秦皮甲素眼用凝胶及其生产方法与应用的制作方法

专利名称：：秦皮甲素眼用凝胶及其生产方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种秦皮甲素眼用凝胶及其生产方法与应用。
背景技术：
：秦皮为木犀科植物苦枥白蜡树(Fraxi皿srhynchophy1laHance)、白蜡树(FraxinuschinensisRoxb.)、尖口十白蜡树(FraxinusszaboanaLingelsh.)或宿柱白蜡树(FraxinusstylosaLingelsh.)的干燥枝皮或干皮。秦皮中含秦皮甲素(C15H1609)。秦皮甲素别名马栗树皮苷、七叶亭苷，具有抗炎镇痛的功效，用于治疗传染性肝炎、急性胆道感染、铅中毒、清热解毒、胸闷呕恶、月市热咳嗽、月中瘤疮毒胎动不安等。
发明内容本发明的目的是提供一种秦皮甲素眼用凝胶及其生产方法与应用。本发明提供的秦皮甲素眼用凝胶，是用如下原料制备得到的4.8-5.2质量份秦皮甲素、35-45质量份硼酸、380-420质量份羟丙基甲基纤维素、180-220质量份海藻酸钠、23-27质量份富马酸二甲酯和49300-49350质量份水。所述秦皮甲素眼用凝胶，具体可为用如下原料制备得到的5质量份秦皮甲素、40质量份硼酸、400质量份羟丙基甲基纤维素、200质量份海藻酸钠、25质量份富马酸二甲酯和49330质量份水。所述的秦皮甲素眼用凝胶的制备方法如下将所述秦皮甲素用水溶解，过滤后收集滤液；将所述硼酸、所述羟丙基甲基纤维素、所述海藻酸钠、所述富马酸二甲酯用水溶解，灭菌后得到无菌基质；将所述滤液和所述无菌基质混合，加入水，得到秦皮甲素眼用凝胶。所述滤液可采用0.22iim微孔滤膜过滤。制备所述无菌基质时的灭菌条件可为12rC、104kPa、20min。所述秦皮甲素的制备方法具体包括如下步骤(1)将秦皮进行醇提，得到粗提液；(2)将步骤(1)的粗提液与乙酸乙酯混合，分层后弃乙酸乙酯层，得到萃取液；(3)将步骤(2)的萃取液进行羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，用水洗脱，收集秦皮甲素溶液和秦皮甲素_秦皮苷混合液；(4)将步骤(3)的秦皮甲素-秦皮苷混合液进行羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，用乙醇水溶液洗脱，收集秦皮甲素溶液；(5)将步骤(3)和步骤(4)的秦皮甲素溶液进行浓縮结晶，收集晶体；(6)用甲醇将步骤(5)的晶体进行重结晶，收集晶体；(7)将步骤(6)的晶体干燥后得到秦皮甲素。步骤(1)中，所述醇提可为将秦皮用95%(质量百分含量)乙醇水溶液65-75t:提取1.5-2.5小时；所述秦皮和所述95%乙醇水溶液的配比为lg秦皮5-7mL95%乙醇水溶液；所述醇提优选为将秦皮粉末用95%乙醇水溶液7(TC提取2小时；所述秦皮和所述95%乙醇水溶液的配比为lg秦皮6mL95%乙醇水溶液。步骤(1)中，进行所述醇提后，可55°C、0.lMPa蒸发，蒸发后体积为蒸发前体积的1/23-1/20，得到所述粗提液。步骤(2)中，所述粗提液和所述乙酸乙酯可等体积混合。步骤(3)中，可用蒸馏水洗脱，流速为3.5mL/min。步骤(4)中，可用20%(质量百分含量)乙醇水溶液洗脱，流速为3.5mL/min。步骤(3)和步骤(4)中，所述羟丙基葡聚糖凝胶柱具体可为羟丙基葡聚糖凝胶S印hadexLH_20。步骤(5)中，可将所述秦皮甲素溶液55°C、0.lMPa减压浓縮，0-4t:析晶。步骤(6)中，可在55t:水浴中将步骤(5)的晶体用甲醇溶解，过滤收集滤液，0_4°C析晶。本发明还保护一种治疗眼部炎症的药物，它的活性成分为以上任一所述的秦皮甲素眼用凝胶。本发明通过处方筛选和制剂技术，将秦皮甲素生产成为眼用凝胶制剂，用于治疗眼部炎症。本发明提供的秦皮甲素的提取方法，可以使产品的纯度达到99.4%。本发明得到的秦皮甲素眼用凝胶用于治疗眼部炎症，为首次提出，本品舒适度高，疗效确切。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。秦皮购于亳州市百全药业有限责任公司；硼酸购于上海火聚贸易有限公司；羟丙基甲基纤维素购于上海神恩实业发展有限公司；海藻酸钠购于青岛明月海藻集团有限公司；富马酸二甲酯购于上海欧乐化工有限公司。实施例1、秦皮甲素的制备1、醇提取500g秦皮粗粉，加入95X(质量百分含量)的乙醇3000ml，70。C提取2小时，过滤后得到粗提滤液。利用真空旋转蒸发仪将粗提滤液在55t:、0.lMPa的条件下减压除乙醇至无醇味，得到约140ml粗提液。2、萃取向粗提液中加入等体积的乙酸乙酯，保留水层、弃乙酸乙酯层，得萃取液。3、层析采用羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，步骤如下(1)预处理羟丙基葡聚糖凝胶S印hadexLH-20(购于上海源叶生物技术有限公司)，加乙醇，浸泡12小时，搅拌除去气泡后，倒入层析柱中，关闭活塞使羟丙基葡聚糖凝胶自然沉降，当沉降高出10cm时，打开活塞用乙醇洗脱，洗至洗脱液透明，换蒸馏水洗脱至无醇味，放出柱内多余的蒸馏水，待上样。层析柱直径3cm，胶床高38cm。(2)柱分离将步骤2的萃取液加入到预处理后的羟丙基葡聚糖凝胶层析柱上；以蒸馏水洗脱，流速3.5ml/min;以紫外灯检测，层析柱从下至上呈现蓝绿色荧光(秦皮甲素_秦皮苷混合液)、亮蓝色荧光(秦皮甲素溶液)、暗绿色荧光(秦皮素溶液)，分别收集呈现蓝绿色荧光的洗脱液和亮蓝色荧光的洗脱液；得到340ml秦皮甲素_秦皮苷混合液，670ml秦皮甲素溶液。4、再层析将秦皮甲素-秦皮苷混合液浓縮至200ml，重新上预处理后的羟丙基葡聚糖凝胶层析柱；用20%(质量百分含量)乙醇洗脱分离，流速3.5ml/min;紫外灯检测，收集亮蓝色荧光的洗脱液(秦皮甲素溶液)，得到520ml秦皮甲素溶液。5、析晶合并步骤3和步骤4得到的秦皮甲素溶液，55t:、0.lMPa减压浓縮至200ml，0_4°C析晶，过滤收集晶体。6、再结晶在55°C水浴中缓慢向晶体中加无水甲醇，边加边搅拌，直至晶体不再减少，过滤收集溶液，o-4t:析晶，过滤收集晶体。7、干燥将晶体IO(TC常压下干燥，得到158mg秦皮甲素单体。8、纯度检测(1)供试品制备避光操作，精密称取步骤7制备得到的秦皮甲素单体(样品)，每100iig样品加入lml水，得到溶液甲。(2)对照品制备避光操作，精密称取干燥恒重的秦皮甲素标准品(购于中国药品生物制品检定所)，每100iig标准品加入lml水，得到溶液乙。(3)分别检测溶液甲和溶液乙。检测方法用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-O.1%磷酸溶液(12:88)为流动相；检测波长为334nm;理论板数按秦皮甲素计算不低于8000。分别记录样品和标准品的色谱图。外标法计算峰面积，即为秦皮甲素的含量。样品相对于标准品的峰面积比即为样品的纯度。检测结果表明样品的纯度为99.4%。实施例2、秦皮甲素眼用凝胶的制备1、称取50mg实施例1制备的秦皮甲素，用200ml水溶解，溶液经过O.22um微孔滤膜过滤，收集滤液。2、称取400mg硼酸、4g羟丙基甲基纤维素、2g海藻酸钠、250mg富马酸二甲酯，用250ml水溶解，得基质；基质在12rC、104kPa压力下灭菌20min，得到无菌基质；3、将步骤1的滤液和步骤2的无菌基质混合，加水至500g，混匀，得到秦皮甲素眼用凝胶。将秦皮甲素眼用凝胶用铝管灌装，5g/支。上述步骤均在无菌条件下操作，所使用的器皿和铝管事先都进行无菌处理。实施例3、秦皮甲素眼用凝胶对眼部炎症的疗效—、制作碱烧伤模型兔模型采用日本大耳白家兔(辽宁医学院实验动物中心，合格证号辽实动质证字038号)，体重为2.53.5Kg，雌雄兼用，健康无眼病。用1%地卡因表面麻醉；将直径为8mm的6滤纸片(浸有0.5mol/LNaOH溶液)置于角膜表面中央；lmin后取下滤纸片；用灭菌生理盐水连续冲洗角膜2min;得到碱烧伤模型兔模型。二、秦皮甲素眼用凝胶对眼部炎症的疗效将碱烧伤模型兔模型随机均分成3组，每组10只，分别进行给药，具体如下第一组(空白对照组)滴加生理盐水，每日四次，每次一滴，滴入患眼；第二组(阳性对照组)滴加氧氟沙星滴眼液(沧州光明药业有限公司)，每日四次，每次一滴，滴入患眼；第三组(治疗组)滴加实施例2制备的秦皮甲素眼用凝胶，每日四次，每次一滴，滴入患眼。连续给药2周，观察供试品对碱烧伤造成的炎症和水肿的缓解能力，计算角膜上皮愈合率，以评价各供试品的治疗效果。计算角膜上皮愈合率采用荧光染色方法用20%荧光素钠无菌溶液一滴，滴入兔结膜囊内，使其被动闭眼5min，然后稍停片刻，如果眼内仍有较多的染料，可用生理盐水溶液冲洗除去之，分别于伤后0、1、2、3、5、7、10、14天进行裂隙灯检查，荧光素染色照相，照片经计算机图象分析系统处理，计算其角膜上皮愈合率。。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>角膜上皮损伤面积(着色面积)见表l。角膜上皮细胞愈合率(％)见表2。表1角膜上皮损伤面积(mm2，X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>[OO73]表2角膜上皮细胞愈合率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实验结果表明，阳性对照组和治疗组都能有效缓解炎症，促进创面愈合，治疗组的效果最好。实施例4、秦皮甲素眼用凝胶的眼部舒适度和利用度考察1、称取50mg实施例1制备的秦皮甲素，用200ml水溶解，溶液经过O.22um微孔滤膜过滤，收集滤液。2、称取400mg硼酸、羟丙基甲基纤维素(用量见表3)、海藻酸钠(用量见表4)、250mg富马酸二甲酯，用250ml水溶解，得基质；基质在121°C、104kPa压力下灭菌20min，得到无菌基质；3、将步骤1的滤液和步骤2的无菌基质混合，加水至500g，混匀，得到秦皮甲素眼用凝胶。表3四种样品中羟丙基甲基纤维素和海藻酸钠的添加量。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>考察四种样本的舒适度。舒适度评定标准(给药后15秒内眨眼次数)0-4次++++;4-6次+++;6-8次++;8次以上+。结果见表4。表4四种样本的舒适度<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其中样本2舒适度最好。权利要求一种秦皮甲素眼用凝胶，是用如下原料制备得到的4.8-5.2质量份秦皮甲素、35-45质量份硼酸、380-420质量份羟丙基甲基纤维素、180-220质量份海藻酸钠、23-27质量份富马酸二甲酯和49300-49350质量份水。2.如权利要求1所述的秦皮甲素眼用凝胶，其特征在于是用如下原料制备得到的5质量份秦皮甲素、40质量份硼酸、400质量份羟丙基甲基纤维素、200质量份海藻酸钠、25质量份富马酸二甲酯和49330质量份水。3.如权利要求1或2所述的秦皮甲素眼用凝胶，其特征在于是用如下方法制备的将所述秦皮甲素用水溶解，过滤后收集滤液；将所述硼酸、所述羟丙基甲基纤维素、所述海藻酸钠、所述富马酸二甲酯用水溶解，灭菌后得到无菌基质；将所述滤液和所述无菌基质混合，加入水，得到秦皮甲素眼用凝胶。4.如权利要求3所述的秦皮甲素眼用凝胶，其特征在于所述滤液采用0.22iim微孔滤膜过滤；制备所述无菌基质时的灭菌条件为12rC、104kPa、20min。5.如权利要求1至4中任一所述的秦皮甲素眼用凝胶，其特征在于所述秦皮甲素的制备方法包括如下步骤(1)将秦皮进行醇提，得到粗提液；(2)将步骤(1)的粗提液与乙酸乙酯混合，分层后弃乙酸乙酯层，得到萃取液；(3)将步骤(2)的萃取液进行羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，用水洗脱，收集秦皮甲素溶液和秦皮甲素-秦皮苷混合液；(4)将步骤(3)的秦皮甲素-秦皮苷混合液进行羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，用乙醇水溶液洗脱，收集秦皮甲素溶液；(5)将步骤(3)和步骤(4)的秦皮甲素溶液进行浓縮结晶，收集晶体；(6)用甲醇将步骤(5)的晶体进行重结晶，收集晶体；(7)将步骤(6)的晶体干燥后得到秦皮甲素。6.如权利要求5所述的秦皮甲素眼用凝胶，其特征在于步骤(1)中，所述醇提为将秦皮用95%(质量百分含量)乙醇水溶液65-75t:提取1.5-2.5小时；所述秦皮和所述95%乙醇水溶液的配比为lg秦皮5-7mL95%乙醇水溶液；所述醇提优选为将秦皮粉末用95%乙醇水溶液7(TC提取2小时；所述秦皮和所述95%乙醇水溶液的配比为lg秦皮6mL95%乙醇水溶液。7.如权利要求5或6所述的秦皮甲素眼用凝胶，其特征在于步骤(1)中，进行所述醇提后，55t:、0.lMPa蒸发，蒸发后体积为蒸发前体积的1/23-1/20，得到所述粗提液。8.如权利要求5至7中任一所述的秦皮甲素眼用凝胶，其特征在于步骤(2)中，所述粗提液和所述乙酸乙酯等体积混合；步骤(5)中，将所述秦皮甲素溶液55t:、0.lMPa减压浓縮，0-4t:析晶；步骤(6)中，55t:水浴中将步骤(5)的晶体用甲醇溶解，过滤收集滤液，0-4"析晶。9.如权利要求5至8中任一所述的秦皮甲素眼用凝胶，其特征在于步骤(3)中，用蒸馏水洗脱，流速为3.5mL/min;步骤(4)中，用20%(质量百分含量)乙醇水溶液洗脱，流速为3.5mL/min;步骤(3)和步骤(4)中，所述羟丙基葡聚糖凝胶柱为羟丙基葡聚糖凝胶S印hadexLH_20。10.—种治疗眼部炎症的药物，它的活性成分为权利要求1或9中任一所述的秦皮甲素眼用凝胶。全文摘要本发明公开了一种秦皮甲素眼用凝胶及其生产方法与应用。本发明提供的秦皮甲素眼用凝胶，是用如下原料制备得到的4.8-5.2质量份秦皮甲素、35-45质量份硼酸、380-420质量份羟丙基甲基纤维素、180-220质量份海藻酸钠、23-27质量份富马酸二甲酯、49300-49350质量份水。本发明通过处方筛选和制剂技术，将秦皮甲素生产成为眼用凝胶制剂，用于治疗眼部炎症。本发明提供的秦皮甲素的提取方法，可以使产品的纯度达到99.4％。本发明得到的秦皮甲素眼用凝胶用于治疗眼部炎症，为首次提出，本品舒适度高，疗效确切。文档编号A61K9/00GK101716133SQ200910242109公开日2010年6月2日申请日期2009年12月8日优先权日2009年12月8日发明者于洪儒申请人:于洪儒