)，一种DNA复制所必需的多肽。DBP由473-529个氨基酸组成，其取决于病毒血清型。据信，DBP是一种不对称蛋白，其作为由具有延长的Nt结构域的球状Ct组成的扁长的椭圆体而存在。研究表明，所述Ct结构域负责DBP结合核酸、结合锌、和在DNA链延长水平上的DNA合成中起作用的能力。然而，据信所述Nt结构域在转录和转录后水平的晚期基因表达中起作用，负责蛋白有效的核定位，并且还可以参与增加其自身的表达。在Nt结构域氨基酸2-38之间的缺失已表明，这一区域对于DBP功能是重要的(Brough等.，Virology，196，269-281(1993))。尽管在编码DBP的Ct区域的E2A区域缺失对病毒复制没有作用，但是在编码DBP的Nt结构域的氨基酸2-38的E2A区域的缺失消弱病毒复制。优选地，任何多复制缺陷型腺病毒载体含有腺病毒基因组的E2A区域的这一片段。特别地，例如，要保留的E2A区域的理想的片段为这样的腺病毒基因组的E2A区域的片段，即，其由E2A区域的5’端定义，具体地是血清型Ad5腺病毒基因组E2A区域的位置Ad5(23816)-Ad5(24032)。为了提供需要水平的病毒增殖，腺病毒基因组的这一片段理想地被包含在所述腺病毒载体中，原因在于其在当前的E2A细胞系中不互补。
尽管上文所描述的缺失是关于腺病毒血清型5基因组的，但是本领域的一名普通技术人员，基于在各种腺病毒血清型，特别是腺病毒血清型2和5的基因组之间的相似性，无需多余的实验，可以确定其它腺病毒血清型，诸如腺病毒血清型2基因组的同一区域的核苷酸坐标(coordinate)。
在本发明方法的一个实施方案中，所述腺病毒载体可以包括缺失E1和E4区域每一区域的一种或多种复制必需基因功能的腺病毒基因组(即，所述腺病毒载体为E1/E4-缺陷型腺病毒载体)，优选地E4区域的整个编码区域已从所述腺病毒基因组上删除。换句话说，已经移除E4区域的所有开放阅读框(ORFS)。最优选地，通过删除全部E1区域和通过删除E4区域的部分区域而赋予所述腺病毒载体以复制缺陷型的性质。所述腺病毒载体的E4区域可以保留天然E4启动子、多聚腺苷化序列、和/或右端(right-side)反向末端重复(ITR)。
应该理解，所述腺病毒载体不同区域的缺失可以改变哺乳动物的免疫应答。特别地，不同区域的缺失可以减少由所述腺病毒载体产生的炎性反应。并且，所述腺病毒载体的外壳蛋白可以被修饰，以便降低腺病毒载体被针对野生型外壳蛋白的中和抗体识别的能力或无能力，如在国际专利申请WO 98/40509中所描述的那样。这样的修饰对于顽固眼睛疾病的长期治疗是有效的。
所述腺病毒载体，当为多复制缺陷型，特别是缺失E1和E4区域的复制必需基因功能时，可以包括间隔序列，以在互补细胞系中提供病毒生长，其生长与由单一复制缺陷型腺病毒载体，特别是E1-缺陷型腺病毒载体所获得的生长相似。在本发明优选的E4-缺陷型腺病毒载体中，其中保留L5尾丝区域，所述间隔区理想地位于L5尾丝区域和右端ITR之间。更加优选地，在这样的腺病毒载体中，E4多聚腺苷化序列单独地，或者最优选地，与另一序列组合，存在于L5尾丝区域和右端ITR之间，以便充分地分离所保留的L5尾丝区域和右侧ITR，以致这样的载体的病毒生产接近于单一复制缺陷型腺病毒载体，特别是单一复制缺陷E1缺陷型腺病毒载体的生产。
所述间隔区序列可以含有任何一种或多种需要的长度的核苷酸序列，诸如长度上至少约15个碱基对的序列(例如，约15个碱基对和约12,000个碱基对之间)，优选地约100个碱基对-约10,000个碱基对，更加优选地，约500个碱基对-约8,000个碱基对，甚至更加优选地，约1,500个碱基对-约6,000个碱基对，并且最优选地，约2,000个碱基对-约3,000个碱基对。关于所述腺病毒基因组，所述间隔区序列可以是编码或非编码的和天然的或非天然的，但是没有恢复所述缺陷区域的复制必需功能。所述间隔区还可以含有可用启动子表达盒。更加优选地，所述间隔区包括附加的多聚腺苷化序列和/或过客基因(passenger gene)。优选地，在间隔区被插入E4缺陷型区域的情形中，腺病毒基因组的E4多聚腺苷化序列和E4启动子或任何其它(细胞的或病毒的)启动子保留在载体中。所述间隔区位于E4多聚腺苷化位点和E4启动子之间，或者，如果载体中不存在E4启动子，所述间隔区最接近右端ITR。所述间隔区可以包括任何适当的多聚腺苷化序列。适当的多聚腺苷化序列的实例包括合成最优化的序列，BGH(牛生长素)，多瘤病毒，TK(胸苷激酶)，EBV(埃巴病毒)和乳头瘤病毒，其包括人乳头瘤病毒和BPV(牛乳头瘤病毒)。优选地，特别是在E4缺陷区域，所述间隔区包括SV40多聚腺苷化序列。SV40多聚腺苷化序列允许多复制缺陷型腺病毒载体的更高的病毒生产水平。在不存在间隔区时，与单一复制缺陷型腺病毒载体相比，所述多复制缺陷型腺病毒载体的尾丝蛋白的生产和/或病毒生长减少了。然而，在至少一个缺陷腺病毒区域，优选E4区域包括所述间隔区，可以抵消在尾丝蛋白生产和病毒生长中的这种减少。理想地，所述间隔区包括葡糖醛酸糖苷酶基因。间隔区在腺病毒载体中的应用，例如，在美国专利5,851,806和国际专利申请WO97/21826中进一步描述。
已经观察到，一种至少E4缺陷型的腺病毒载体在有限量的时间内在体内以高水平表达转基因，并且转基因在一种至少E4缺陷型的腺病毒载体中的持续表达可以通过反式作用因子的作用调整，所述反式作用因子诸如HSV ICPO，Ad pTP，CMV-IE2，CMV-IE86，HIV tat，HTLV-tax，HBV-X，AAV Rep 78，来自U205骨肉瘤细胞系作用类似HSV ICPO的细胞因子，或者在PC12细胞中由神经生长因子诱导的细胞因子，其中，例如，如在美国专利6,225,113，6,649,373和6,660,521，和国际专利申请公布WO00/34496中所描述的那样。考虑到上述内容，多缺陷型腺病毒载体(例如，至少E4-缺陷型腺病毒载体)或第二个表达载体可以包括编码反式作用因子的核酸序列，所述反式作用因子调节所述核酸序列表达的持续。当产生免疫耐受性时，抗原DNA的持续表达是理想的。
理想地，对于复制(即，增殖)，所述腺病毒载体需要，至多，互补腺病毒基因组E1，E2A和/或E4区域的复制必需基因功能。然而，可以将腺病毒基因组修饰，以中断一种或多种复制必需基因功能，如实践者想要的那样，只要所述腺病毒载体保持缺陷，并且可以应用，例如，互补细胞和/或编码所中断的复制必需基因功能的外源DNA(例如，辅助腺病毒)进行增殖。在这方面，所述腺病毒载体可以仅仅缺失腺病毒基因组早期区域的复制必需基因功能，仅仅缺失腺病毒基因组晚期区域的复制必需基因功能，和缺失腺病毒基因组的早期和晚期区域的复制必需基因功能。腺病毒载体也可以基本上使得整个腺病毒基因组被移除，在这种情形中，优选地，至少病毒反向末端重复(ITRs)和一种或多种启动子，或者病毒ITRs和包装信号保持完整无缺(即，腺病毒扩增子)。适当的复制缺陷型腺病毒载体，包括多复制缺陷型腺病毒载体，在美国专利5,837,511；5,851,806；5,994,106；6,127,175；和6,482,616；美国专利申请公布2001/0043922 A1，2002/0004040 A1，2002/0031831 A1，2002/0110545 A1，和2004/0161848 A1，和国际专利申请公布WO 94/28152，WO 95/02697，WO 95/16772，WO95/34671，WO 96/22378，WO 97/12986，WO 97/21826,和WO 03/022311中公开。
理想地，施用给哺乳动物的所述腺病毒载体是以腺病毒载体组合物，特别是药物组合物的形式存在，其实质上没有可复制的腺病毒(RCA)污染(例如，所述组合物包括少于约1％的RCA污染)。最理想地，所述组合物是没有RCA的。没有RCA的腺病毒载体组合物和原液在美国专利5,944,106和6,482,616，美国公布的专利申请2002/0110545 A1和国际专利申请WO 95/34671中描述。
例如，通过移除腺病毒基因组全部或部分的E1，E3和E4区域，由此获得的腺病毒载体能够接受外源核酸序列的插入片段，同时保留包装成腺病毒壳体的能力。所述核酸序列可以位于腺病毒基因组的E1区域，E3区域，或E4区域。实际上，所述核酸序列可以插入腺病毒基因组的任何地方，只要所述位置不防止所述核酸序列的表达或者干扰腺病毒载体的包装。
如果所述腺病毒载体不是复制缺陷型的，理想地，调节腺病毒载体，以将所述载体的复制限制在目标组织内。所述腺病毒载体可以是条件型复制腺病毒载体，其被设计成在由实践者预先确定的条件下复制。例如，复制必需基因功能，例如，由腺病毒早期区域编码的基因功能，可以可操作地连接到可诱导的、可抑制的或组织特异性转录控制序列上，例如，启动子上。在这一实施方案中，复制需要存在或不存在与转录控制序列相互作用的特殊因子。在自体免疫疾病的治疗中，可以有利地控制腺病毒载体在，例如，淋巴结中复制，以获得持续的抗原产生并且控制免疫细胞产生。条件型复制腺病毒载体在美国专利5,998,205中进一步描述。
除了修饰(例如，缺失，突变或置换)编码复制必需的基因功能的腺病毒序列，所述腺病毒基因组可以含有良性或非致死性修饰，即，即使这样的修饰在另外包含复制必需的基因功能的腺病毒基因组区域内，所述修饰也不赋予所述腺病毒复制缺陷，或者，理想地，没有不利地影响病毒机能和/或病毒蛋白的生产。这样的修饰通常由DNA处理产生，或者适合辅助表达载体构建。例如，可以有利地在腺病毒基因组中移除或引入限制性酶切位点。这样的良性突变通常不具有关于病毒机能的可检测到的副作用。例如，所述腺病毒载体可以包括核苷酸10,594和10,595的缺失(基于腺病毒血清型5基因组)，其与VA-RNA-1转录相关，但是其缺失没有妨碍VA-RNA-1的生产。
类似地，可以调节腺病毒载体的外壳蛋白，以改变腺病毒对于潜在宿主细胞上的病毒受体的结合特性或识别。对于腺病毒，这样的处理可以包括缺失尾丝区、五邻体或六邻体区域，将各种天然的或非天然的配体插入到外壳蛋白部分，等等。外壳蛋白的处理可以扩大受腺病毒载体感染的细胞范围，或者能够使得腺病毒载体靶向特定的细胞型。
例如，在一个实施方案中，所述腺病毒载体包括嵌合外壳蛋白(例如，尾丝蛋白，六邻体pIX，pIIIa，或五邻体蛋白)，其通过优选地在或者接近羧基端引入非天然的氨基酸序列而与野生型(即，天然的)外壳蛋白不同。优选地，将所述非天然的氨基酸序列插入到或者置换内在外壳蛋白序列。本领域的一名普通技术人员应该理解，所述非天然氨基酸序列可以插入到内在外壳蛋白序列之内，或者在内在外壳蛋白序列末端。由此获得的嵌合病毒外壳蛋白能够指导包括所述外壳蛋白的腺病毒载体进入细胞，其比除了包括野生型腺病毒外壳蛋白而不是嵌合腺病毒外壳蛋白之外相同的载体进入细胞更加有效率。优选地，所述嵌合腺病毒外壳蛋白结合在细胞表面存在的新的内源结合位点，所述位点不被，或者很难被包括野生型外壳蛋白的载体识别。这种增加的进入效率的一个直接的效果是，所述腺病毒可以结合并且进入包括野生型外壳蛋白的腺病毒典型地不能进入或者只能以低效率进入的许多细胞类型。
在本发明的另一个实施方案中，所述腺病毒载体包括不选择具体类型的真核细胞的嵌合病毒外壳蛋白。所述嵌合外壳蛋白通过将非天然氨基酸序列插入到或者置换内在外壳蛋白序列而与野生型外壳蛋白不同。在这一实施方案中，所述嵌合腺病毒外壳蛋白有效地结合比野生型腺病毒外壳更宽范围的真核细胞，诸如在国际专利申请WO 97/20051中所描述的那样。
腺病毒与所给细胞的结合特性也可以通过应用包括短杆状(short-shafted)腺病毒尾丝基因的腺病毒进行调节，如在美国专利5,962,311中所讨论的那样。应用包括短杆状腺病毒尾丝基因的腺病毒减少腺病毒尾丝结合于其细胞表面受体的水平或效率，并且增加结合于其细胞表面受体的腺病毒五邻体基底(penton base)，由此增加所述腺病毒对所给细胞的结合特性。备选地，应用包括短杆状尾丝的腺病毒能够通过将非天然的氨基酸序列引入到五邻体基底或尾丝节(fiber knob)使得所述腺病毒靶向需要的细胞表面受体。
在另一实施方案中，编码与天然底物结合相关的氨基酸残基的核酸残基可以被改变，补加或缺失(参见，例如，国际专利申请公布WO 00/15823；Einfeld等.，J.Virol.，75(23)，11284-11291(2001)；和van Beusechem等.，J.Virol.，76(6)，2753-2762(2002))，以致结合突变核酸残基(或者具有由此编码的尾丝蛋白)的所述腺病毒载体更不能与其天然底物结合。例如，血清型5或血清型2腺病毒载体的天然CAR和整联蛋白结合位点，诸如腺病毒尾丝蛋白的结(knob)结构域和位于腺病毒五邻体基底的Arg-Gly-Asp(RGD)序列，分别可以被移除或分解。调控或辅助结和CAR之间的相互作用的尾丝蛋白的任何适当的氨基酸残基可以被突变或移除，只要所述尾丝蛋白能够三聚体化。类似地，可以将氨基酸添加到尾丝结上，只要所述尾丝蛋白保留三聚体化的能力。适当的残基包括尾丝蛋白暴露的环内的氨基酸，诸如，例如，血清型5尾丝结结构域的AB环，DE环，和FG环，其在，例如，Roelvink等.，Science，286，1568-1571(1999)，和美国专利6,455,314中进一步描述。调控或辅助五邻体基底和整联蛋白之间的相互作用的五邻体基底蛋白的任何适当的氨基酸残基可以被突变或移除。适当的残基包括，例如，位于Ad5五邻体基底蛋白高变区的5种RGD氨基酸序列基序的一种或多种(例如，如美国专利5,731,190所描述的那样)。通过修饰编码天然RGD基序的核酸序列，以致天然RGD氨基酸序列在构象上难以接近结合αv整联蛋白受体，诸如通过将DNA序列插入到或接近编码腺病毒五邻体基底蛋白的核酸序列，也可以破坏在五邻体基底蛋白上的天然整联蛋白结合位点。优选地，所述腺病毒载体包括分别不与CAR和整联蛋白结合的尾丝蛋白和五邻体基底蛋白。备选地，所述腺病毒载体包括分别结合CAR和整联蛋白的尾丝蛋白和五邻体基底蛋白，但是所述蛋白比相应的野生型外壳蛋白具有更小的亲和力。如果修饰的腺病毒尾丝蛋白和五邻体基底蛋白分别结合CAR和整联蛋白，那么所述腺病毒载体表现出减少的与CAR和整联蛋白的结合，以比同一血清型未修饰的腺病毒尾丝蛋白和五邻体底基蛋白少于至少约5倍，10倍，20倍，30倍，50倍或100倍的亲和力结合。
尽管优选，但是不必消除腺病毒与宿主细胞的天然结合。在一些实例中，诸如应用腺病毒载体将抗原编码序列运送到宿主细胞，广泛的腺病毒宿主范围可能是有利的。
腺病毒载体还可以包括嵌合外壳蛋白，所述嵌合外壳蛋白包含结合底物的非天然氨基酸序列(即，配体)。所述嵌合腺病毒外壳蛋白的非天然氨基酸序列，允许包括所述嵌合外壳蛋白的腺病毒载体结合，并且理想地，感染不会被没有非天然氨基酸序列的相应的腺病毒天然感染的宿主细胞(即，不被相应的野生型腺病毒感染的宿主细胞)，以比没有所述非天然氨基酸序列的相应的腺病毒更大的亲和力结合于受相应的腺病毒天然感染的宿主细胞，或者以比非靶点细胞更大的亲和力结合于具体的靶点细胞。“非天然”氨基酸序列可以包括在腺病毒外壳蛋白中不是天然存在的氨基酸序列，或者在腺病毒外壳中发现但是位于壳体内的非天然位置的氨基酸序列。“优先结合”意为非天然氨基酸序列结合受体，诸如，例如，αvβ3整联蛋白，其以比非天然配体结合不同的受体，诸如，例如，αvβ1整联蛋白至少约3倍更大的亲和力(例如，至少约5倍，10倍，15倍，20倍，25倍，35倍，45倍或50倍更大的亲和力)结合。
所述非天然氨基酸序列可以缀合到任何腺病毒外壳蛋白，以形成嵌合外壳蛋白。因此，例如，所述非天然氨基酸序列可以缀合，插入，或者附着到尾丝蛋白，五邻体基底蛋白，六邻体蛋白，蛋白IX，VI或IIIa等。这样的蛋白的序列，以及在重组蛋白中应用其的方法在本领域内是公知的(参见，例如，美国专利5,543,328；5,559,099；5,712,136；5,731，190；5,756,086；5,770,442；5,846,782；5,962,311；5,965,541；5,846,782；6,057,155；6,127,525；6,153,435；6,329,190；6,455,314；6,465,253；和6,576,456；美国专利申请公布2001/0047081和2003/0099619；和国际专利申请WO 96/07734，WO 96/26281，WO 97/20051，WO 98/07877，WO 98/07865，WO 98/40509，WO 98/54346，WO 00/15823，WO 01/58940和WO 01/92549)。所述嵌合外壳蛋白的外壳蛋白部分可以是附加配体结构域的全长腺病毒外壳蛋白，或者其可以被剪截，例如，在内部或者在C-和/或N-端剪截。对于腺病毒载体，所述外壳蛋白部分本身不必是天然的。例如，外壳蛋白可以是结合到腺病毒血清型5载体的腺病毒血清型4(Ad4)尾丝蛋白，其中优选地消除Ad4尾丝的天然CAR结合基序。然而，修饰后(包括非天然氨基酸的存在)，所述嵌合外壳蛋白优选地能够如其天然负体外壳蛋白一样结合到腺病毒壳体。一旦确定所给出的非天然氨基酸序列，它可以结合到能够与底物相互作用的病毒的任何位置(即，病毒表面)。例如，所述配体可以结合到尾丝，五邻体基底，六邻体，蛋白IX，VI或IIIa，或其它适当的位置。在所述配体附着到尾丝蛋白的情形，优选地它不妨碍病毒蛋白或者尾丝单体之间的相互作用。因此，所述非天然氨基酸优选地本身不是寡聚化结构域，原因在于这样可能与腺病毒尾丝的三聚体化结构域不利地相互作用。优选地，所述配体被添加到病毒体蛋白上，并且其以这样的方式结合，以便易于暴露于底物(例如，在蛋白的N-或C-端，附着到面向底物的残基，位于肽间隔区上，以与底物接触，等等)，从而最大化地将非天然氨基酸序列展现给底物。理想地，所述非天然氨基酸序列在尾丝蛋白C-端结合到腺病毒尾丝蛋白上(并且通过间隔区附着)，或者结合尾丝的暴露的环(例如，HI环)，以产生嵌合外壳蛋白。在所述非天然氨基酸序列附着到或者置换五邻体基底片段的情形，优选地，它在高变区之内以确保它与底物接触。在所述非天然氨基酸序列附着到六邻体的情形，优选地它在高变区之内(Miksza等.，J.Virol.，70(3)，1836-44(1996))。由于所述非天然氨基酸序列可以更加可用于结合受体，并且降低了非天然氨基酸序列和腺病毒尾丝单体之间的任何空间相互作用，所以应用将非天然氨基酸序列从腺病毒颗粒表面延伸的间隔区序列是有利的。
所述非天然氨基酸序列可以结合在狭窄种类的细胞类型(例如，肿瘤细胞，心肌，骨骼肌，平滑肌，等等)或者包括一些细胞类型的更宽的组上存在的特别细胞受体。在其它实施方案中(例如，在特别加工的细胞类型中帮助纯化或增殖)，除了细胞表面蛋白，非天然氨基酸(例如，配体)可以结合化合物。因此，所述配体可以结合血源性和/或淋巴源性蛋白(例如，白蛋白)，合成的肽序列，诸如多聚氨基酸(例如多聚赖氨酸，多聚组氨酸，等等)，人工肽序列(例如，FLAG)，和RGD肽片段(Pasqualini等.，J.Cell.Biol.，130，1189(1995))。
适当的非天然氨基酸序列及其底物的实例包括，但不限于，整联蛋白识别的氨基酸的短的(例如，6个氨基酸或者更少)线性片段，以及多聚氨基酸序列，诸如多聚赖氨酸，多聚精氨酸，等等。插入多个赖氨酸和/或精氨酸提供对肝素和DNA的识别。用于产生嵌合腺病毒外壳蛋白的适当的非天然氨基酸序列在美国专利6,455,314和国际专利申请WO01/92549中进一步描述。
优选地，所述腺病毒外壳蛋白包括结合αvβ3，αvβ5或αvβ6整联蛋白的非天然氨基酸序列。显示对αvβ3整联蛋白特异性配体，诸如RGD基序的腺病毒载体，与没有表达所述整联蛋白到这样的程度的细胞相比较，其感染在细胞表面具有更多数目的αvβ3整联蛋白部分的细胞，由此将所述载体靶向目的特异性细胞。
在本发明的另一个实施方案中，所述腺病毒载体可以包括嵌合尾丝蛋白，其包括包含RGD基序的氨基酸序列(例如，非天然氨基酸序列)，所述基序包括，但不限于，CRGDC(SEQ ID NO1)，CXCRGDCXC(SEQ IDNO2)，其中X代表任何氨基酸，以及CDCRGDCFC(SEQ ID NO3)。RGD基序可以插入腺病毒尾丝结区域，优选地插入腺病毒结的暴露的环，诸如HI环。RGD氨基酸序列可以置换HI环的区域，或者可以插入到HI环中而并不移除天然氨基酸。RGD基序还可以附加到腺病毒尾丝蛋白的C端，任选地通过间隔区序列附加。所述间隔区序列优选地包括1-200个氨基酸，并且可以(但不需要)具有想要的功能。在一个实施方案中，所述嵌合的尾丝蛋白识别柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)。理想地，尾丝蛋白的天然CAR结合不受尾丝蛋白的突变或修饰的影响。另外，所述腺病毒载体可以包括腺病毒外壳，其中五邻体基底蛋白保留其结合整联蛋白的能力。然而，如本文所讨论的，如果需要，可以消除通过腺病毒外壳蛋白五邻体基底蛋白的天然结合。在另一个实施方案中，RGD基序优选地侧接一组或两组半胱氨酸残基。
腺病毒载体可以包括不选择具体类型的真核细胞的嵌合病毒外壳蛋白。所述嵌合外壳蛋白与野生型外壳蛋白不同，其通过将非天然氨基酸序列插入或者置换内在外壳蛋白序列，或者将非天然氨基酸序列附着到外壳蛋白的N或C端而实现所述不同。例如，将包括大约5个-大约9个赖氨酸残基(优选地7个赖氨酸残基)的配体通过非编码间隔区序列附着到腺病毒尾丝蛋白的C端。在这一实施方案中，所述嵌合病毒外壳蛋白与野生型病毒外壳相比有效地结合更宽范围的真核细胞，诸如在国际专利申请WO 97/20051中所描述的那样。
当然，可以调节腺病毒载体识别潜在的宿主细胞的能力，无需外壳蛋白的遗传处理。例如，将腺病毒与包括结合五邻体基底结构域和选择性地结合具体的细胞表面结合位点的结构域的双特异性分子复合，能够使得本领域的普通技术人员将所述载体靶向具体的细胞类型。
复制缺陷型腺病毒载体典型地在这样的互补细胞系中产生，即，为了产生高滴度的病毒载体储备物，所述细胞系以适当的水平提供复制缺陷型腺病毒载体中不存在的，但是为病毒增殖所需要的基因功能。理想地，所述互补细胞系包括，结合到细胞基因组，编码腺病毒增殖所需要的基因功能的腺病毒核酸序列。优选的细胞系与在复制缺陷型腺病毒中不存在的至少一种并且优选地全部复制必需的基因功能互补。所述互补细胞系可以互补于由早期区域，晚期区域，病毒包装区域，病毒相关RNA区域，或者其组合编码的至少一种复制必需的基因功能的缺陷，包括所有的腺病毒功能(例如，以使得腺病毒扩增子能够增殖)。最优选地，所述互补细胞系互补于腺病毒基因组E1区域的至少一种复制必需的基因功能(例如，两种或多种复制必需的基因功能)的缺陷，特别地互补于E1A和E1B区域每一个的复制必需的基因功能的缺陷。另外，所述互补细胞系可以互补于腺病毒基因组E2(特别地当涉及到腺病毒DNA聚合酶和末端蛋白时)和/或E4区域的至少一种复制必需的基因功能的缺陷。理想地，互补于E4区域缺陷的细胞包括E4-ORF6基因序列并且产生E4-ORF6蛋白。这样的细胞理想地包括至少ORF6并且没有腺病毒基因组E4区域的其它ORF。优选地，所述细胞系进一步特征在于，它以非重叠的方式包含与腺病毒载体互补的基因，其最小化，并且实际上消除载体基因组与细胞DNA重组的可能性。因此，如果不在载体储备物中避免的话，可复制腺病毒(RCA)的存在将被减到最少，因此，其适用于特定的治疗目的，特别是接种目的。在载体储备物中缺少RCA避免了所述腺病毒载体在非互补细胞中的复制。这样的互补细胞系的构建包括标准的分子生物学和细胞培养技术，诸如由Sambrook等(如前所述)和Ausubel等(如前所述)所描述的那些。
用于产生腺病毒载体的互补细胞系包括，但不限于，293细胞(例如，在Graham等.，J.Gen.Virol.，36，59-72(1977)中所述)，PER.C6细胞(例如，在国际专利申请公布WO 97/00326，和美国专利5,994,128和6,033,908中所述)，和293-ORF6细胞(例如，在国际专利申请公布WO 95/34671和Brough等.，J.Virol.，71，9206-9213(1997)中所述)。例如，在美国专利6,677,156和6,682,929，和国际专利申请公布WO 03/20879中描述了其它的互补细胞。在一些实例中，细胞基因组不需要包括这样的核酸序列，即，其基因产物互补于复制缺陷型腺病毒载体的全部缺陷。复制缺陷型腺病毒载体中缺乏的一种或多种复制必需的基因功能可以由辅助病毒提供，例如，以反式提供对于需要的腺病毒载体复制所需要的一种或多种必需的基因功能的腺病毒载体。通常将辅助病毒加工以防止感染性的辅助病毒的包装。例如，腺病毒基因组E1区域的一种或多种复制必需的基因功能由互补细胞提供，然而，腺病毒基因组E4区域的一种或多种复制必需的基因功能由辅助病毒提供。
在美国专利5,543,328；5,559,099；5,712,136；5,731,190；5,756,086；5,770,442；5,846,782；5,871,727；5,885,808；5,922,315；5,962,311；5,965,541；6,057,155；6,127,525；6,153,435；6,329,190；6,455,314；6,465,253；6,576,456；6,649,407；6,740,525，和国际专利申请WO 95/02697，WO 95/16772，WO95/34671，WO 96/07734，WO 96/22378，WO 96/26281，WO 97/20051，WO98/07865，WO 98/07877，WO 98/40509，WO 98/54346，WO 00/15823，WO01/58940和WO 01/92549中描述了对腺病毒载体的适当的修饰。类似地，应该理解，许多腺病毒载体可以商购。在本领域，腺病毒载体的构建被充分理解。应用本领域已知的方法(例如，应用互补细胞系，诸如293细胞系，Per.C6细胞系，或293-ORF6细胞系)和例如，在美国专利5,965,358；5,994,128；6,033,908；6,168,941；6,329,200；6,383,795；6,440,728；6,447,995；和6,475,757；美国专利申请公布2002/0034735 A1，和国际专利申请WO98/53087，WO 98/56937，WO 99/15686，WO 99/54441，WO 00/12765，WO01/77304和WO 02/29388中，以及本文所确定的其它参考文献中提出的方法，可以构建和/或纯化腺病毒载体。
下述实施例进一步举例说明本发明，但是，当然，不应该以任何方式将其解释为限制其范围。
实施例1本实施例证明生产包括4种腺病毒载体的组合物，其中每种腺病毒载体编码不同的HIV抗原。
应用快速载体构建系统(AdFASTTM，GenVec，Inc.)构建腺病毒载体。AdFASTTM用来产生4种腺病毒载体，其中每种载体表达4种HIV抗原的一种gp140(分化体A)，gp140(分化体B)dv12，gp140(分化体C)，和GagPol(分化体B)。抗原的表达由巨细胞病毒(CMV)即时早期启动子驱动。选择GV11腺病毒骨架来减少在临床生产期间产生可复制腺病毒(RCA)的风险。GV11骨架含有必需的E1和E4区域的缺失，以及部分E3缺失，所述缺失赋予腺病毒载体复制缺陷。
AdtGagPol(B).11D质粒应用从HIV-1分化体B产生的Gap和Pol蛋白的序列，产生Gag/Pol基因的合成的多蛋白编码译本，其应用在人体细胞中表达最优化的密码子。所述合成的Gag基因(GenBank登记号K03455)来自HIV-1分化体B毒株HXB2，和合成的Pol基因(Pol/h)(GenBank登记号M19921)来自HIV-1分化体B NL4-3。Pol基因是没有功能的，原因在于它以融合蛋白形式存在，所述融合蛋白包括逆转录酶，蛋白酶和整合酶蛋白。在编码所述质粒的蛋白酶和逆转录酶基因的核酸序列中引入点突变。蛋白酶修饰防止对Pol基因产物的加工处理，并且减少了功能性蛋白酶、逆转录酶和整合酶酶促活性的潜能。没有对Gap蛋白进行任何修饰。应用标准重组DNA技术，将编码Gag/Pol融合多蛋白的核酸序列亚克隆到E1-穿梭质粒中的表达盒中，以用于插入腺病毒载体。
Adgp140(A).11D质粒应用来自HIV-1分化体A毒株92rw020的包膜多蛋白(gp160)的蛋白序列(嗜CCR5，GenBank登记号U08794)，产生HIV-1分化体A基因gp140delCFI的合成译本，其应用为了在人体细胞中表达而改变的密码子。在这点上，表达HIV-1基因的质粒用设计成破坏病毒RNA结构的序列合成制备，所述序列通过应用典型地在人体细胞中发现的密码子限制蛋白表达。应用标准重组DNA技术，将编码分化体A gp140delCFI基因的核酸序列亚克隆到E1-穿梭质粒中的表达盒中，以用于插入腺病毒载体。
Adtgp140dv12(B).11D质粒应用来自HIV-1分化体B毒株HXB2的包膜多蛋白(gp160)的蛋白序列(嗜X4，GenBank登记号K03455)，产生HIV-1分化体B基因X4gp160/h的合成译本，其应用在人体细胞中表达最优化的密码子。为了产生包膜蛋白R5gp160/h的嗜CCR5译本，将编码来自HIV-1毒株X4gp160/h的HIV-1包膜多蛋白氨基酸275-361的区域用来自HIV-1 BaL毒株的相应的区域(GenBank登记号M68893)置换。将来自pR5gp160/h的包膜蛋白基因的全长嗜CCR5译本在第680个氨基酸密码子后终止。所述截短的Env糖蛋白(gp140)含有完整的表面蛋白和包括融合结构域在内的gp41的胞外结构域，和对于形成低聚体，特别是两个螺旋状卷曲螺旋基序重要的区域。缺失Env V1和V2环，以提高所述载体在生产细胞系中的稳定性和产量。由于限制性酶切位点的产生，在缺失后，立即结合2个附加的氨基酸。应用标准重组DNA技术，将编码gp140dv12基因的核酸序列亚克隆到E1-穿梭质粒中的表达盒中，以用于插入腺病毒载体。
Adgp140(C).11D质粒应用来自HIV-1毒株97ZA012包膜多蛋白gp140delCFI的蛋白序列(嗜CCR5，GenBank登记号AF286227)，产生HIV-1分化体C基因gp140delCFI的合成译本，其应用在人体细胞中表达最优化的密码子。应用标准重组DNA技术，将编码合成的gp140delCFI基因的核酸序列亚克隆到E1-穿梭质粒中的表达盒中，以用于插入腺病毒载体。
腺病毒载体在大肠杆菌(E.coli)BjDE3细菌中，将4种E1-穿梭质粒，AdtGagPol(B).11D，Adgp140(A).11D，Adtgp140dv12(B).11D，和Adgp140(C).11D，与基于GV11腺载体的AdFASTTM质粒pAdE1(BN)E3(10)E4(TIS1)重组，以产生所述腺病毒载体质粒。然后，通过将所述腺病毒载体质粒引入包装细胞系，293-ORF6中，产生复制缺陷型腺病毒载体AdtGagPol(B).11D，Adgp140(A).11D，Adtgp140dv12(B).11D，和Adgp140(C).11D。
腺病毒载体组合物将4种腺病毒载体构建体纯化并且透析到在Bio Whittaker(Frederick，MD)定制加工的最终配制缓冲液(FFB；10mM Tris pH7.8，75mM NaCl，5％海藻糖，25ppm聚山梨酸酯80，1mM MgCl2)中。所述腺病毒载体组合物，称为VRC-HIVADV014-00-VP，制备于4种腺病毒载体的每一个，分别地，AdtGagPol(B).11D，Adgp140(A).11D，Adtgp140dv12(B).11D，Adgp140(C).11D以3∶1∶1∶1重量比的混合物。
实施例2本实施例例证施用给哺乳动物的腺病毒载体组合物的生物分布。
应用由针头和注射器运送的肌内注射，在新西兰白兔(New ZealandWhite rabbits)上进行单一剂量的生物分布研究，以评估腺病毒载体组合物VRC-HIVADV014-00-VP的分布。将所述载体组合物以单一剂量施用给兔(0.95×1011pu)，并且在施用载体后第9，61和91天检测组织中腺病毒载体的存在。
应用GLP验证的TaqmanTM聚合酶链式反应(PCR)，检测组织中腺病毒载体的存在，所述PCR反应被研发并且能够在VRC-HIVADV014-00-VP的4种不同的腺病毒载体的每一种中检测具体的目标序列。所述测定法从每种腺病毒载体中检测扩增子。5′-PCR引物，3′-PCR引物，和荧光标记的探针跨越包含插入体，多聚接头和启动子的区域。对于这种测定法，检测的下限是10个拷贝的VRC-HIVADV014-00-VP DNA，并且对于这种测定法，定量的下限是50个拷贝的VRC-HIVADV014-00-VP DNA。
来自3个时间点的PCR数据表明，在施用后第9和61天，在注射位点(皮下组织和肌肉)和肝脏，以及在所有的时间点在脾脏中，存在VRC-HIVADV014-00-VP DNA。对于具有阳性发现的组织在研究天数(SD)第9天和SD 61之间，对于肝脏和注射位点在SD 61和SD 91之间，拷贝数目和阳性组织数目相当可观地下降。没有观察到毒性或总体损伤的临床迹象。
实施例3本实施例例证施用给哺乳动物的腺病毒载体组合物的免疫原性。
将腺病毒载体组合物VRC-HIVADV014-00-VP以单一剂量(1×1011pu)施用给小鼠，和以两倍剂量施用给兔。在小鼠施用后4周，和兔施用后36天，分析组织的免疫原性。
通过干扰素γ(IFN-γ)ELISPOT测定和基于流式细胞术的细胞内细胞因子染色(ICS)测定，检测细胞免疫应答。IFN-γ ELISPOT定量地测定由免疫的动物外周血单核细胞(PBMC)产生的IFN-γ。将所述细胞在体外暴露于HIV-1抗原(即，跨越在腺病毒载体中表达的蛋白长度的一系列短的、重叠的肽)。由抗原激活的T淋巴细胞产生的IFN-γ分子结合于包被检测平板的抗体，并且可以通过应用碱性磷酸酶缀合的读取系统作为斑点形成细胞(SFC)进行比色计数。类似地，ICS测定法应用基于流式细胞术的系统来测定由抗原激活的细胞所产生的IFN-γ(有时和附加的细胞因子)。在这一系统中，激活的细胞进一步的特征在于表型淋巴细胞标记，其允许应答于疫苗抗原的细胞类型(例如，CD4+或CD8+T-淋巴细胞)的精确定量。应用ELISA测定法或修饰的测定法测定体液免疫应答，在所述测定法中，应用凝集素捕获系统，将腺病毒载体表达的抗原结合于检测平板上。
用VRC-HIVADV014-00-VP免疫在小鼠中激发了体液和细胞免疫应答，并且在兔中激发了体液免疫应答。
实施例4本实施例例证施用给哺乳动物的腺病毒载体组合物的生物分布。
雄性和雌性新西兰白兔，约15周龄，分成两个处理组。组1由每种性别的3只组成，组2由每种性别的15只组成，总共36只兔。在研究日(″SD″)第1天，应用针头和注射器，组1的动物接受最终配制缓冲液(FFB)的一次肌内注射(右大腿肌肉)(0.5mL/动物)。组2的动物接受1.0×1011pu剂量的VRC-HIVADV0 14-00-VP的一次肌内注射(右大腿肌肉)。
对动物至少每天观察两次，观察濒死率和死亡率以及毒性临床迹象(笼边(cageside))。在笼边观察的场所，当称重动物时进行详细的检查(预先处理，此后每周一次，在尸体剖检时)。评估的临床迹象包括，但是不限于，皮肤和毛皮特征，眼睛和黏膜，呼吸，循环，自主的和中枢的神经系统，以及身体运动(somatomotor)和行为模式。
在研究日第9，61和91天，将来自测试组(组2)的每种性别的5只动物，和来自赋形剂对照组(组1)的每种性别的1只动物处死。在麻醉前，通过穿刺中耳廓动脉收集0.6mL血到无菌的乙二胺四乙酸(EDTA)管中。将每只动物通过注射戊巴比妥钠施以安乐死并放血。从每只动物收集下述器官，每种收集的器官应用一套洁净的器具血，性腺，心，肺，肝，肾，淋巴结，脾，胸腺，皮下组织和大腿肌肉(在注射位点)，骨髓(来自注射侧的腿骨)和脑。将所述组织立即放入无菌小瓶中，在液氮中骤然冷冻，并且保存在-75±10℃。
在每种组织样品中，应用腺病毒载体特异性PCR测定法(TaqmanTM聚合酶链式反应)来检测4种腺病毒载体的存在。本测定法检测的下限为10拷贝靶目标/μg DNA，定量的下限为50拷贝靶目标/μg DNA。将超出检测下限但低于定量下限的样品称为不可定量的(NQ)。对在研究日第9，61和91天收集的样品进行PCR评估。显示阳性生物分布结果的组织概述在表1中列出。
没有观察到在死亡率，毒性临床迹象，体重，或者体重变化中的与处理相关的变化。在接受VRC-HIVADV014-00-VP的雄性组中，食物消耗在注射后24小时期间减少了，但是在这段时间后恢复正常。
表1
本实施例的结果证明，包括多腺病毒载体的所述组合物转导各种组织，同时表现出最小的毒性。
实施例5本实施例例证施用给哺乳动物的腺病毒组合物的免疫原性。
将两组雌性BALB/c小鼠用在生理盐水中稀释的空腺病毒载体或VRC-HIVADV014-00-VP腺病毒载体组合物免疫。具体地，5只小鼠接受1×1010pu/动物的空腺病毒载体的肌内注射，和10只小鼠接受1×1010pu/动物的VRC-HIVADV014-00-VP的肌内注射。每只小鼠注射的总体积为200μL。注射后10天，对小鼠进行采血，并且收集血清并在4℃保存直到检测。将脾脏无菌地移除，温和地匀浆成为单细胞混悬液，洗涤，并且重悬成106个细胞/mL的终浓度。
将96孔ELISA平板用100μL/孔的凝集素-Galanthaus Nivalis(Sigma)包被，并且在4℃温育过夜。移除凝集素，并且将每个孔用200μL含有10％胎牛血清(FBS)的PBS在室温封闭2小时。将所述平板用含有0.2％吐温-20的PBS(PBS-T)洗涤两次，并且将来自293细胞的50μL 1∶4稀释的蛋白上层清液(～1μg/mL)添加到每个孔中。所述上层清液从转染了作为腺病毒载体构建体的表达相同的HIV-1分化体A，B和C包膜抗原的DNA质粒的293细胞制备。来自转染了空p2000载体的293细胞提取物的总蛋白用作阴性对照。
将所述平板在室温温育1小时，并且用PBS-T洗涤4次。将50μL对照血清(来自用对照质粒p2000免疫的小鼠)或者来自测试质粒接种的小鼠的血清以4倍系列稀释物形式添加到每个孔中，从1∶100稀释开始。将平板在室温温育1小时，洗涤，并且将50μL辣根过氧化物酶缀合的山羊抗鼠IgG添加到每个孔中。将平板在室温温育1小时，洗涤，并且将50μL底物(Fast邻苯二胺二氢氯化物，Sigma)添加到每个孔中。然后，将平板在室温温育30分钟。通过添加50μL 1(N)H2SO4终止反应，并且在450nm读取光学密度。
将收集的脾细胞(106个细胞/肽库)刺激6小时。刺激的最后5小时在10μg/mL布雷菲德菌素A(Sigma)和具有同腺病毒载体表达的那些肽相同的氨基酸序列的肽库存在下发生。应用的所有的肽为15-mers，由跨越所检测的基因全部序列的11个氨基酸重叠。将细胞进行透化处理，固定并用单克隆抗体(大鼠抗小鼠细胞表面抗原CD3，CD4和CD8(Pharmingen))染色，接着进行多参量流式细胞术以在CD4+或CD8+T-细胞群中检测IFN-γ和TNF-α阳性细胞。应用Prism 3.0软件(San Diego，CA)，通过Mann-Whitney检测，在对照质粒接种和检测物接种的小鼠之间所观察到的CD4+和CD8+应答中进行统计学分析。
接种小鼠中的HIV-1特异性细胞免疫应答通过细胞内流式细胞术证明。假定大于0.1％细胞因子生产细胞的频率代表阳性结果，那么在3/10(Gag)，7/10(Pol)，8/10(Env-A)，10/10(Env-B)和9/10(Env-C)小鼠中观察到CD4+应答。在9/10(Gag)，10/10(Pol)，6/10(Env-A)，6/10(Env-B)，和7/10(Env-C)小鼠中观察到CD8+应答。在用VRC-HIVADV014-00-VP免疫后，所有的小鼠具有可证明的针对HIV-1蛋白的抗体滴度(通过ELISA测定)。
这些结果证明所述腺病毒载体组合物在小鼠中激发了免疫应答。
实施例6本实施例例证施用给哺乳动物的腺病毒载体组合物的免疫原性。
通过针头和注射器将VRC-HIVADV014-00-VP(1×1011pu)肌肉内施用给20只兔的一组(组2)，并且大小相同的安慰剂组用作对照(组1)。给第三组兔(组3)施用引发组合物(VRC-HIVDNA009-00-VP)(4mg)，所述引发组合物包括6种质粒，每种分别编码分化体B Gag，分化体B Pol，分化体B nef，和来自分化体A、B和C的Env gp145。分化体B Pol质粒还编码包括逆转录酶，蛋白酶和整合酶蛋白的融合蛋白。在所述质粒的编码蛋白酶和逆转录酶基因的核酸序列中引入点突变，其使得逆转录酶，蛋白酶，和整合酶蛋白没有功能。在施用引发组合物后，给组3的兔子施用一剂量的VRC-HIVADV014-00-VP(1×1011pu)。将组3动物于大小相同的安慰剂组(组4)进行比较。
免疫后，通过ELISA测定法评估体液免疫应答。具体地，将在全国健康研究所疫苗研究中心(Vaccine Research Center，National Institutes ofHealth(Bethesda，MD))(VRC)生产的质粒(即，质粒号5304，2801和5308)，其分别编码HIV-EnvA、B和C，在293细胞中表达，并且纯化主要的蛋白产物。将最优化浓度的重组抗原在微量滴定板上包被，并且在4℃放置过夜。洗涤微量滴定板，并且用20％FBS/1％BSA缓冲的溶液封闭和温育。对兔血清的两个孔的连续稀释物进行温育，接着加入生物素标记的山羊和兔，链霉抗生物素蛋白-HRPO和TMB底物。终止显色，并且在30分钟内将平板在450nm读数，所报告的结果基于两个孔的平均值。
来自组1兔的全部血清样品，和对于组2的预先采血，全部都表现出低的处于自然状态的光学密度(OD)，在1∶100和1∶1000稀释时，具有0.159±0.105的平均OD±标准偏差(n＝480)。来自组2兔的全部样品在施用后第24天在1∶1000的血清稀释物表现出抗体产生的迹象。具体地，对于所有抗原的处于自然状态的光学密度大于0.21，平均OD±标准偏差为2.71±1.07(n＝160)。组2中所有的兔子都表现出对于HIV-ENV-A，ENV-B，ENV-C和GAG可检测的抗体浓度。
来自组3的兔子的全部样品，和组4动物的预先采血，都表现出低的处于自然状态光学密度(OD)，平均预接种OD±标准偏差为0.099±0.065(组3，n＝160个样品)，和0.129±0.138(组4，n＝160个样品)。另外，对于组4的兔子接种后的所有抗原，存在非常高的OD值。尽管组4中的一些兔子表现出更高的预接种OD值，在第108天观察到升高的OD值(OD＝3.529±0.812)，其为诱导的免疫应答的指示。
本实施例证明本发明方法在哺乳动物中诱导针对HIV的免疫应答的能力。
实施例7本实施例例证单独或者作为DNA致敏/腺病毒增强方案的一部分施用的腺病毒载体组合物在哺乳动物中的免疫原性。
将杂交繁殖的成年恒河猴(Macaca mulatta)肌内注射编码SIVmac239Gag/Pol和HIV-1 Env蛋白(单一的或多分化体)(1×1012pu或3.3×1011pu)(VRC/NIH，Bethesda，MD)的腺病毒载体，其为单独地，或者与研究级的SIVmac239 Gag/Pol-nef质粒和单一的或多分化体HIV-1Env质粒(VRC/NIH，Bethesda，MD)的混合物组合。在每种情形中，将疫苗物质在无菌盐水中混合到一起，并且应用3号Biojector注射器(Bioject)作为两次0.5mL注射运送到四头肌肌肉。对于腺病毒载体单独使用而言，在第0，8和26周免疫动物。对于DNA/腺病毒载体致敏-增强方案，对猴子在第0，4，8周施用质粒，在第26周施用腺病毒载体。对猴子，在免疫后90周每隔2-4周采血。
应用ELISPOT测定法来检测针对多病毒抗原的疫苗激发的T细胞免疫应答的出现。应用重叠跨越SIV Gag蛋白的11个氨基酸的15个氨基酸肽的库，重叠跨越HIV-1 Env 89.6P蛋白(异源分化体B Env)的10个氨基酸的20个氨基酸肽的库，和Mamu-A*01限制性CTL表位肽p11c，p41a和p68a，对每只动物进行单独测定。将96孔多筛选平板用100μL/孔的在没有内毒素的Dulbecco′s PBS(D-PBS)中的5μg/mL抗人IFN-γ(B27；BDPharmingen)包被过夜。然后，将平板用含有0.25％吐温-20的D-PBS(D-PBS/吐温)洗涤3次，在37℃用含有5％FBS的D-PBS封闭2小时，用D-PBS/吐温洗涤3次，用含有10％FBS的RPMI 1640漂洗，以去除吐温-20，并且与肽库和2×105PBMC以100μL反应体积三次实验进行温育。在37℃温育18小时后，接着将平板用D-PBS/吐温洗涤9次，并用蒸馏水洗涤1次。然后，将平板与2μg/mL生物素酰化的兔抗人IFN-γ(Biosource)在室温温育2小时，用Coulter Wash(Beckman-Coulter)洗涤6次，并且用1∶500的链霉抗生物素蛋白-AP(Southem Biotechnology)稀释物温育2.5小时。用Coulter Wash洗涤5次和用PBS洗涤1次后，接着将平板用NBT/BCIP色素原(Pierce)显色，通过用自来水洗涤而终止，空气干燥，并且应用ELISPOT读取仪(Hitech Instruments)读取。计算每106PBMC的斑点形成细胞(SFC)。介质背景一直表现出每106PBMC少于15个斑点形成细胞。
在单一腺病毒载体免疫后，接着在两种猴子中检测针对Gag和Env肽库的应答。免疫后4周，对于猴子Aw13和AV83，每106PBMC的斑点形成细胞(SFC)总数分别为2,560和2,160。尽管在第8周第二次腺病毒载体免疫后，猴子AV83产生增强的Gag和Env特异性细胞免疫应答，在猴子Aw13的应答中没有观察到变化。在第26周，没有猴子表现出针对第三次腺病毒载体免疫的增强的应答。在猴子Aw13和AV83中，从免疫后第52周，针对这些编码抗原的疫苗的细胞应答保持持久的。
在用DNA致敏/腺病毒载体增强方案免疫后，还通过合并的(pooled)肽ELISPOT测定法分析针对编码抗原的Gag和Env载体的细胞免疫应答。在第26周腺病毒载体增强之后，与只用DNA接种相比，在猴子Aw2P和Aw28中，针对Gag和Env肽库的细胞免疫应答增强了5-6倍更高。在第30周，即，免疫后4周，对于猴子Aw2P和Aw28，每106PBMCs的SFC总数分别为7010和7805。在猴子Aw2P和Aw28中，从免疫后第58周，针对这些编码抗原的载体的细胞应答保持持久，测定每106PBMC有4265和3000个SFC。
为了评估抗原特异性CD4+和CD8+T淋巴细胞在由所述腺病毒载体构建体激发的细胞免疫中的作用，在第28周，最后一次腺病毒载体免疫之后2周，应用未分化和耗尽CD8+T淋巴细胞的PBL进行肽ELISPOT检测。尽管应用全部的PBL测定针对Gag和Env肽库的有效的细胞免疫应答，但是，当CD8+T淋巴细胞被从PBL群体中去除时，这些应答基本上减少了，这证明用腺病毒载体免疫激发主要由CD8+T淋巴细胞介导的有效的细胞免疫应答。
应用直接的酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定抗gp120(HIV-MN)和抗p27 SIVmac239抗体的血浆滴度(参见，例如，VanCott等.，J.Virol.，73(6)，4640-50(1999))。在腺病毒载体免疫后，两种猴子具有可证明的针对gp14089.6包膜蛋白的抗体滴度(通过ELISA测定)。在所有4种免疫的动物中还测定强同源性中和抗体滴度，但是在DNA致敏/腺病毒增强的动物中的应答的数量级比只用腺病毒载体接种后观察到的应答数量级高出几倍。
应用基于中和检测的流程来测定血浆介导的病毒中和。将血浆样品热灭活，以耗尽互补蛋白，并且在1∶5稀释时检测。通过与第0周免疫前血浆比较，计算第28周和第32周介导的中和百分比(参见，例如，Mascola等.，J.Virol.，76(10)，4810-21(2002))。也证明了针对HIV-1 89.8包膜抗原的中和抗体。在DNA致敏/腺病毒载体增强接种的动物中的中和抗体应答的数量级更高于在腺病毒载体接种的动物中的数量级。
这些结果表明，当单独施用时，所述腺病毒载体组合物可以在哺乳动物中激发免疫应答，并且证明，当腺病毒载体组合物用作哺乳动物中DNA致敏/腺病毒增强方案的一部分时，所述免疫应答可以被增强。
实施例8本实施例例证本发明方法诱导针对在腺病毒载体组合物或引发组合物中不存在的HIV抗原的保护性的免疫的应用。
将24只杂交的成年印度源性恒河猴(Macaca mulatta)肌内注射表达SIVmac 239 Gag/Pol DNA，HIV-1 89.6P Env DNA(VRC/NIH，Bethesda，MD)，或HXB2/Bal Env DNA的DNA构建体，接着增强施用重组腺病毒载体。由于不稳定性，研究等级的腺病毒载体被构建成不具有Nef(参见Letvin等.，Journal of Virology，印刷中)。
在每种情形中，将疫苗构建体在无菌盐水中混合在一起，并且应用3号Biojector注射器(Bioject)，以两次0.5mL注射运送到四头肌肌肉。对于DNA/腺病毒载体致敏-增强方案，在第0，4，8周发生DNA免疫，和在第26周发生腺病毒载体免疫(1×1012pu)。从免疫后第90周，每隔2-4周对猴子采血。对下列4个实验组进行检测(1)对照，(2)不具有Env的Gag/Pol/Nef DNA和Gag/Pol腺病毒载体(mock)，(3)具有SHIV-89.6PEnv的Gag/Pol/Nef DNA和Gag/Pol腺病毒载体，或(4)具有HXB2/BalEnv的Gag/Pol/NefDNA和Gag/Pol腺病毒载体。
在第38周，即，腺病毒载体增强后12周，将所有的猴子用猴子感染剂量50(MID50)SHIV-89.6P静脉内攻击。在免疫和攻击后每隔2-4周对猴子进行采血。
在体外暴露于跨越SIVmac Gag/Pol/Nef和HIV-1 Env蛋白的肽库后，对于针对干扰素γ ELISPOT应答，对新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)进行评估。应用与Env免疫原相匹配的肽，评估所有Env-特异性应答。检测系统在Letvin等，如前所述中描述。
来自所有接受实验性免疫原的猴子的PBMCs的ELISPOT应答是强烈的。在所有组的接种猴子中，产生了针对SIV Gag，Pol和Nef的细胞免疫，以及在接受这些各自的免疫原的猴子中产生了针对HIV-1 89.6P和HXB2/Bal Env的细胞免疫。在不匹配的Env组中，在最后一次质粒DNA接种后2周，针对所有的病毒蛋白的平均总的疫苗激发的ELISPOT应答为1,588±554平均标准误差(SEM)个斑点形成细胞(SFC)。用重组腺病毒载体增强后2周，存在比仅由DNA致敏激发的细胞免疫高出＞2.5倍的增强。
在第38周，用猴子感染剂量50(MID50)SHIV-89.6P攻击后，在所有的对照中观察到极度的CD4+T淋巴细胞损失，尽管在所有接种动物中观察到所述CD4+T淋巴细胞损耗的本质上的减弱。在除SIV Gag/Pol-Nef外接受HIV-1 Env的猴子中，这种减弱是最显著的，这证明针对CD4+T淋巴细胞损失的统计学显著保护由在疫苗中包含Env补体(component)提供。重要地，接受不匹配Env免疫原的猴子表现出与那些注射了匹配免疫原的猴子相当的保护。接受SIV Gag/Pol/Nef+不匹配Env免疫原的猴子组还证明病毒的更好的防范，由减少的病毒负荷所指示。
这些结果表明，所述腺病毒载体组合物可以用于在哺乳动物中激发针对HIV的免疫应答。
实施例9本实施例例证由作为DNA致敏/重组腺病毒增强方案的一部分施用的腺病毒载体组合物在哺乳动物中激发细胞免疫应答。
将杂交成年恒河猴(Macaca mulatta)肌内注射编码SIV Gag/Pol/Nef蛋白和多分化体A，B和C HIV-1 Env蛋白的GLP等级质粒DNA载体的混合物，其包含在称为VRC-HIVDNA009-00-VP的组合物中。编码SIVmac239 Gag/Pol的腺病毒载体和编码HIV-1分化体A，B和C Env的腺病毒载体用来增强。
在每种情形中，将质粒或腺病毒载体在无菌盐水中混合在一起，并且应用3号Biojector注射器(Bioject)，以两次0.5mL注射运送到四头肌肌肉。在第0，4和8周，用质粒DNA免疫动物，并且在第26周，用腺病毒载体免疫。从第42周，每隔2-4周对动物进行采血。具体的致敏和增强免疫分别在表2和3中列出。
表2
表3
应用ELISPOT测定法来监测针对多病毒抗原的疫苗激发的T细胞免疫应答的出现。应用重叠跨越SIV Gag，SIV Pol，SIV Nef，HIV-1 Env分化体A，HIV-1 Env分化体B，和HIV-1 Env分化体C蛋白的11个氨基酸的15个氨基酸肽的库，所述肽库与由腺病毒载体编码的免疫原序列相匹配，对每只动物进行单独的检测。还应用重叠跨越HIV-1 Env 89.6P的10个氨基酸的20个氨基酸肽的库，其为与所述腺病毒载体编码的免疫原异源的分化体B Env序列，进行检测。将96孔多筛选平板用100μL/孔的在没有内毒素的Dulbecco′s PBS(D-PBS)中的5μg/mL抗人IFN-γ(B27；BDPharmingen)包被过夜。然后，将平板用含有0.25％吐温-20的D-PBS(D-PBS/吐温)洗涤3次，在37℃用含有5％FBS的D-PBS封闭2小时，用D-PBS/吐温洗涤3次，用含有10％FBS的RPMI 1640漂洗，以去除吐温-20，并且与肽库和2×105PBMC以100μL反应体积三次实验进行温育。在37℃温育18小时后，接着将平板用D-PBS/吐温洗涤9次，并用蒸馏水洗涤1次。
然后，将平板与2g/mL生物素酰化的兔抗人IFN-γ(Biosource)在室温温育2小时，用Coulter Wash (Beckman-Coulter)洗涤6次，并且用1∶500的链霉抗生物素蛋白-AP(Southem Biotechnology)稀释物温育2.5小时。用Coulter Wash洗涤5次和用PBS洗涤1次后，接着将平板用NBT/BCIP色素原(Pierce)显色，通过用自来水洗涤而终止，空气干燥，并且应用ELISPOT读取仪(Hitech Instruments)读取。计算每106PBMC的斑点形成细胞(SFC)。介质背景一直少于每106PBMC 15个斑点形成细胞。
由单一分化体Env免疫激发的细胞免疫应答的交叉分化体反应性的程度通过评估组1(高分化体B Env)和组2(高分化体C Env)中的应答进行研究。对于DNA致敏免疫，猴子接受4.5mg Gag/Pol/Nef质粒和4.5mg来自分化体B(组1)或分化体C(组2)的Env质粒。应用来自Env分化体A，Env分化体B，Env分化体C，和Env 89.6P(异源分化体B Env)的肽库，通过合并的肽ELISPOT检测，对Env特异性细胞免疫应答检测PBMCs。组1中接受Env分化体B质粒的猴子产生针对所有Env肽库的应答，这证明交叉分化体反应性的程度。然而，分化体B肽应答更高于分化体A或分化体C应答。在用1.0×1012pu Gag/Pol和1.0×1012pu分化体B Env腺病毒载体增强免疫后，组1中猴子的DNA致敏的细胞免疫应答被显著地增强。尽管在腺病毒载体增强免疫之后，从这些猴子中观察到针对所有的Env肽库的应答，所有6只动物证明针对分化体B Env最高的应答。
相似地，组2中接受Env质粒和来自分化体C的腺病毒载体的猴子产生针对所有Env肽库的应答。在DNA致敏免疫和腺病毒载体增强之后，在所有6只动物中，分化体C应答更高于分化体A或分化体B应答。这些数据证明DNA致敏/腺病毒载体增强免疫同单一分化体Env免疫原一起激发具有部分交叉分化体反应性的Env特异性细胞免疫应答，但是最高的应答一般是针对与所述免疫原相匹配的Env分化体。
组4中猴子的Env-特异性免疫应答(低分化体B Env)与组1中猴子的应答(高分化体B Env)相当。组4中猴子接受4.5mg Gag/Pol/Nef质粒与1.5mg来自分化体B的Env质粒，以用于DNA致敏免疫，以及1.0×1012pu Gag/Pol腺病毒载体与3.3×1011PU分化体B Env腺病毒载体，以用于增强免疫。这些观察表明，将单一Env质粒或腺病毒载体的剂量降低3倍不会导致免疫原性的主要减少。在仅接受假(sham)质粒和腺病毒载体的组5中的猴子中观察到最低的背景应答。
通过评估组3(分化体A+B+C Env)的应答，对由多分化体Env免疫激发的细胞免疫应答的幅度和数量级进行研究。对于DNA致敏免疫，这些猴子接受4.5mg Gag/Pol/Nef质粒与1.5mg的来自分化体A，B和C的每种Env质粒(总共4.5mg Env质粒)。观察到针对Env分化体A，B和C的相似数量级和宽度的细胞免疫应答。这些数据证明，在组3中，3种Env质粒的混合物导致增强的幅度，而没有失去应答的数量级，尽管在组3中每种Env质粒成分以1.5mg的剂量给予，而不是4.5mg的剂量的事实。在用1.0×1012pu Gag/Pol腺病毒载体和3.3×1011pu的每种分化体A，B和C的Env腺病毒载体增强免疫之后，所有的六只猴子表现出针对分化体A，B和C Env肽库相似数量级的应答。这些数据证明，在组3中每个个体分化体特异性应答的数量级与在组1和2中激发的最佳分化体特异性应答相当。
在紧接着DNA免疫和紧接着腺病毒载体增强后，在所有接种的猴子中观察到针对SIV Gag和Pol的细胞免疫应答。接受4种成分多分化体疫苗产物的猴子(组3)激发与在接受单一分化体Env免疫原的猴子中所观察到的相似数量级的针对SIV Gag和SIV Pol的细胞免疫应答。因此，当与单一分化体疫苗(组1，2和4)相比较时，所述4种成分多分化体疫苗(组3)导致针对所有疫苗编码的抗原更广泛的应答，而不失去免疫原性。而且，在DNA致敏和腺病毒载体增强免疫之后，发现针对这些抗原的细胞免疫应答是持久的。
在紧接着腺病毒载体增强免疫之后，通过评估猴子的Env-特异性抗体滴度，对由单一分化体和多分化体Env免疫激发的体液免疫应答进行研究。检测血浆样品Env分化体A，分化体B，或分化体C特异性抗体结合活性，如通过ELISA测定。
对于第10周(DNA后)和第40周(腺病毒载体后)，确定终点滴度作为最后的稀释，预先免疫校正的光学密度(OD)大于0.2。将孔用37.5ng纯化的Env抗原在4℃包被过夜。洗涤平板，并且在37℃封闭(20％FBS/1％BSA缓冲溶液)1小时。将两个相同的孔的连续稀释的血清在37℃温育2小时后，用生物素标记的山羊抗猴(1小时37℃)，链霉抗生物素-HRPO(30分钟，室温(RT))，和TMB底物(30分钟，RT)温育。颜色反应通过添加硫酸而终止，并且在30分钟内在450nm对平板进行读数，基于两个相同的孔的平均值报告结果。
组1(高分化体B Env)中的猴子产生能够结合所有3种Env抗原的抗体应答，这证明交叉分化体反应的程度。尽管测量到针对分化体B和CEnv抗原的强有力的应答，但是检测到针对同源分化体B Env的最高的抗体滴度。组4(低分化体B Env)中的猴子展现出Env-特异性抗体滴度，其在幅度和数量级上与在组1中猴子测定的那些相似，这证明将Env免疫原的剂量减少3倍不会导致减少的免疫原性。类似地，组2(高分化体CEnv)中的猴子激发能够识别所有3种Env抗原的抗体应答，但是检测到针对同源分化体C Env的最高滴度。然而，用分化体A，分化体B，和分化体C Env抗原的混合物免疫的猴子(组3)表现出针对所有3种Env抗原的高数量级抗体滴度。
这些数据表明，当与单一分化体Env免疫激发的应答相比较时，多分化体Env免疫导致增强幅度的体液免疫应答，而没有损失免疫原性。
实施例10本实施例例证，在哺乳动物中由作为DNA致敏/重组腺病毒增强方案的部分施用的腺病毒载体组合物激发的细胞和体液免疫应答。
将杂交的成年猕猴(Cynomolgus macaques)肌内注射疫苗质粒或腺病毒载体构建体的混合物。具体地，包含在组合物VRC-HIVDNA009-00-VP(实施例8)中的表达Gag/Pol/Nef蛋白和多分化体A，B和C HIV-1 Env蛋白的GLP质粒DNA被用为致敏免疫。将GMP等级的VRC-HIVADV014-00-VP(实施例1)用作腺病毒载体增强。
为了在动物研究中获得对于3次预定的注射所需要的体积，制备了3批配制的物质。将3个批次在50mL圆锥管中组合。在将所述管倒置几次混合之后，将15.6-15.7mL的混合物等分到3个50mL圆锥管中的每一个。将管子标记，并且在-20℃保存直至分发。
在第0，4和8周，通过Biojector肌内(i.m.)运送8mg DNA组合物，并且在第38周，通过针头和注射器i.m.运送1011pu完全腺病毒载体疫苗构建体。从第42周，每2-4周对动物进行采血。
应用ELISPOT测定来监测疫苗激发的针对多病毒抗原的T细胞免疫应答的出现，如在实施例8中所描述的那样。应用直接的ELISA来测定Env分化体A，分化体B和分化体C抗体的血浆滴度，如在实施例8中所描述的那样。
在DNA致敏免疫后和腺病毒载体增强后，在所有6只动物中，接受DNA质粒疫苗致敏和腺病毒载体增强的猴子产生针对分化体A，B和CEnv肽库的应答。6只动物中有5只发展了针对所有3种包膜抗原(分化体A，B和C)的抗体应答。一只动物发展了只针对分化体A和C包膜的体液免疫应答。在腺病毒增强后，所有6只猴子都具有强Env抗体应答。
这些数据证明，所述临床DNA致敏/腺病毒载体产物是免疫原性的，并且诱导针对分化体A，B，C Env以及Gag和Pol的细胞免疫应答，和针对分化体A，B和C Env以及Gag的抗体应答。腺病毒载体增强将免疫应答增加了几倍。
实施例11本实施例例证，在猕猴(Cynomolgus monkeys)中由重组腺病毒增强免疫激发的细胞免疫应答。将6只猕猴(cynomolgus macaques，毛里求斯起源)用1×1011pu剂量的腺病毒载体组合物VRC-HIVADV014-00-VP(实施例1)肌内免疫一次。应用针头和注射器，将所述组合物作为两次0.5mL注射运送到四头肌。从免疫后第4周，每2-4周对猴子进行采血。应用ELISPOT检测来监测疫苗激发的针对多病毒抗原的T细胞免疫应答的出现，如在实施例8中所描述的那样。
在所有6只动物中，接受腺病毒载体的猴子产生针对分化体A，B和C Env肽库的应答。这些数据证明，所述临床腺病毒载体产物是免疫原性的，并且诱导针对分化体A，B，C Env以及Gag和Pol的细胞免疫应答。
在预免疫(第-1周)，第0周(第1次免疫)，和第1，2，3，4，5和8周时间点，在通过盐酸氯胺酮化学麻醉后，由实验室动物医学(LaboratoryAnimal Medicine)认证的兽医临床评估所述动物。在第-1，3和5周确定血清化学和全血计数。发现受试动物在所有评估的时间点是健康的并且处于极好的状态。身体检查包括听诊、触诊以及体温、脉搏和呼吸的确定。体温、脉搏和呼吸在正常界限之内。在第1和第5周，分别在两只猴子(CO7422和CO 7414)中检测到豌豆大小的腹股沟淋巴结，位于接种的身体同侧。对于所有的动物，白细胞计数和血细胞比容值一般在正常界限之内，并且在免疫之前和之后时间点具有最小的变化。血清电解质，血尿氮和肌酸酐也在正常界限之内。
在预先免疫的血清中以及在免疫时，所有的动物具有正常界限的天冬氨酸转氨酶/谷草转氨酶(AST/GOT)，碱性磷酸酶，和完全的bilbubin水平。动物CO 7412具有97 U/L(正常范围0-138 U/L)的预免疫丙氨酸转氨酶/谷丙转氨酶(ALT/GPT)。在免疫后，ALT稍微上升(在3周时177 U/L，在5周时166 U/L)，但是在免疫后8周处于正常界限之内(136 U/L)。在动物CO 7423和CO 7420中，在第5周，酶肌酸酐激酶和乳酸脱氢酶最低限度地增加，其最可能代表氯胺酮诱导的肌肉损伤。在第8周，所述值恢复正常。
这些数据证明，本发明的方法在猕猴(cynomolgus macaques)中激发针对所有病毒抗原的有力的和广泛的细胞免疫应答。
实施例12本实施例例证施用给哺乳动物的腺病毒载体组合物的安全性。
将雌性和雄性新西兰白兔通过肌内注射施用DNA致敏构建体(VRC-HIVDNA009-00-VP)和腺病毒载体构建体VRC-HIVADV014-00-VP作为增强，或者单独施用VRC-HIVADV014-00-VP。VRC-HIVADV014-00-VP如在实施例1中所描述那样生产。
对于DNA致敏/腺病毒增强方法，使用Biojector 2000Needle-FreeInjection Management SystemTM(Bioject)，将4mgVRC-HIVDNA009-00-VP或PBS对照(第1，22研究日)通过每天两次肌内注射给药至大腿肌肉(0.5mL/注射位点；对于每次注射的剂量体积不因体重调节)(两次注射间隔大约1英寸)。对于每个时间点在交替侧实施注射。在剃毛/标记位点施行每次注射。为了显现注射位点，将所述位点按照需要重新剃毛和重新标记。
对于DNA致敏/腺病毒增强研究和仅包括所述腺病毒载体的研究，用针头和注射器，每天进行两次0.5mL注射将VRC-HIVADV014-00-VP(1×1011pu)或者稀释液对照(VRC-DILUENT013-DIL-VP)注射至后大腿肌肉。每次注射在剃毛/标记位点施行。为了显现注射位点，将所述位点按照需要重新剃毛和重新标记。
将动物随机地分成处理组。处理期间为22天，并且研究持续时间为36天。对于每个时间点，在交替侧施行注射。对于DNA和腺病毒载体剂量和它们各自的对照，不论体重，施用1.0mL。
在第一剂量施用前，将血样(大约2mL)从所有的动物分离。将所述样品进行血液学、化学、凝固和免疫学分析。分离血清并且在-75℃±10℃保存，以用于在干冰上转移。对这些样品的一些或全部进行抗体产生分析，作为暴露于所测试的物品的指示。
终期血液收集之后，将所有的动物通过戊巴比妥钠或者等价物注射无痛处死并且放血。将动物尽可能接近处死时刻进行尸体剖检。在兽医病理学者的监督下，进行预定的尸体剖检。
对所有要求的动物进行完全的总尸体剖检，其包括检验身体的外表面，注射/处理位点，所有的孔，以及头颅的、胸的、和腹腔及其内容物。从每只动物的胸骨制备2张骨髓涂片。将载波片空气干燥，在甲醇中固定，并且存档，以用于可能的将来评估。在预定的尸体剖检时，尽可能迅速地将来自所有要求动物的下述器官(性别适当的)称重肾上腺，心脏，肺，脑，脾，肾，肝(带有排干的胆囊)，睾丸/卵巢，垂体，胸腺，子宫，和甲状腺/甲状旁腺。成对的器官一起称重。
将来自每只尸体剖检的动物的所有组织保存在10％中性缓冲福尔马林(NBF)中。将所述组织包埋在石蜡中，切片，用苏木精和伊红染色，由委员会认证的兽医病理学者进行显微镜检验。分析来自每只动物和来自总损伤(来自所有的组)的组织。
应用用于常态的Kolmogorov-Smimov检验，用于相同变量的Levene中值检验(Levene Median test)，以及通过一步变量分析(Analysis ofVariance，ANOVA)，分析定量结果。如果所述常态或相同变量检验失败了，那么所述分析应用关于排列变换数据的非参量Kruskal-Wallis ANOVA进行。对于参量数据，如果ANOVA显示出在实验组之间的统计学显著性，那么应用Dunnett′s t-检验来描绘哪组(如果有一些的话)与对照不同。对于非参量数据，如果ANOVA显示出在实验组之间的统计学显著性，那么应用Dunn′s检验来描绘哪组(如果有一些的话)与对照不同。对于所有的检验，将小于0.05(双尾，two-tailed)的概率值用作显著性的临界水平。统计学分析应用SigmaStatTM统计学软件(SigmaStatTMStatistical Software，Jandel Scientific，San Rafael，CA)。
对于包括仅施用VRC-HIVADV014-00-VP的免疫方法，所有的动物存活到预定的界限，并且在下述参量中没有注意到与处理相关的作用死亡率，临床和笼边观察，Draiz观察，体重，眼科学，临床病理学，和器官重量(除了增加的脾重，其可能是暴露于免疫刺激剂的预期结果)或器官重量比例。在第一次注射后24小时，在处理的动物中存在上升的体温。在每次注射后24-48小时期间，在处理的动物中还存在下降的食物消耗。在处理的动物中，在注射位点观察到暂时的炎症，所述炎症是在坐骨神经和临近淋巴和毛细血管周围的结缔组织中的可康复的、慢性炎症。在SD 3时胆固醇和三酰甘油水平的暂时增加与临床症状或病理不相关，并且在SD 24时CPK的暂时增加可能与肌肉炎症相关。
对于DNA致敏/腺病毒载体增强方法，观察到在注射位点(由Draize得分和组织病理学观察到)和坐骨神经周围的围神经组织(仅由组织病理学观察到)的可康复的炎症。另外，在紧随起始后24小时在免疫的兔子中和在紧随第二腺病毒载体增强后3小时在免疫的雌兔中注意到发热。在每次接种之后的24-48小时食物消耗也减少了，尽管这解决了并且没有影响体重或者在雄性中的体重增加。然而，与对照雌性相比较，处理的雌性没有减少的体重和体重增加，所述对照雌性在SD71后(体重)和在初始腺病毒载体增强后(体重增加)变得统计学显著，但是这早在SD36(在DNA致敏系列期间)开始观察到。
本实施例证明本发明的方法在兔子中诱导最小限度的毒性。
实施例13本实施例例证将腺病毒载体组合物施用给人。
在以1×109pu，1×1010pu，或1×1011pu的剂量单一注射VRC-HIVADV014-00-VP之后，开始随机化的、安慰剂对照的、双盲的、剂量增加的研究，以检验在人体中的安全性，耐受性和免疫应答。每个治疗组包括12名受试者(10名疫苗；2名安慰剂)。本研究起始于2004年7月19日，并且本研究于2004年11月10日完成36名受试者的登记。NIAID内部数据和安全性监测委员会(NIAID Intramural Data and SafetyMonitoring Board(DSMB))从每次剂量增加之前的14天随访检查了初步的安全性数据。所述初步的数据表明，VRC-HIVADV014-00-VP对于健康的受试者在所评估的3剂量水平上似乎是安全的。与1×1011pu剂量水平相比，1×109pu和1×1010pu剂量水平与更少的反应原性相关。在1×109pu和1×1010pu剂量组中，记录在5日日志卡片上的局部和全身性症状在严重性上是从无到轻微，并且没有受试者经历过发热。在1×1011pu剂量组中，4名受试者在第1天报告了发热(在严重性上3名轻微和1名中度)。在第1天，发热的4名受试者每一名还报告了中度头痛，并且这些受试者的3名还报告了至少一项其它的中度全身性参量(例如，不适，肌痛，和寒战)。2名没有发热的受试者报告了至少一项中度全身性症状(例如，不适，肌痛，和恶心)。1×1011pu剂量组中的一名受试者报告了中度注射位点疼痛；否则，注射位点反应原性没有或者是轻微的。
到2005年1月31日，存在一个4级(潜在地威胁生命)事件。存在三个可能与接种相关的2级(中度的)不利事件。本研究关于疫苗对安慰剂注射分配都是不知情的。4级不利事件是在1×1011pu剂量组中的健康受试者中研究注射后64天发生的一次发作，所述健康受试者在参与研究前3年有过一次发作的历史。假定在先发作历史和在研究注射后大于2个月的事件时间选择，看起来所述发作不可能与研究药剂相关。2级不利事件可能与研究药剂相关，其包括(1)无症状的嗜中性白细胞减少，其在已知在参与之前有时具有无症状的低嗜中性粒细胞计数的受试者中，在研究注射后21天注意到，(2)腹泻(持续1天)，在研究注射后第三天，在不同的受试者中发生，和(3)脂肪肝炎(steatohepatitis，脂肪肝(fatty liver))，其在对鉴定在临床上无症状的受试者中研究接种后25天开始注意到的持久的1级ALT(丙氨酸转氨酶)上升的起因的广泛评估后诊断出。肝脏学顾问医生报告一种印象，即，所述病症可能在参与研究之前就存在。对持久的1级ALT起作用的因素可能是乙醇消耗和最近的体重增加。一般认为脂肪肝炎的诊断是2级病症，但是到2005年1月31日，肝功能检验在严重性上不超过1级。
尽管使用1×1011pu剂量观察到更多的反应原性，它似乎为良好耐受的剂量，并且为了减轻短期症状，可以自行施用止痛剂/退热剂非处方药物。正在进行一种流程特异性临时免疫原性分析(protocol-specified interimimmunogenicity analysis)，以比较安慰剂和3种剂量组。不知情的免疫原性数据表明在更高剂量具有增强的免疫应答的剂量作用。在每组(研究分配是不知情的)12名受试者(2名安慰剂和10名疫苗接受者)中，在通过商购HIV-抗体测定的第12个研究周，具有疫苗诱导的ELISA的受试者的数目从1×109pu组的3名增加到1×1010pu组的6名，和1×1011pu组的9名。所述反应原性数据总结在下述表4中。
表4
这些结果表明，本发明的方法在人体中是良好耐受的。
实施例14本实施例例证将VRC-HIVADV014-00-VP施用给人。
在未感染的成年受试者中腺病毒载体组合物VRC-HIVADV014-00-VP作为单一药剂第二次I期研究目前正在进行中。这种不知情的、剂量增加研究设计成招募2组24名具有低Ad5抗体滴度(＜1∶12)的受试者，其将以5∶1的比例随机化接受VRC-HIVADV014-00-VP或安慰剂。疫苗的第一组将接受1×1010pu VRC-HIVADV014-00-VP，和第二组将接受1×1011pu VRC-HIVADV014-00-VP。
实施例15本实施例例证将VRC-HIVADV014-00-VP作为在用DNA分子免疫后的增强剂施用给人。
已经开始I期、不知情的、安慰剂对照的研究，其给完成VRC-HIVDNA009-00-VP DNA注射方案的参与者提供1×1010puVRC-HIVADV014-00-VP的单一腺病毒载体增强(或安慰剂)。所述腺病毒载体疫苗增强将在用VRC-HIVDNA009-00-VP(或安慰剂注射)初始DNA接种后6-9个月的时间间隔给予。第一名参与者在2004年11月22日参与。到2004年12月21日，11名参与者已经接受了他们的增强注射。这些参与者中，6名经受了在注射位点的轻微疼痛和/或触痛。不存在局部反应原性事件的其它报告。5名参与者报告了轻微或中度全身性症状，包括头痛，不适和恶心。不存在发热报告，没有3级事件，并且没有严重的不利事件。
这些结果表明，本发明的方法在人体中是良好耐受的。
本文所引用的所有的参考文献，包括出版物、专利申请、和专利，通过相同程度的参考结合于此，好像任一参考文献单独地并且具体地表明通过参考结合于此，并且在本文中完全阐明。
术语“一种(a，an)”和“所述(the)”和相似的指示物在描述本发明的上下文中(特别是在下述权利要求的内上下文中)的应用解释为包括单数和复数，除非本文另外指出或者通过上下文清楚地相互抵触。术语“包括(comprising)，”“具有(having)，”“包含(including)，”和“含有(containing)”解释为开放末端术语(即，意为“包含，但不限于，”)，除非另外注明。本文数值的范围的叙述仅仅意欲作为个别提及每一个单独的落入本范围的数值的简略方法，除非本文另外指出，并且每一个单独的数值结合在说明书中，好像其在本文中单独叙述一样。本文所描述的所有方法可以以任何适当的顺序实行，除非本文另外指出或者通过上下文清楚地相互抵触。本文所提供的任一和全部实例，或者示例性语言(例如，“诸如”)的应用，仅仅意欲更好地举例说明本发明，除非另外要求，并不形成本发明范围的局限。说明书中没有语言应该解释为指示实践本发明的必需的任何非要求的要素。
本文描述了本发明的优选实施方案，其包括发明人已知的对于实行本发明的最好方式。对于本领域的那些普通技术人员，当阅读前述描述后，这些优选实施方案的变化可以变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员适当地应用这样的变化，并且，除了按照本文具体描述的那样，本发明人打算将本发明用于实践。因此，本发明包括在本文附属的权利要求中叙述的主题内容的按照适用的法律允许的改进和等价物。并且，本发明包括上述要素在其所有可能的变化中的任何组合，除非本文另外指出或者另外通过上下文清楚地相互抵触。
序列表<110>美国政府卫生与公共服务部杰韦克公司G·J·内伯尔成程江咏培J·G·D·贾森C·R·金<120>应用腺病毒载体诱导免疫应答的方法<130>234892<150>60/561,341<151>2004-04-12<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的<400>1Cys Arg Gly Asp Cys1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
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<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>Xaa可以是任何氨基酸<400>2Cys Xaa Cys Arg Gly Asp Cys Xaa Cys1 5<210>31
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权利要求
1.一种在哺乳动物中诱导针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答的方法，其包括给所述哺乳动物施用腺病毒载体组合物，其中所述腺病毒载体组合物包括编码两种或多种不同HIV抗原的一种或多种腺病毒载体，由此在所述哺乳动物中产生所述HIV抗原并且诱导针对HIV的免疫应答。
2.权利要求1的方法，其中所述腺病毒载体组合物包括编码两种或多种不同HIV抗原的两种或多种腺病毒载体，并且每一腺病毒载体包括编码所述两种或多种不同HIV抗原的至少一种的核酸序列。
3.权利要求2的方法，其中所述腺病毒载体组合物包括编码3种或多种不同HIV抗原的3种或多种腺病毒载体，并且每一腺病毒载体包括编码所述3种或多种不同HIV抗原的至少一种的核酸序列。
4.权利要求3的方法，其中所述腺病毒载体组合物包括编码4种或多种不同HIV抗原的4种或多种腺病毒载体，并且每一腺病毒载体包括编码所述4种或多种不同HIV抗原的至少一种的核酸序列。
5.权利要求1的方法，其中所述一种或多种腺病毒载体每一种包括(i)编码两种或多种不同HIV抗原的核酸序列，或(ii)两种或多种核酸序列，每种编码不同HIV抗原。
6.权利要求5的方法，其中所述一种或多种腺病毒载体每一种包括编码两种或多种不同HIV抗原的核酸序列。
7.权利要求5的方法，其中所述一种或多种腺病毒载体每一种包括两种或多种核酸序列，所述核酸序列每种编码不同HIV抗原。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其还包括给所述哺乳动物施用引发组合物，其包括一种或多种核酸序列，所述核酸序列编码与由所述腺病毒载体组合物中的腺病毒载体所编码的HIV抗原相同的至少一种HIV抗原，其中所述引发组合物的施用在所述腺病毒载体组合物施用前至少1周施行。
9.权利要求8的方法，其中所述引发组合物包括一种或多种核酸序列，其编码两种或多种HIV抗原，所述HIV抗原与由所述腺病毒载体组合物的一种或多种腺病毒载体所述编码的HIV抗原相同。
10.权利要求8或权利要求9的方法，其中所述引发组合物的施用在所述腺病毒载体组合物施用前大约6个月到大约9个月施行。
11.权利要求8-10中任一项的方法，其中所述引发组合物包括一种或多种质粒，裸DNA分子，或包括所述一种或多种核酸序列的病毒载体。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述腺病毒载体是复制缺陷型。
13.权利要求12的方法，其中所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组E1区域的一种或多种必需的基因功能。
14.权利要求12或13的方法，其中所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组E4区域的一种或多种必需的基因功能。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组E3区域的一种或多种基因功能。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中至少一种HIV抗原选自由下列各项组成的组HIV Gag蛋白，HIV Pol蛋白，HIV Env蛋白，HIV Tat蛋白，HIV反转录酶(RT)蛋白，HIV Vif蛋白，HIV Vpr蛋白，HIV Vpu蛋白，HIV Vpo蛋白，HIV整合酶蛋白，HIV Nef蛋白，和包括HIV Gag蛋白、HIV Pol蛋白或HIV Env蛋白的全部或部分的融合蛋白。
17.权利要求16的方法，其中至少一种HIV抗原为HIV gp140或gp140dv12。
18.权利要求16的方法，其中至少一种HIV抗原为融合蛋白，其包括HIVGag蛋白的全部或部分和HIV Pol蛋白的全部或部分。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述HIV抗原包括选自由下列各项组成的组的至少一种成员HIV分化体A抗原，HIV分化体B抗原，HIV分化体C抗原，和HIV分化体MN抗原。
20.权利要求19的方法，其中所述HIV抗原包括选自由下列各项组成的组的至少两种成员HIV分化体A抗原，HIV分化体B抗原，HIV分化体C抗原，和HIV分化体MN抗原。
21.权利要求20的方法，其中所述腺病毒载体编码3种或多种不同的HIV抗原，并且所述HIV抗原包括选自由下列各项组成的组的至少3种成员HIV分化体A抗原，HIV分化体B抗原，HIV分化体C抗原，和HIV分化体MN抗原。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述腺病毒载体组合物作为包括药用载体的药物组合物的部分施用。
23.权利要求22的方法，其中所述药物组合物以两剂或更多剂量施用。
24.权利要求22或23的方法，其中所述药物组合物以包括1×108-1×1012个颗粒单位(pu)的腺病毒载体的剂量施用。
25.权利要求24的方法，其中所述药物组合物以包括1×108-1×1010pu腺病毒载体的剂量施用。
26.权利要求24的方法，其中所述药物组合物以包括1×109-1×1011pu腺病毒载体的剂量施用。
27.权利要求24的方法，其中所述药物组合物以包括1×1010-1×1012pu腺病毒载体的剂量施用。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中所述腺病毒载体组合物包括(a)包括编码融合蛋白的核酸的腺病毒载体，所述融合蛋白包括HIV分化体B Gag蛋白和Pol蛋白(b)包括编码HIV分化体A Env蛋白的核酸的腺病毒载体，(c)包括编码HIV分化体B Env蛋白的核酸的腺病毒载体，和(d)包括编码HIV分化体C Env蛋白的核酸的腺病毒载体。
29.权利要求28的方法，其中包括HIV分化体B Gag蛋白和Pol蛋白的所述融合蛋白由核酸序列编码，所述核酸序列还编码HIV蛋白酶、反转录酶(RT)、和整合酶蛋白，并且其中所述核酸分子包括一种或多种点突变，其中的点突变使得蛋白酶，RT和整合酶蛋白没有功能。
30.权利要求28的方法，其中所述Env蛋白是gp140或gp140dv12。
31.权利要求1的方法，其中所述腺病毒载体组合物包括分别具有核酸序列SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，和SEQ ID NO7的4种腺病毒载体。
32.一种腺病毒载体组合物，其包括(a)包括编码融合蛋白的核酸的腺病毒载体，所述融合蛋白包括HIV分化体B Gag蛋白和Pol蛋白，(b)包括编码HIV分化体A Env蛋白的核酸的腺病毒载体，(c)包括编码HIV分化体B Env蛋白的核酸的腺病毒载体，和(d)包括编码HIV分化体CEnv蛋白的核酸的腺病毒载体。
33.权利要求32的腺病毒载体组合物，其中包括HIV分化体B Gag蛋白和Pol蛋白的所述融合蛋白由核酸序列编码，所述核酸序列还编码HIV蛋白酶、反转录酶(RT)、和整合酶蛋白，并且其中所述核酸分子包括一种或多种点突变，其中的点突变使得蛋白酶，RT和整合酶蛋白没有功能。
34.权利要求32的腺病毒载体组合物，其中所述Env蛋白为gp140或gp140dv12。
35.权利要求32的腺病毒载体组合物，其中(a)，(b)，(c)，和(d)分别具有核酸序列SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，和SEQ ID NO7。
36.权利要求32-35中任一项的腺病毒载体组合物，其中所述腺病毒载体是复制缺陷型。
37.权利要求36的腺病毒载体组合物，其中所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组E1区域的一种或多种必需的基因功能。
38.权利要求36或37的腺病毒载体组合物，其中所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组E4区域的一种或多种必需的基因功能。
39.权利要求32-38中任一项的腺病毒载体组合物，其中所述腺病毒载体缺失所述腺病毒基因组E3区域的一种或多种的基因功能。
40.权利要求32-39中任一项的腺病毒载体组合物，其中(a)，(b)，(c)，和(d)以3∶1∶1∶1重量比例存在于所述组合物中。
41.一种药物组合物，其包括权利要求32-40中任一项的腺病毒载体组合物和药用载体。
42.权利要求41的药物组合物，其中(a)，(b)，(c)，和(d)分别具有核酸序列SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，和SEQ ID NO7。
43.权利要求41或42的药物组合物，其包括大约1×108-1×1012个颗粒单位(pu)腺病毒载体。
44.权利要求43的药物组合物，其包括大约1×108-1×1010pu腺病毒载体。
45.权利要求43的药物组合物，其包括大约1×109-1×1011pu腺病毒载体。
46.权利要求43的药物组合物，其包括大约1×1010-1×1012pu腺病毒载体。
全文摘要
本发明提供在哺乳动物中诱导针对人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答的方法。本方法包括给哺乳动物施用腺病毒载体组合物，所述腺病毒载体组合物包括编码两种或多种不同HIV抗原的一种或多种腺病毒载体，所述抗原的产生在所述哺乳动物中诱导针对HIV的免疫应答。本发明还提供包括4种腺病毒载体的腺病毒载体组合物，所述4种腺病毒载体分别编码HIV分化体A Env蛋白，HIV分化体B Env蛋白，HIV分化体C Env蛋白，和包括HIV分化体B Gag蛋白和Pol蛋白的融合蛋白。
文档编号A61K39/21GK1972958SQ200580019211
公开日2007年5月30日 申请日期2005年4月12日 优先权日2004年4月12日
发明者G·J·内伯尔, 成程, 江咏培, J·G·D·贾森, C·R·金 申请人:美国政府卫生与公共服务部, 杰韦克公司