委陵菜黄酮的提取分离纯化生产工艺的制作方法

专利名称：：委陵菜黄酮的提取分离纯化生产工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种委陵菜抗糖尿病有效成分-委陵菜黄酮的提取分离和纯化生产工艺，属于中药有效成分的提取和分离领域。
背景技术：
：中药委陵菜又名翻白菜，白头翁，蛤蟆草，天青地白，为蔷薇科(Rosaceae)植物委陵菜PotentillachinesisSer.的全草。本实验室根据中药委陵菜的临床应用，以中药化学结合药理学手段，从中药委陵菜中分离鉴定了一个具有抗糖尿病作用的化合物-委陵菜黄酮(下式)，其药效与二甲双胍相当，具有较高的临床应用价值。本发明为委陵菜黄酮的提取分离和纯化生产工艺。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式I委陵菜黄酮的结构目前中药生产中常用的提取方法为乙醇-水溶液加热回流提取法，但针对不同药材及目标化合物，所需条件有所不同，如乙醇溶液浓度、提取时间、提取次数等。需要利用单因素或正交试验考察具体条件。大孔吸附树脂色谱法是中药生产中较常用的分离方法。但根据目标化合物的理化性质，最佳分离色谱填料及分离条件均有不同，需要通过各种因素考察确定。本发明按照化学工艺研究方法，在提取工艺中，考察了提取溶剂浓度、提取时间、提取次数和不同料液比对委陵菜黄酮提取率和稳定性的影响，并通过正交试验确定了最佳提取工艺；在分离工艺中，考察了大孔吸附树脂(2种型号)和聚酰胺，通过静态吸附、动态吸附和解析率确定了分离色谱填料，再次考察了泄漏曲线和洗脱曲线、吸附流速和洗脱流速等因素对委陵菜黄酮分离效果的影响，以及二次色谱分离的效果，并进一步考察了上样料液比、色谱柱径高比对分离效果的影响，确立了最佳分离工艺；通过提取及分离，仍难以保证能够得到纯度较高的有效成分，还需要选择适当的纯化方法，将被分离物质纯化。本发明以近年来在天然产物分离纯化方面应用很多的新分离技术-高速逆流色谱对委陵菜黄酮进行纯化。高速逆流色谱(High-SpeedCounterCurrentChromatogr即hy，HSCCC)是一种连续高效的液_液分配色谱分离技术。该技术由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附引起的样品损失、失活、变性等，特别适合于天然生物活性成分的分离。在HSCCC纯化工艺中，考察了两种溶剂系统(石油醚_乙酸乙酯_甲醇_水，二氯甲烷_甲醇_水)和不同溶剂比例对纯化效果的影响，最后确立了二氯甲烷-甲醇-水溶剂系统(5:4:2)纯化委陵菜黄酮的工艺。
发明内容本发明的目的在于提供一种提取分离中药委陵菜有效成分委陵菜黄酮的生产工艺，为中药新药的开发提供一种提取效率高、产物纯度高以及安全的有效成分生产工艺。本发明是通过以下提取、分离和纯化技术方案加以实现的，其特征在于(1)提取工艺将采集的委陵菜自然干燥，粉碎成小于0.5厘米的短枝，按药材与乙醇水溶液质量比1:8的比例，以8倍量质量浓度60%乙醇浸泡过夜，加热回流提取1.5小时，过滤，然后以6倍量质量浓度60%乙醇回流提取1.5小时，过滤；然后再以6倍量质量浓度60%乙醇回流提取1.5小时，合并三次提取液，浓縮成流浸膏。(2)分离工艺将步骤(1)得到的流浸膏，按照重量比，以10倍量的质量浓度30%乙醇溶解，充分搅拌，3000r/min离心10min，取上清液，以20-60目AB-8大孔吸附树脂柱分离，10BV(10倍柱体积)上样，吸附流速为2BV/h，然后依次以3BV质量浓度30X乙醇、5BV质量浓度60%乙醇、4BV质量浓度95%乙醇洗脱，洗脱流速2BV/h，收集60%乙醇洗脱液，减压浓縮至无醇味，得到一混悬液A;然后以等体积30%乙醇溶解，充分搅拌，3000r/min离心10min，取上清液以80-100目聚酰胺色谱柱分离，IOBV上样，吸附流速为2BV/h，然后依次以3BV质量浓度30%乙醇、5BV质量浓度60%乙醇、4BV质量浓度95%乙醇洗脱，洗脱流速2BV/h，收集60%乙醇洗脱液，减压浓縮至无醇味，得到一混悬水溶液B。(3)纯化工艺将步骤(2)得到的混悬液B离心，3000r/min离心10min，离心沉淀以制备高速逆流色谱仪纯化溶剂系统(体积比)二氯甲烷甲醇水=5:4:2，以下相为固定相，上相为流动相，流速2ml/min，反转分离，转速800rpm，温度25°C，检测波长254nm，每次进样量500mg。收集流分在开始出峰时间后13min开始收集，收集20min时间段的洗脱流分。收集流分经减压浓縮除去有机溶剂得一含水混悬液，离心一黄色沉淀，以少量30%乙醇溶液润洗2次，即得委陵菜黄酮精品。通过本法制成的抗糖尿病有效成分委陵菜黄酮，可单独或与适宜的赋形剂等结合，按照常规方法制成口服剂型或非口服剂型(针剂、喷雾剂、贴剂等)，用于制备治疗糖尿病的药物。本发明人通过多年研究，开发出一整套由委陵菜植物制备如上式I所述委陵菜黄酮的工艺，与现有技术相比，本发明具有如下显著区别和有益效果1、现有技术中没有公开过完整的由委陵菜植物制备式I化合物的技术方案；2、现有技术中在分离步骤通常采用大孔树脂或聚酰胺柱，很少有将二者结合的方案，尤其是没有出现将二者结合后用于委陵菜黄酮分离的技术方案；3、现有技术中没有用高速逆流色谱纯化委陵菜黄酮的技术方案，由于不是每种目标物质都适合用高速逆流色谱分离，因此选择合适、有效的纯化手段需要本领域技术人员付出创造性的劳动；4、由于针对不同的目标物质所采用的洗脱系统一般是不同的，洗脱系统的差别将4直接影响洗脱的效果，本发明人意外地发现，采用本发明所限定的洗脱系统(包括大孔树脂、聚酰胺的梯度系统，HSCCC的洗脱系统)能够获得最佳的洗脱效果，使得在同等条件下，产物中委陵菜黄酮的含量最高，这样选择能够获得如此的效果是本领域技术人员无法预料的；5、对于生产工艺中其他条件和参数，例如色谱柱型号、溶剂用量、流速、上样量、收集时间等，发明人通过各种单因素考察进行了精心的选择，由此获得了最佳的产率，这也是本领域技术人员无法预测的。具体实施方式实施例1.取自然干燥，粉碎的天津蓟县产中药委陵菜25kg，加入200kg60%乙醇浸泡过夜，加热回流提取1.5小时，过滤，然后以150kg60%乙醇回流提取1.5小时，过滤；然后再以150kg60X乙醇回流提取1.5小时，合并三次提取液，浓縮得浸膏4.6kg，HPLC法测定委陵菜黄酮含量4.050%0。以上提取物以46kg30X乙醇溶解，充分搅拌，3000r/min离心10min，取上清液，以20-60目AB-8大孔吸附树脂柱分离，10BV上样，吸附流速为2BV/h，然后依次以3BV质量浓度30%乙醇、5BV质量浓度60%乙醇、4BV质量浓度95%乙醇洗脱，洗脱流速2BV/h，收集60X乙醇洗脱液，减压浓縮至无醇味，得到一混悬液A(该提取物中委陵菜黄酮含量为3.2%)。将所得混悬液A以等体积30%乙醇溶解，充分搅拌，3000r/min离心10min，取上清液以80-100目聚酰胺色谱柱分离，10BV上样，吸附流速为2BV/h，然后依次以3BV质量浓度30%乙醇、5BV质量浓度60%乙醇、4BV质量浓度95%乙醇洗脱，洗脱流速2BV/h，收集60%乙醇洗脱液，减压浓縮至无醇味，得到一混悬液B(该混合物中委陵菜黄酮的含量为12.5%)。将混悬液B离心，3000r/min离心10min，离心后的沉淀以制备高速逆流色谱仪(TBE-300A)纯化溶剂系统(体积比)二氯甲烷甲醇水=5:4:2，以下相为固定相，上相为流动相，流速2ml/min，反转分离，转速800rpm，温度25°C，检测波长254nm，每次进样量0.5g。收集流分在开始出峰时间后13min开始收集，收集20min时间段的洗脱流分。收集流分经减压浓縮除去有机溶剂得一含水混悬液，离心得黄色沉淀，以少量30%乙醇溶液润洗2次，即得委陵菜黄酮精品3.12g(HPLC测定委陵菜黄酮含量为94.5%，峰面积归一化法)。实施例2.取自然干燥，粉碎的天津蓟县产中药委陵菜30kg，加入240kg60X乙醇浸泡过夜，加热回流提取1.5小时，过滤，然后以180kg60%乙醇回流提取1.5小时，过滤；然后再以180kg60%乙醇回流提取1.5小时，合并三次提取液，浓縮得浸膏5.4kg，其中委陵菜黄酮含量4.022%。。以54kg30X乙醇溶解，充分搅拌，3000r/min离心10min，取上清液，以20-60目AB-8大孔吸附树脂柱分离，10BV上样，吸附流速为2BV/h，然后依次以3BV质量浓度30%乙醇、5BV质量浓度60%乙醇、4BV质量浓度95%乙醇洗脱，洗脱流速2BV/h，收集60%乙醇洗脱液，减压浓縮至无醇味，得到一含水混悬液A(该提取物中委陵菜黄酮含量为3.4%)。将所得混悬液以等体积30X乙醇溶解，充分搅拌，3000r/min离心10min，取上清液以聚酰胺色谱柱分离，10BV上样，吸附流速为2BV/h，然后依次以3BV质量浓度30%乙醇、5BV质量浓度60%乙醇、4BV质量浓度95%乙醇洗脱，洗脱流速2BV/h，收集60%乙醇洗脱液，减压浓縮至无醇味，得到一混悬液B(该分离组分中委陵菜黄酮的含量为12.1%)。将混悬液B离心，3000r/min离心10min，离心后的沉淀以制备高速逆流色谱仪(TBE-300A)纯化溶剂系统(体积比)二氯甲烷甲醇水=5:4:2，以下相为固定相，上相为流动相，流速2ml/min，反转分离，转速800rpm，温度25°C，检测波长254nm，每次进样量0.5g。收集流分在开始出峰时间后13min开始收集，收集20min时间段的洗脱流分。收集流分经减压浓縮除去有机溶剂得一含水混悬液，离心得黄色沉淀，以少量30%乙醇溶液润洗2次，即得委陵菜黄酮精品3.68g(HPLC测定委陵菜黄酮含量为92.8%，峰面积归一化法)。实施例3.取自然干燥，粉碎的天津蓟县产中药委陵菜35kg，加入280kg60X乙醇浸泡过夜，加热回流提取1.5小时，过滤，然后以210kg60%乙醇回流提取1.5小时，过滤；然后再以210kg60%乙醇回流提取1.5小时，合并三次提取液，浓縮得流浸膏6.lkg，其中委陵菜黄酮含量4.502%。。以61kg30X乙醇溶解，充分搅拌，3000r/min离心10min，取上清液，以AB-8大孔吸附树脂柱分离，10BV上样，吸附流速为2BV/h，然后依次以3BV质量浓度30%乙醇、5BV质量浓度60%乙醇、4BV质量浓度95%乙醇洗脱，洗脱流速2BV/h，收集60%乙醇洗脱液，减压浓縮至无醇味，得到的混悬液A(该提取物中委陵菜黄酮含量为3.6%)。将混悬液A以等体积30X乙醇溶解，充分搅拌，3000r/min离心10min，取上清液以聚酰胺色谱柱分离，IOBV上样，吸附流速为2BV/h，然后依次以3BV质量浓度30%乙醇、5BV质量浓度60%乙醇、4BV质量浓度95%乙醇洗脱，洗脱流速2BV/h，收集60%乙醇洗脱液，减压浓縮，得到混悬液B(该分离组分中委陵菜黄酮的含量达12.7%)。将混悬液B离心，3000r/min离心10min，离心后的沉淀以制备高速逆流色谱仪(TBE-300A)纯化溶剂系统(体积比)二氯甲烷甲醇水=5:4:2，以下相为固定相，上相为流动相，流速2ml/min，反转分离，转速800rpm，温度25°C，检测波长254nm，每次进样量0.5g。收集流分在开始出峰时间后13min开始收集，收集20min时间段的洗脱流分。收集流分经减压浓縮除去有机溶剂得一含水混悬液，离心得黄色沉淀，以少量30%乙醇溶液润洗2次，即得委陵菜黄酮精品4.46g(HPLC测定委陵菜黄酮含量为93.8%，峰面积归一化法)。附录实施例1-3最终产品_委陵菜黄酮的理化数据和药理评价1.委陵菜黄酮(式1)的理化数据黄色无定型粉末。UV356下有强烈的紫外吸收。ESI-MSm/z:593[M-H]—(C3。H25013)。HRESI-MS:m/z617.1284[M+Na]+calcd.617.1271，C30H26013Na;m/z593.1204[M-H]—，calcd.593.1295，C3。H25013.因此确定该化合物分子式为C3。H26013。^-NMR(CD30D)S:6.14(lH，brs，6—H)，6.31(1H，brs，8—H)，7.97(2H，d，J=8.7Hz，H-2—，6—)，6.82(2H，d，J=8.7Hz，H-3—，5—)，7.300(2H，d，J=8.8Hz，H-5——，9——)，6.79(2H，d，J=8.8Hz，H-6——，8——)，6.06(1H，d，J=15.9Hz，H-2——)，7.40(1H，d，J=15.9Hz，H-3——)，5.23(1H，d，J=7.8Hz，H-l—)，4.184.30(2H，m，)，3.50(2H，m)，3.32(lH，m，H-4—)。13C_NMR(CD3OD)苷元159.4，135.4，179.5，163.1，100.1，166.0，95.0，158.2，105.7，122.9，132.3，116.2，161.6，116.2，132.2;葡萄糖基104.2，78.2，75.8，71.9，75.9，64.4;反式对羟基桂皮酰基168.9，115.0，146.6，127.3，131.2，116.9，161.2，116.9,131.2。以上光谱数据与文献[SachikoT.，KyokoT.，MakiA.，etal，IsolationofCytochromeP450InhibitorsfromStrawberryFruit，Fragariaananassa，J.Nat.Prod.2004,67:18391841.]报道的山奈酚-3-0-P-D-(6-0-trans-对羟基桂皮酰基)葡萄糖甙波谱数据一致，因此，鉴定该化合物E式为山奈酚-3-0-13-D-(6-0-trans-对羟基桂皮酉先基)葡萄糖武(kaempferol_3_0_P_D_(6_0_trans_p_coumaroyl)glucopyranoside)。2.委陵菜黄酮的抗糖尿病药理评价2.1委陵菜降血糖有效成分量效关系考察2.1.1分组与给药选取正常小鼠，建立四氧嘧啶高血糖糖尿病小鼠模型，按血糖值均匀原则随机分成6组。分成模型对照组、二甲双胍阳性对照组(125mg/kg)以及本发明式I的委陵菜黄酮最高剂量(1.6mg/kg)、高剂量(0.8mg/kg)、中剂量(0.4mg/kg)、低剂量组(0.lmg/kg)。另设有正常对照组和正常给药组，正常对照组给予蒸馏水(10ml/kg)，正常给药组按0.4mg/kg剂量给予委陵菜黄酮，每组10只。以上各组每日灌胃l次，连续灌胃15天。用药治疗期间各组大鼠每日均饲以普通饲料，自由进食、饮水。2.1.2委陵菜黄酮对实验性糖尿病小鼠血糖的影响表1委陵菜黄酮对实验性糖尿病小鼠空腹血糖的影响(x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*与同时间模型组比较p<0.05，**与同时间模型组比较p<0.01，A与同时间反式低剂量组比较p<0.05可以看出，糖尿病小鼠各组经委陵菜黄酮治疗7天后，仅反式委陵菜黄酮1.6mg/kg剂量组与模型组比较，空腹血糖有显著性差异(P<0.05)，其余各组均无显著性差异。糖尿病小鼠各组经委陵菜黄酮治疗15天后，与给药前空腹血糖相比均显著降低(P<0.05，P<0.01)。给药后，反式委陵菜黄酮各剂量组与模型组比较空腹血糖亦显著降低(P<0.05，P<0.01)，并且反式委陵菜黄酮各组在降血糖作用上呈现一定的量效关系与时效关系。正常小鼠给药组同空白对照组及同组给药前比较均无显著性差异，说明反式委陵菜黄酮对正常小鼠的血糖水平不产生影响。2.1.3委陵菜黄酮对实验性糖尿病小鼠血脂的影响从表2可以看出，给药后，反式委陵菜黄酮4个剂量组和顺式组的总胆固醇浓度和甘油三酯浓度与模型组比较均有显著性差异(P<0.Ol，P<0.05)。反式四个不同剂量组的结果显示，随着剂量增加甘油三酯和总胆固醇水平的均值呈现逐步降低的趋势。而给药后反式委陵菜黄酮四个剂量组和顺式组同阳性对照组的两个指标比较均无显著性差异，说明在一定程度上，委陵菜黄酮可以达到盐酸二甲双胍在降低甘油三酯和总胆固醇浓度方面的效果。并且两个指标分别与空白对照组比较均无显著性差异，说明作用效果显著，可以部分纠正糖尿病造成的脂代谢异常。使糖尿病小鼠的甘油三酯和总胆固醇浓度达到正常小鼠的水平。正常小鼠给药组同空白对照组及同组给药前比较均无显著性差异，说明反式委陵菜黄酮对正常小鼠的总胆固醇和甘油三酯水平不产生影响。表2委陵菜黄酮对实验性糖尿病小鼠甘油三酯和总胆固醇的影响(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*与模型组比较p<0.05，**与模型组比较p<0.01，A与空白对照组比较p<0.05，AA与空白对照组比较p<0.0权利要求一种委陵菜有效成分黄酮化合物提取分离纯化工艺，所述的委陵菜抗糖尿病化学成分，其结构式如下所示上述的委陵菜黄酮的提取分离纯化工艺，其特征在于包括以下过程(1)将委陵菜粉碎，以委陵菜的质量8倍的质量浓度60％乙醇浸泡过夜，加热回流提取1.5小时，过滤的滤渣，再以委陵菜的质量6倍的质量浓度60％乙醇加热回流提取1.5小时，过滤的滤渣，再以委陵菜的质量6倍的质量浓度60％乙醇加热回流提取1.5小时，合并三次提取的滤液，减压蒸发浓缩至浸膏状物；(2)将步骤(1)得到的膏状物用10倍量质量浓度30％乙醇溶解，3000r/min离心10min，以20-60目的AB-8大孔吸附树脂柱分离，上样体积10BV(10倍柱体积)，吸附流速为2BV/h，然后以3BV30％乙醇，5BV60％乙醇，4BV95％乙醇依次洗脱，洗脱流速2BV/h，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，得一混悬液A；(3)将步骤(2)得到的混悬液A以等体积30％乙醇溶解，3000r/min离心10min，以80-100目聚酰胺色谱柱分离，上样体积10BV，吸附流速为2BV/h，然后以3BV30％乙醇，5BV60％乙醇，4BV95％乙醇依次洗脱，以洗脱流速2BV/h，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，得一混悬液B；(4)将步骤(3)得到的混悬液B离心，3000r/min离心10min，离心后的沉淀以制备高速逆流色谱仪纯化溶剂系统(体积比)二氯甲烷∶甲醇∶水＝5∶4∶2，以下相为固定相，上相为流动相，流速2ml/min，反转分离，转速800rpm，温度25℃，检测波长254nm。收集流分在开始出峰时间后13min开始收集，收集20min时间段的洗脱流分。收集流分经减压浓缩除去有机溶剂得一含水混悬液，离心得到一黄色沉淀，以少量30％乙醇溶液润洗2次，即得委陵菜黄酮精品。F2009102448613C00011.tif全文摘要本发明公开了一种中药委陵菜抗糖尿病作用化学成分-委陵菜黄酮的提取分离纯化工艺，属于中药有效成分提取分离工艺技术。所述化合物的结构如下所示该化合物的提取分离和纯化工艺，其过程包括将委陵菜粉碎，加60％乙醇以料液比8-6-6加热回流提取三次，过滤，合并滤液，减压蒸发浓缩至浸膏状物；然后以10倍量质量浓度30％乙醇溶解，3000r/min离心，上清液以20-60目的AB-8大孔吸附树脂柱分离，上样体积10BV(10倍柱体积)，吸附流速和洗脱流速为2BV/h，然后以3BV30％乙醇，5BV60％乙醇依次洗脱，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，得一混悬液A；然后以等体积30％乙醇溶解，离心，上清液以80-100目聚酰胺色谱柱分离，上样体积10BV，吸附和洗脱流速为2BV/h，以3BV30％乙醇，5BV60％乙醇依次洗脱，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，得一混悬液B；将混悬液B离心，离心后的沉淀以制备高速逆流色谱仪纯化溶剂系统(体积比)二氯甲烷∶甲醇∶水＝5∶4∶2，以下相为固定相，上相为流动相，流速2ml/min，反转分离，转速800rpm，检测波长254nm。收集流分在开始出峰时间后13min开始，收集20min时间段的洗脱流分，减压浓缩除去有机溶剂，离心得到黄色沉淀，以少量30％乙醇溶液润洗2次，即得委陵菜黄酮精品。文档编号A61P3/10GK101735292SQ20091024486公开日2010年6月16日申请日期2009年12月17日优先权日2009年12月17日发明者段宏泉,赵川申请人:天津医科大学