用于治疗癌症的包含存活蛋白寡核苷酸及吉西他滨的组合物的制作方法
专利名称：用于治疗癌症的包含存活蛋白寡核苷酸及吉西他滨的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用抗癌剂治疗癌症的方法。具体地，其涉及治疗性针对存活蛋白的反义寡核苷酸与化疗剂组合来增强化疗剂效力的应用。
背景技术：
存活蛋白是调节程序性细胞死亡和胞质分裂的程序性细胞死亡抑制剂(IAP)家族的蛋白质。存活蛋白通常在多种癌症中过量表达，但是在正常的相邻组织中极度缺乏。表达水平一般与肿瘤中程序性细胞死亡的减少相关。迄今，已经在肺肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、胃肿瘤、非霍奇金淋巴瘤和成神经细胞瘤中检测到存活蛋白的过量表达(Altieri，Nature Cancer Rev.，346-54(2002)；Adida等人.，Lancet351882-883(1998)；Ambrosini等人.，Nat.Med.3917-921(1997)；Lu等人.，Cancer Res.581808-1812(1998))。
在本文中全文引用的美国专利6,077,709和6,165,788公开了反义化合物，特别是反义寡核苷酸(ASO)，以及调节存活蛋白的表达或过量表达的方法。这些化合物可用于治疗癌症，所述癌症包括但不限于胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤，以及涉及角质形成细胞或成纤维细胞的癌症。本文中全文引用的美国专利6,335,194公开了针对存活蛋白的反义寡核苷酸和化疗剂组合的应用，所述化疗剂的作用机制完全不同与反义机制。
用针对存活蛋白的反义寡核苷酸阻止存活蛋白的表达将恢复默认的细胞死亡限制点，并且其本身或与化学疗法组合可选择性消灭癌细胞并改善临床效果。
本发明描述了通过使用存活蛋白反义核苷酸与其他抗癌剂的组合治疗以有利的或更好的方式治疗易感肿瘤(susceptible neoplasm)的发现。
发明概述本发明提供了可用于治疗癌症的方法，所述癌症包括但不限于肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤，以及涉及角质形成细胞和成纤维细胞的癌症。本发明的方法包括使用阻止存活蛋白的表达或过量表达的反义寡核苷酸及描述于美国专利5,464,826中的盐酸吉西他滨(gemcitabine HCl)。本发明也包括使用阻止存活蛋白的表达或过量表达的反义寡核苷酸及紫杉醇。本发明也包括使用阻止存活蛋白的表达或过量表达的反义寡核苷酸及盐酸阿霉素(doxorubicin HCl)。
令人惊讶地，我们已经发现抑制存活蛋白表达或过量表达的反义寡核苷酸与某种其他抗癌剂的组合导致与其中一种制剂单独治疗的肿瘤体积抑制之和更大的抑制。
可以用本发明的组合物和方法治疗的肿瘤类型包括下列中枢神经系统肿瘤多形性成胶质细胞瘤、星细胞瘤、少突胶质细胞肿瘤、室管膜和脉络丛肿瘤、松果体肿瘤、神经元肿瘤、成神经管细胞瘤、施旺细胞瘤、脑膜瘤、脑膜性肉瘤；眼肿瘤基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、横纹肌肉瘤、成视网膜细胞瘤；内分泌腺肿瘤垂体肿瘤、甲状腺肿瘤、肾上腺皮质肿瘤、神经内分泌系统肿瘤、胃肠胰内分泌系统肿瘤、生殖腺肿瘤；头和颈肿瘤头颈癌、口腔肿瘤、咽肿瘤、喉肿瘤、牙源性肿瘤；胸部肿瘤大细胞肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胸腔肿瘤、恶性间皮瘤、胸腺瘤、胸原发生殖细胞肿瘤；消化道肿瘤食道肿瘤、胃肿瘤、肝肿瘤、胆囊肿瘤、外分泌胰腺肿瘤、小肠肿瘤、不同型阑尾和腹膜肿瘤、结肠和直肠腺瘤、肛门肿瘤；泌尿生殖道肿瘤肾细胞癌、肾盂和输尿管肿瘤、膀胱肿瘤、尿道肿瘤、前列腺肿瘤、阴茎肿瘤、睾丸肿瘤；女性生殖器官肿瘤外阴和阴道肿瘤、子宫颈肿瘤、子宫本体腺癌、卵巢癌、妇科学肉瘤、乳腺肿瘤；皮肤肿瘤基底细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞肿瘤、恶性黑素瘤；骨和软组织肿瘤成骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文肉瘤、原始神经外胚层瘤、血管肉瘤；造血系统肿瘤骨髓增生异常综合征、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、HTLV-1和T细胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、肥大细胞白血病；和儿童肿瘤急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、成神经细胞瘤、骨肿瘤、横纹肌肉瘤、淋巴瘤、肾肿瘤。
如上所述的胰腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌以及淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)是本发明的组合物和方法优选治疗的疾病。本发明的组合物和方法更优选用于治疗肝细胞癌、膀胱癌、结直肠癌、胰腺癌和非霍奇金淋巴瘤。本发明的组合物和方法尤其可用于治疗肝细胞癌。
因此，本发明涉及治疗易感肿瘤的方法，其包括分别施用存活蛋白ASO和其他的抗癌剂。
在另一个的实施方案中，本发明涉及治疗易感肿瘤的方法，其包括同时施用存活蛋白ASO和其他的抗癌剂。
也就是说，本发明提供了施用存活蛋白ASO和其他的抗癌剂来治疗易感肿瘤。
在另一个方面，本发明提供了存活蛋白ASO和其他的抗癌剂在制备通过上述方法治疗易感肿瘤的药物中的应用。
因此，在另一个实施方案中，本发明涉及包含存活蛋白ASO和其他抗癌剂的药物组合物。也就是说，本发明提供了用于治疗的包含存活蛋白ASO和其他的抗癌剂的组合物。
发明详述在本发明的方法中，靶标RNA、靶标基因或其他靶标基因组多核苷酸区域是存活蛋白的靶标RNA、靶标基因或其他靶标基因组多核苷酸区域。本文使用的术语“靶标核苷酸”和“编码存活蛋白的核苷酸”包括存活蛋白的编码DNA、转录自该DNA的RNA(包括前-mRNA和mRNA或其部分)以及源于该RNA的cDNA。寡聚化合物与其靶标核苷酸的特异性杂交干扰了该核苷酸的正常功能。这种与靶标核酸特异杂交的化合物对靶标核酸功能的调节通常称为“反义”。
术语“存活蛋白反义寡核苷酸(存活蛋白ASO)”指的是修饰的或未修饰的化合物，其与下列序列具有至少70％的同源性5’-TGTGCTATTCTGTGAATT-3’。优选地，该修饰的或未修饰的化合物与下列序列具有至少80％的同源性5’-TGTGCTATTCTGTGAATT-3’。进一步优选地该修饰的或未修饰的化合物与下列序列具有至少90％，或更优选地，95％的同源性5’-TGTGCTATTCTGTGAATT-3’。最优选地，该修饰的或未修饰的化合物与下列序列具有至少99％的同源性5’-TGTGCTATTCTGTGAATT-3’。更特别地，术语“存活蛋白ASO”指的是与上述序列具有至少80％、90％、95％，或99％同源性的修饰化合物，其中每个核苷间连键为硫代磷酸酯键。尤其特别地，该修饰的化合物是与上述序列具有至少80％、90％、95％，或99％的同源性，其中每个核苷间连键为硫代磷酸酯键，其在5’末端的4个碱基和3’末端的4个碱基上进一步包括2’-O-甲氧基乙基(2’-甲氧基乙氧基)修饰。尤其特别地，该修饰化合物的胞苷残基包括5-甲基修饰。术语“存活蛋白ASO”最特别地是指下列序列5’-TGTGCTATTCTGTGAATT-3’的化合物，其中每个核苷间连键为硫代磷酸酯键，5’末端的4个碱基包括2’-O-甲氧基乙基修饰，3’末端的4个碱基包括2’-O-甲氧基乙基修饰，并且第5位和第10位的胞苷残基包括5-甲基修饰。进一步特别地，术语“存活蛋白ASO”指的是上述修饰化合物的钠盐。最优选地，术语“存活蛋白ASO”指的是下列化合物。
紫杉醇是分离自太平洋紫杉树Taxis Brevifolia的化疗剂，是萜类的taxane家族的成员(Wani等人.(1971)J.Am.Chem.Soc.932325)。紫杉醇衍生物的合成和抗癌活性的综述可见于Kingston等人.，Studies inOrganic Chemistry，第26卷，“New Trends in Natural ProductsChemistry 1986，”Attaur-Rahman和Le Quesne编著(Elsevier，Amsterdam，1986)第219-235页。
盐酸吉西他滨，具有抗肿瘤活性的核苷类似物，是2’-脱氧-2’，2’-二氟胞苷一氢氯化物(β-异构体)，也称为2’，2’-二氟-2’-脱氧胞苷一氢氯化物或称为1-(4-氨基-2-氧代-1H-嘧啶-1-基)-2-脱氧-2’，2’-二氟核糖。在其结构式描述如下 盐酸吉西他滨描述于美国专利5,464,826，其制备化合物的方法、配制化合物的方法和用该化合物治疗癌症的方法的公开在此引为参考。
盐酸阿霉素是广泛用作抗肿瘤剂的蒽环霉素抗生素。它分离自真菌波赛链霉菌青灰变种(Streptomyces peucetius var.caesius.)。盐酸阿霉素也可以通过本领域熟知的方法合成。文献参考包括Henry，D.W.，ACSSymposium Series，No.30，Cancer Chemotherapy，American ChemicalSociety(1976)第15-57页；和Arcamone，F.，Doxorubicin AnticancerAntibiotics(1981)New YorkAcademic Press.
术语“活性成分”指的是在本文中描述的存活蛋白ASO化合物。“活性成分”也指的是存活蛋白和其他的抗癌剂的组合。这种其他的抗癌剂的实例包括，但不限于紫杉醇、盐酸阿霉素和盐酸吉西他滨。因此，“活性成分”也指的是存活蛋白ASO和紫杉醇的组合、或存活蛋白ASO和盐酸吉西他滨的组合、或存活蛋白ASO和盐酸阿霉素的组合。
本文使用的术语“患者”指患有一种或多种与存活蛋白表达或过量表达相关的疾病的哺乳动物。可理解为最优选的患者是人，也可以理解本发明特别涉及抑制哺乳动物存活蛋白表达或过量表达。
本文使用的术语“可药用盐”是指本文中描述的化合物的盐。应当了解的是形成本发明任何盐的部分的具体反荷离子通常不是严格天然的，只要该盐作为整体是可药用的并且只要该反荷离子对整体的盐不起不利的作用即可。
术语“治疗(treatment，treating)”是指所有的过程，其中可以是减缓、中断、抑制、控制或终止本文描述的疾病的发展，但是不必是完全消除所有症状。
本文使用的术语“有效量”是指单剂量或多剂量施用的化合物的量或剂，其单独的或与其他抗癌剂组合，可有效治疗本文所述的疾病。
术语“治疗有效间隔”是一段时间，其开始于(a)存活蛋白ASO或(b)其他的抗癌剂给予患者，结束于(a)和(b)组合的抗癌有益效果的极限。
本发明实施中使用的术语“治疗有效组合”是指以任何顺序同时或分开施用(a)存活蛋白ASO和(b)其他的抗癌剂。因此，术语“治疗有效组合”指的是以任何顺序同时或分开施用(a)存活蛋白ASO和(b)盐酸吉西他滨。因此，术语“治疗有效组合”还指以任何顺序同时或分别施用(a)存活蛋白ASO和(b)紫杉醇。术语“治疗有效组合”还指以任何顺序同时或分别施用(a)存活蛋白ASO和(b)盐酸阿霉素。
当分别施用时，存活蛋白ASO和其他的抗癌剂可以以不同的时间表施用。只要在两次施用之间的时间属于治疗有效间隔，一种就可以在另一种之前施用。存活蛋白ASO和其他的抗癌剂的施用方法可以不同。因此，一种制剂可以口服，而另一种可以静脉内施用。一种产品以连续输注施用而另一种以分立剂型提供是可能的。特别重要的是抗癌药可以用已知的使其性能最优的方式给药。
抗癌剂一般与载体相混合，载体可作为稀释剂或赋形剂。抗癌剂可以以下列形式施用片剂、丸剂、散剂、锭剂、香囊、扁囊剂、酏剂、混悬液、乳剂、溶液剂、糖浆剂或气溶剂。也可使用无菌注射溶液。
在本发明的组合物和方法中使用的存活蛋白ASO和其他的抗癌剂通常有利地以盐的衍生物的形式使用，这是本发明的另一个方面。当本发明的化合物具有酸性基团或其他活性基团时，可形成比其在酸性形式中的母体化合物更易溶于水和/或生理上更适合的盐。代表性的可药用的盐包括，但不限于碱或碱土盐，例如锂、钠、钾、钙、镁、铝等。
钠盐为本文所述的存活蛋白ASO化合物的特别优选形式。通过在溶液中用碱处理酸的形式或使酸暴露于离子交换树脂可以方便的从游离酸制备盐。优选的，存活蛋白ASO最初作为铵盐在溶液中制备。之后通过离子交换或反相层析，和/或通过与钠盐在超滤膜上进行渗滤进行铵盐到钠盐的转化。
包括在可药用盐定义中的是本发明化合物的相对无毒的、无机的或有机的碱加成盐，例如，铵、季铵和来自充足碱度的含氮碱的胺阳离子形成本发明化合物的盐(例如参见，S.M.Berge等人.，“Pharmaceutical Salts，”J.Phar.Sci.，661-19(1977))。本发明的某些化合物可具有一个或多个手性中心并因此以旋光体存在。所有这种立体异构体与其混合物均希望包括在本发明内。如果需要特定的立体异构体，其可通过本领域熟知的方法制备，例如，通过与含有不对称中心且已分离(resolve)的原材料进行立体特异性反应，或者通过产生立体异构体混合物和随后用已知方法分离的方法。例如，外消旋混合物可以与某些其他化合物单一对映异构体反应。这将外消旋形式转变成非对映异构体的混合物。然后，因为非对映异构体具有不同的熔点、不同的沸点及不同的溶解度，它们可以通过常规的方法分离，如结晶。
本发明的组合物包含本文所述的治疗有效量的存活蛋白ASO和本文中提及的抗癌剂的组合。该组合物可以通过多种途径施用。在患有本文所述疾病的患者的有效治疗中，本发明的组合物可以以任何使有效量的活性成分是生物可利用的形式或方式施用，包括口服和胃肠道外途径。例如，本发明的组合物可以口服，通过吸入法或通过皮下、肌内、静脉内、经皮、鼻内、直肠、眼(occular)、局部、舌下、颊或其他途径施用。口服通常对于本文所述的疾病治疗是优选的。但是，口服并不是唯一优选的途径。例如，静脉内途径可优选作为方便的或避免口服相关的潜在并发症的方式。当组合物通过静脉内途径施用时，静脉内大丸剂和缓慢输注是优选的。
活性成分的有效量可由是本领域技术人员的主治诊断者，通过使用已知技术和观察类似情况下的结果来容易地确定。在确定施用化合物的有效量或剂量时，主治诊断者需要考虑许多因素，其包括但不限于哺乳动物的物种；其大小、年龄和全身健康状况；涉及的具体肿瘤；肿瘤的程度、影响或严重性；个体患者的反应；施用的具体化合物；施用方式；施用制剂的生物利用率特点；选择的剂量方案；相伴药物的应用；和其他相关情况。
最适剂量可根据活性成分的相对效力而不同。通常，剂量范围从每千克体重0.01μg到100g，并且可以每天、每星期、每月或每年一次或多次施用。基于测量的停留时间和活性成分在体液或组织中的浓度，本领域的技术人员可以确定给药的重复率。在单剂量治疗后，可期望让患者接受支持治疗，其中活性成以每千克体重0.01μg到100g范围的维持剂量施用，并且可以每天、每星期、每月或每年一次或多次施用。
下列实施例说明了本发明的方法以及用来证明本发明原理的化合物和组合物。试剂和原材料是本领域普通技术人员容易获得的。这些实施例仅仅为了说明，而不解释为任何方式来限制本发明的范围。
实施例实施例1下列化合物代表了可用于本发明方法和组合物的存活蛋白ASO化合物和其他的抗癌剂。这些组合物仅仅为了说明，而不在任何情况解释为任何方式来限制本发明的方法。
化合物I(存活蛋白ASO) 化合物I是用于抑制存活蛋白表达或过量表达的存活蛋白ASO。化合物I可以通过下列在美国专利第6,077,709号；第6,165,788号和第6,335,194号中描述的已知常规步骤制备，上述专利的全部内容在此全部引为参考。
化合物II(盐酸吉西他滨)2’-脱氧-2’，2’-二氟胞苷一氢氯化物(β-异构体)；或2’，2’-二氟-2’-脱氧胞苷一氢氯化物；或1-(4-氨基-2-氧代-1H-嘧啶-1-基)-2-脱氧-2’，2’-二氟核糖
盐酸吉西他滨描述于美国专利第5,464,826号，其制备化合物的方法、配制化合物的方法及用该化合物治疗癌症的方法的公开在此引为参考。
化合物III(紫杉醇)5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷(hexhydroxytax)-11-烯-9-酮4，10-二乙酸酯2-苯甲酸酯与(2R，3S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸的13-酯紫杉醇公开于美国专利第5,496,804号、第5,641,803号、第5,670,537号和第6,510,398号中，所述专利中合成、配制和使用紫杉醇治疗易感肿瘤的方法在此引为参考。紫杉醇也可购自Sigma-Aldrich Co。
化合物IV(盐酸阿霉素)5，12-并四苯二酮，10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏己吡喃基)氧]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟乙酰基)-1-甲氧基-氢氯化物盐酸阿霉素可通过本领域熟知的方法制备。盐酸阿霉素也可购自Sigma-Aldrich Co。
检测实施例1在此描述的基于细胞的胱天蛋白酶3检测通常用来测定抗癌剂，并且在前已有描述(参见Carrasco等人.，Bio Technique(2003)341064-1067)。该检测如下进行。
方法HeLa细胞获自ATCC，Manassas，VA且培养在补充了10％胎牛血清(Hyclone)、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠(Gibco/Invitrogen)，含L-谷胺酰胺培养基(Gibco/Invitrogen)的DMEM中。为了检测胱天蛋白酶3，用1×104细胞/孔铺96孔板。脂质转染试剂(GIBCO/Invitrogen)以3μL/ml OPTIMEM减少血清的培养基(Gibco/Invitrogen)/100nM化合物I的浓度使用。在加入化合物I之前将脂质转染试剂与OPTIMEM培养基孵育30分钟。加入50nM化合物I或其错配对照(MM对照)寡核苷酸并混合。细胞用1×磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，然后用OPTIMEM中的化合物I/脂质转染试剂混合物处理。培养4小时后，用完全生长培养基替换OPTIMEM培养基。转染24小时后，加入10nM盐酸吉西他滨或1.25nM紫杉醇再培养48小时。在培养结束时，每孔中加入含有150μM胱天蛋白酶3底物Ac-DEVD-AMC(Biomol)的3×裂解缓冲液(150mMHEPES pH7.4、150mM HEPES pH 7.4、450mM NaCl、150mM KCl、30mM MgCl2、1.2mM EGTA、1.5％ NP40、0.3％ CHAPS、30％蔗糖、30mM DTT和3.0mM PMSF)(50μL/孔)，并在37℃下孵育1小时。胱天蛋白酶3的活性通过使用平板读出荧光计(plate-reading flurometer)，在激发(波长)360nm和散发(波长)460nm下读出Ac-DEVD-AMC底物蛋白水解释放的荧光来测量。在减去平板背景后，比较相对荧光单位(RFU)与未处理的对照，表示为在胱天蛋白酶3活性增加百分数。
结果为了研究存活蛋白表达的下调是否使HeLa细胞对化疗敏感，测定用化合物I和盐酸吉西他滨、盐酸阿霉素或紫杉醇之一的组合治疗。HeLa细胞用化合物I或MM对照寡核苷酸转染24小时并用10nM盐酸吉西他滨或1.25nM紫杉醇再处理48小时。在孵育期末测量胱天蛋白酶3的活性。表1中的数据显示，用化合物I与盐酸吉西他滨或紫杉醇组合处理的肿瘤细胞产生了比每个单独制剂的胱天蛋白酶3的酶促活性之和更大的胱天蛋白酶3的酶促活性。数据表示为与未处理的对照相比的胱天蛋白酶3活性百分比。“S.E.M”指的是平均数的标准误差。MM对照寡核苷酸处理未使肿瘤细胞对盐酸吉西他滨或紫杉醇敏感。
表1
检测实施例2人异种移植肿瘤模型的使用之前已有描述，在本领域中是已知的。下列肿瘤类型可用于进行下文描述的检测。U-87MG人成胶质细胞瘤获得自ATCC(Manasas，VA，美国)(Kiaris等人.，Neoplasia(2000)2(3)242-50)。
方法对于异种移植研究，就在移植前照射动物(450TBI(全身照射))，且细胞与matrigel混合(1∶1)。0.2mL体积的6×106U-87MG肿瘤细胞全部皮下(s.c.)注射到左后腰。当肿瘤体积达到约100mg时，用首次负荷剂量为50mg/kg的化合物I或MM对照寡核苷酸开始处理。在其他天施用化合物I或MM对照寡核苷酸的所有随后静脉内剂量(25mg/kg)。在负荷剂量一天后，开始用盐酸吉西他滨、盐酸阿霉素或紫杉醇的次最优剂量处理。盐酸吉西他滨每三天以2.5mg/kg腹膜内施用，共四剂。紫杉醇每四天以1mg/kg静脉内施用，共四剂。
每周两次进行二维测量，根据下列公式计算肿瘤体积(肿瘤体积)＝[(长度)(宽度2)(II/6)]。肿瘤体积数据转换成对数比例以平衡时间和处理组的差异。数据使用SAS PROC MIXED软件(SAS Institute，Inc.，Cary，N.C.)，以时间和处理差异的双向分析来分析。对于重复测量的优选相关模型是AR(顺序1自动回归(Auto Regressive of order 1))。
在每个时间点比较处理组。以每个处理组的平均数和标准误差对时间的数据作图。组合治疗中协同的存在以肿瘤生长延迟(TGD)度来评定。测定每个动物达到特定肿瘤尺寸(在此研究中为1500或2000或2500mg)的时间。没有达到那个尺寸的肿瘤包括在作为右删失值(right-censoredvalue)的分析中。假定为Weibull分布的最大似然分析用于计算每个处理组的平均时间和标准偏差。肿瘤生长延迟是每个处理组和对照组之间平均时间的差。如果组合治疗TGD显著高于个体治疗TGD的总和，则认为组合治疗具有协同作用。
结果表2中的数据显示化合物I和盐酸吉西他滨组合的效果。与任一化合物单独相比，组合产生统计上显著的(p＝0.0092)肿瘤生长延迟。因此，化合物I和盐酸吉西他滨的组合导致比肿瘤生长延迟之和多3到4.6天。
表2
序列表<110>伊莱利利公司<120>治疗癌症的组合疗法<130>X-16613<150>60/564540<151>2004-04-22<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的构建体<400>1tgtgctattc tgtgaatt18
权利要求
1.一种包含有效量的存活蛋白反义寡核苷酸和有效量的盐酸吉西他滨的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述存活蛋白反义寡核苷酸是化合物I。
3.包含存活蛋白反义寡核苷酸和盐酸吉西他滨的组合物在制备用于治疗癌症患者的药物中的应用。
4.一种治疗癌症患者的方法，其包括给予所述患者存活蛋白反义寡核苷酸和盐酸吉西他滨的治疗有效组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述存活蛋白反义寡核苷酸和盐酸吉西他滨在治疗有效间隔内分别施用。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述存活蛋白反义寡核苷酸是化合物I。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞癌、结直肠癌和淋巴瘤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述癌症是肝细胞癌。
9.一种存活蛋白反义寡核苷酸和盐酸吉西他滨的治疗有效组合在治疗癌症患者中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述存活蛋白反义寡核苷酸和盐酸吉西他滨在治疗有效间隔内分别施用。
11.根据权利要求10所述的应用，其中所述存活蛋白反义寡核苷酸是化合物I。
12.根据权利要求10或11所述的应用，其中所述癌症选自胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞癌、结直肠癌和淋巴瘤。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述癌症为肝细胞癌。
全文摘要
本发明涉及在患者中治疗癌症的方法，其包括施用有效量的存活蛋白反义寡核苷酸与有效量的盐酸吉西他滨。
文档编号A61P35/00GK1950094SQ200580011826
公开日2007年4月18日 申请日期2005年4月15日 优先权日2004年4月22日
发明者B·K·帕特尔 申请人:伊莱利利公司
技术领域：
本发明涉及用抗癌剂治疗癌症的方法。具体地，其涉及治疗性针对存活蛋白的反义寡核苷酸与化疗剂组合来增强化疗剂效力的应用。
背景技术：
存活蛋白是调节程序性细胞死亡和胞质分裂的程序性细胞死亡抑制剂(IAP)家族的蛋白质。存活蛋白通常在多种癌症中过量表达，但是在正常的相邻组织中极度缺乏。表达水平一般与肿瘤中程序性细胞死亡的减少相关。迄今，已经在肺肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、胃肿瘤、非霍奇金淋巴瘤和成神经细胞瘤中检测到存活蛋白的过量表达(Altieri，Nature Cancer Rev.，346-54(2002)；Adida等人.，Lancet351882-883(1998)；Ambrosini等人.，Nat.Med.3917-921(1997)；Lu等人.，Cancer Res.581808-1812(1998))。
在本文中全文引用的美国专利6,077,709和6,165,788公开了反义化合物，特别是反义寡核苷酸(ASO)，以及调节存活蛋白的表达或过量表达的方法。这些化合物可用于治疗癌症，所述癌症包括但不限于胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤，以及涉及角质形成细胞或成纤维细胞的癌症。本文中全文引用的美国专利6,335,194公开了针对存活蛋白的反义寡核苷酸和化疗剂组合的应用，所述化疗剂的作用机制完全不同与反义机制。
用针对存活蛋白的反义寡核苷酸阻止存活蛋白的表达将恢复默认的细胞死亡限制点，并且其本身或与化学疗法组合可选择性消灭癌细胞并改善临床效果。
本发明描述了通过使用存活蛋白反义核苷酸与其他抗癌剂的组合治疗以有利的或更好的方式治疗易感肿瘤(susceptible neoplasm)的发现。
发明概述本发明提供了可用于治疗癌症的方法，所述癌症包括但不限于肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤，以及涉及角质形成细胞和成纤维细胞的癌症。本发明的方法包括使用阻止存活蛋白的表达或过量表达的反义寡核苷酸及描述于美国专利5,464,826中的盐酸吉西他滨(gemcitabine HCl)。本发明也包括使用阻止存活蛋白的表达或过量表达的反义寡核苷酸及紫杉醇。本发明也包括使用阻止存活蛋白的表达或过量表达的反义寡核苷酸及盐酸阿霉素(doxorubicin HCl)。
令人惊讶地，我们已经发现抑制存活蛋白表达或过量表达的反义寡核苷酸与某种其他抗癌剂的组合导致与其中一种制剂单独治疗的肿瘤体积抑制之和更大的抑制。
可以用本发明的组合物和方法治疗的肿瘤类型包括下列中枢神经系统肿瘤多形性成胶质细胞瘤、星细胞瘤、少突胶质细胞肿瘤、室管膜和脉络丛肿瘤、松果体肿瘤、神经元肿瘤、成神经管细胞瘤、施旺细胞瘤、脑膜瘤、脑膜性肉瘤；眼肿瘤基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、横纹肌肉瘤、成视网膜细胞瘤；内分泌腺肿瘤垂体肿瘤、甲状腺肿瘤、肾上腺皮质肿瘤、神经内分泌系统肿瘤、胃肠胰内分泌系统肿瘤、生殖腺肿瘤；头和颈肿瘤头颈癌、口腔肿瘤、咽肿瘤、喉肿瘤、牙源性肿瘤；胸部肿瘤大细胞肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胸腔肿瘤、恶性间皮瘤、胸腺瘤、胸原发生殖细胞肿瘤；消化道肿瘤食道肿瘤、胃肿瘤、肝肿瘤、胆囊肿瘤、外分泌胰腺肿瘤、小肠肿瘤、不同型阑尾和腹膜肿瘤、结肠和直肠腺瘤、肛门肿瘤；泌尿生殖道肿瘤肾细胞癌、肾盂和输尿管肿瘤、膀胱肿瘤、尿道肿瘤、前列腺肿瘤、阴茎肿瘤、睾丸肿瘤；女性生殖器官肿瘤外阴和阴道肿瘤、子宫颈肿瘤、子宫本体腺癌、卵巢癌、妇科学肉瘤、乳腺肿瘤；皮肤肿瘤基底细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞肿瘤、恶性黑素瘤；骨和软组织肿瘤成骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文肉瘤、原始神经外胚层瘤、血管肉瘤；造血系统肿瘤骨髓增生异常综合征、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、HTLV-1和T细胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、肥大细胞白血病；和儿童肿瘤急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、成神经细胞瘤、骨肿瘤、横纹肌肉瘤、淋巴瘤、肾肿瘤。
如上所述的胰腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌以及淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)是本发明的组合物和方法优选治疗的疾病。本发明的组合物和方法更优选用于治疗肝细胞癌、膀胱癌、结直肠癌、胰腺癌和非霍奇金淋巴瘤。本发明的组合物和方法尤其可用于治疗肝细胞癌。
因此，本发明涉及治疗易感肿瘤的方法，其包括分别施用存活蛋白ASO和其他的抗癌剂。
在另一个的实施方案中，本发明涉及治疗易感肿瘤的方法，其包括同时施用存活蛋白ASO和其他的抗癌剂。
也就是说，本发明提供了施用存活蛋白ASO和其他的抗癌剂来治疗易感肿瘤。
在另一个方面，本发明提供了存活蛋白ASO和其他的抗癌剂在制备通过上述方法治疗易感肿瘤的药物中的应用。
因此，在另一个实施方案中，本发明涉及包含存活蛋白ASO和其他抗癌剂的药物组合物。也就是说，本发明提供了用于治疗的包含存活蛋白ASO和其他的抗癌剂的组合物。
发明详述在本发明的方法中，靶标RNA、靶标基因或其他靶标基因组多核苷酸区域是存活蛋白的靶标RNA、靶标基因或其他靶标基因组多核苷酸区域。本文使用的术语“靶标核苷酸”和“编码存活蛋白的核苷酸”包括存活蛋白的编码DNA、转录自该DNA的RNA(包括前-mRNA和mRNA或其部分)以及源于该RNA的cDNA。寡聚化合物与其靶标核苷酸的特异性杂交干扰了该核苷酸的正常功能。这种与靶标核酸特异杂交的化合物对靶标核酸功能的调节通常称为“反义”。
术语“存活蛋白反义寡核苷酸(存活蛋白ASO)”指的是修饰的或未修饰的化合物，其与下列序列具有至少70％的同源性5’-TGTGCTATTCTGTGAATT-3’。优选地，该修饰的或未修饰的化合物与下列序列具有至少80％的同源性5’-TGTGCTATTCTGTGAATT-3’。进一步优选地该修饰的或未修饰的化合物与下列序列具有至少90％，或更优选地，95％的同源性5’-TGTGCTATTCTGTGAATT-3’。最优选地，该修饰的或未修饰的化合物与下列序列具有至少99％的同源性5’-TGTGCTATTCTGTGAATT-3’。更特别地，术语“存活蛋白ASO”指的是与上述序列具有至少80％、90％、95％，或99％同源性的修饰化合物，其中每个核苷间连键为硫代磷酸酯键。尤其特别地，该修饰的化合物是与上述序列具有至少80％、90％、95％，或99％的同源性，其中每个核苷间连键为硫代磷酸酯键，其在5’末端的4个碱基和3’末端的4个碱基上进一步包括2’-O-甲氧基乙基(2’-甲氧基乙氧基)修饰。尤其特别地，该修饰化合物的胞苷残基包括5-甲基修饰。术语“存活蛋白ASO”最特别地是指下列序列5’-TGTGCTATTCTGTGAATT-3’的化合物，其中每个核苷间连键为硫代磷酸酯键，5’末端的4个碱基包括2’-O-甲氧基乙基修饰，3’末端的4个碱基包括2’-O-甲氧基乙基修饰，并且第5位和第10位的胞苷残基包括5-甲基修饰。进一步特别地，术语“存活蛋白ASO”指的是上述修饰化合物的钠盐。最优选地，术语“存活蛋白ASO”指的是下列化合物。
紫杉醇是分离自太平洋紫杉树Taxis Brevifolia的化疗剂，是萜类的taxane家族的成员(Wani等人.(1971)J.Am.Chem.Soc.932325)。紫杉醇衍生物的合成和抗癌活性的综述可见于Kingston等人.，Studies inOrganic Chemistry，第26卷，“New Trends in Natural ProductsChemistry 1986，”Attaur-Rahman和Le Quesne编著(Elsevier，Amsterdam，1986)第219-235页。
盐酸吉西他滨，具有抗肿瘤活性的核苷类似物，是2’-脱氧-2’，2’-二氟胞苷一氢氯化物(β-异构体)，也称为2’，2’-二氟-2’-脱氧胞苷一氢氯化物或称为1-(4-氨基-2-氧代-1H-嘧啶-1-基)-2-脱氧-2’，2’-二氟核糖。在其结构式描述如下 盐酸吉西他滨描述于美国专利5,464,826，其制备化合物的方法、配制化合物的方法和用该化合物治疗癌症的方法的公开在此引为参考。
盐酸阿霉素是广泛用作抗肿瘤剂的蒽环霉素抗生素。它分离自真菌波赛链霉菌青灰变种(Streptomyces peucetius var.caesius.)。盐酸阿霉素也可以通过本领域熟知的方法合成。文献参考包括Henry，D.W.，ACSSymposium Series，No.30，Cancer Chemotherapy，American ChemicalSociety(1976)第15-57页；和Arcamone，F.，Doxorubicin AnticancerAntibiotics(1981)New YorkAcademic Press.
术语“活性成分”指的是在本文中描述的存活蛋白ASO化合物。“活性成分”也指的是存活蛋白和其他的抗癌剂的组合。这种其他的抗癌剂的实例包括，但不限于紫杉醇、盐酸阿霉素和盐酸吉西他滨。因此，“活性成分”也指的是存活蛋白ASO和紫杉醇的组合、或存活蛋白ASO和盐酸吉西他滨的组合、或存活蛋白ASO和盐酸阿霉素的组合。
本文使用的术语“患者”指患有一种或多种与存活蛋白表达或过量表达相关的疾病的哺乳动物。可理解为最优选的患者是人，也可以理解本发明特别涉及抑制哺乳动物存活蛋白表达或过量表达。
本文使用的术语“可药用盐”是指本文中描述的化合物的盐。应当了解的是形成本发明任何盐的部分的具体反荷离子通常不是严格天然的，只要该盐作为整体是可药用的并且只要该反荷离子对整体的盐不起不利的作用即可。
术语“治疗(treatment，treating)”是指所有的过程，其中可以是减缓、中断、抑制、控制或终止本文描述的疾病的发展，但是不必是完全消除所有症状。
本文使用的术语“有效量”是指单剂量或多剂量施用的化合物的量或剂，其单独的或与其他抗癌剂组合，可有效治疗本文所述的疾病。
术语“治疗有效间隔”是一段时间，其开始于(a)存活蛋白ASO或(b)其他的抗癌剂给予患者，结束于(a)和(b)组合的抗癌有益效果的极限。
本发明实施中使用的术语“治疗有效组合”是指以任何顺序同时或分开施用(a)存活蛋白ASO和(b)其他的抗癌剂。因此，术语“治疗有效组合”指的是以任何顺序同时或分开施用(a)存活蛋白ASO和(b)盐酸吉西他滨。因此，术语“治疗有效组合”还指以任何顺序同时或分别施用(a)存活蛋白ASO和(b)紫杉醇。术语“治疗有效组合”还指以任何顺序同时或分别施用(a)存活蛋白ASO和(b)盐酸阿霉素。
当分别施用时，存活蛋白ASO和其他的抗癌剂可以以不同的时间表施用。只要在两次施用之间的时间属于治疗有效间隔，一种就可以在另一种之前施用。存活蛋白ASO和其他的抗癌剂的施用方法可以不同。因此，一种制剂可以口服，而另一种可以静脉内施用。一种产品以连续输注施用而另一种以分立剂型提供是可能的。特别重要的是抗癌药可以用已知的使其性能最优的方式给药。
抗癌剂一般与载体相混合，载体可作为稀释剂或赋形剂。抗癌剂可以以下列形式施用片剂、丸剂、散剂、锭剂、香囊、扁囊剂、酏剂、混悬液、乳剂、溶液剂、糖浆剂或气溶剂。也可使用无菌注射溶液。
在本发明的组合物和方法中使用的存活蛋白ASO和其他的抗癌剂通常有利地以盐的衍生物的形式使用，这是本发明的另一个方面。当本发明的化合物具有酸性基团或其他活性基团时，可形成比其在酸性形式中的母体化合物更易溶于水和/或生理上更适合的盐。代表性的可药用的盐包括，但不限于碱或碱土盐，例如锂、钠、钾、钙、镁、铝等。
钠盐为本文所述的存活蛋白ASO化合物的特别优选形式。通过在溶液中用碱处理酸的形式或使酸暴露于离子交换树脂可以方便的从游离酸制备盐。优选的，存活蛋白ASO最初作为铵盐在溶液中制备。之后通过离子交换或反相层析，和/或通过与钠盐在超滤膜上进行渗滤进行铵盐到钠盐的转化。
包括在可药用盐定义中的是本发明化合物的相对无毒的、无机的或有机的碱加成盐，例如，铵、季铵和来自充足碱度的含氮碱的胺阳离子形成本发明化合物的盐(例如参见，S.M.Berge等人.，“Pharmaceutical Salts，”J.Phar.Sci.，661-19(1977))。本发明的某些化合物可具有一个或多个手性中心并因此以旋光体存在。所有这种立体异构体与其混合物均希望包括在本发明内。如果需要特定的立体异构体，其可通过本领域熟知的方法制备，例如，通过与含有不对称中心且已分离(resolve)的原材料进行立体特异性反应，或者通过产生立体异构体混合物和随后用已知方法分离的方法。例如，外消旋混合物可以与某些其他化合物单一对映异构体反应。这将外消旋形式转变成非对映异构体的混合物。然后，因为非对映异构体具有不同的熔点、不同的沸点及不同的溶解度，它们可以通过常规的方法分离，如结晶。
本发明的组合物包含本文所述的治疗有效量的存活蛋白ASO和本文中提及的抗癌剂的组合。该组合物可以通过多种途径施用。在患有本文所述疾病的患者的有效治疗中，本发明的组合物可以以任何使有效量的活性成分是生物可利用的形式或方式施用，包括口服和胃肠道外途径。例如，本发明的组合物可以口服，通过吸入法或通过皮下、肌内、静脉内、经皮、鼻内、直肠、眼(occular)、局部、舌下、颊或其他途径施用。口服通常对于本文所述的疾病治疗是优选的。但是，口服并不是唯一优选的途径。例如，静脉内途径可优选作为方便的或避免口服相关的潜在并发症的方式。当组合物通过静脉内途径施用时，静脉内大丸剂和缓慢输注是优选的。
活性成分的有效量可由是本领域技术人员的主治诊断者，通过使用已知技术和观察类似情况下的结果来容易地确定。在确定施用化合物的有效量或剂量时，主治诊断者需要考虑许多因素，其包括但不限于哺乳动物的物种；其大小、年龄和全身健康状况；涉及的具体肿瘤；肿瘤的程度、影响或严重性；个体患者的反应；施用的具体化合物；施用方式；施用制剂的生物利用率特点；选择的剂量方案；相伴药物的应用；和其他相关情况。
最适剂量可根据活性成分的相对效力而不同。通常，剂量范围从每千克体重0.01μg到100g，并且可以每天、每星期、每月或每年一次或多次施用。基于测量的停留时间和活性成分在体液或组织中的浓度，本领域的技术人员可以确定给药的重复率。在单剂量治疗后，可期望让患者接受支持治疗，其中活性成以每千克体重0.01μg到100g范围的维持剂量施用，并且可以每天、每星期、每月或每年一次或多次施用。
下列实施例说明了本发明的方法以及用来证明本发明原理的化合物和组合物。试剂和原材料是本领域普通技术人员容易获得的。这些实施例仅仅为了说明，而不解释为任何方式来限制本发明的范围。
实施例实施例1下列化合物代表了可用于本发明方法和组合物的存活蛋白ASO化合物和其他的抗癌剂。这些组合物仅仅为了说明，而不在任何情况解释为任何方式来限制本发明的方法。
化合物I(存活蛋白ASO) 化合物I是用于抑制存活蛋白表达或过量表达的存活蛋白ASO。化合物I可以通过下列在美国专利第6,077,709号；第6,165,788号和第6,335,194号中描述的已知常规步骤制备，上述专利的全部内容在此全部引为参考。
化合物II(盐酸吉西他滨)2’-脱氧-2’，2’-二氟胞苷一氢氯化物(β-异构体)；或2’，2’-二氟-2’-脱氧胞苷一氢氯化物；或1-(4-氨基-2-氧代-1H-嘧啶-1-基)-2-脱氧-2’，2’-二氟核糖
盐酸吉西他滨描述于美国专利第5,464,826号，其制备化合物的方法、配制化合物的方法及用该化合物治疗癌症的方法的公开在此引为参考。
化合物III(紫杉醇)5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷(hexhydroxytax)-11-烯-9-酮4，10-二乙酸酯2-苯甲酸酯与(2R，3S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸的13-酯紫杉醇公开于美国专利第5,496,804号、第5,641,803号、第5,670,537号和第6,510,398号中，所述专利中合成、配制和使用紫杉醇治疗易感肿瘤的方法在此引为参考。紫杉醇也可购自Sigma-Aldrich Co。
化合物IV(盐酸阿霉素)5，12-并四苯二酮，10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏己吡喃基)氧]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟乙酰基)-1-甲氧基-氢氯化物盐酸阿霉素可通过本领域熟知的方法制备。盐酸阿霉素也可购自Sigma-Aldrich Co。
检测实施例1在此描述的基于细胞的胱天蛋白酶3检测通常用来测定抗癌剂，并且在前已有描述(参见Carrasco等人.，Bio Technique(2003)341064-1067)。该检测如下进行。
方法HeLa细胞获自ATCC，Manassas，VA且培养在补充了10％胎牛血清(Hyclone)、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠(Gibco/Invitrogen)，含L-谷胺酰胺培养基(Gibco/Invitrogen)的DMEM中。为了检测胱天蛋白酶3，用1×104细胞/孔铺96孔板。脂质转染试剂(GIBCO/Invitrogen)以3μL/ml OPTIMEM减少血清的培养基(Gibco/Invitrogen)/100nM化合物I的浓度使用。在加入化合物I之前将脂质转染试剂与OPTIMEM培养基孵育30分钟。加入50nM化合物I或其错配对照(MM对照)寡核苷酸并混合。细胞用1×磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，然后用OPTIMEM中的化合物I/脂质转染试剂混合物处理。培养4小时后，用完全生长培养基替换OPTIMEM培养基。转染24小时后，加入10nM盐酸吉西他滨或1.25nM紫杉醇再培养48小时。在培养结束时，每孔中加入含有150μM胱天蛋白酶3底物Ac-DEVD-AMC(Biomol)的3×裂解缓冲液(150mMHEPES pH7.4、150mM HEPES pH 7.4、450mM NaCl、150mM KCl、30mM MgCl2、1.2mM EGTA、1.5％ NP40、0.3％ CHAPS、30％蔗糖、30mM DTT和3.0mM PMSF)(50μL/孔)，并在37℃下孵育1小时。胱天蛋白酶3的活性通过使用平板读出荧光计(plate-reading flurometer)，在激发(波长)360nm和散发(波长)460nm下读出Ac-DEVD-AMC底物蛋白水解释放的荧光来测量。在减去平板背景后，比较相对荧光单位(RFU)与未处理的对照，表示为在胱天蛋白酶3活性增加百分数。
结果为了研究存活蛋白表达的下调是否使HeLa细胞对化疗敏感，测定用化合物I和盐酸吉西他滨、盐酸阿霉素或紫杉醇之一的组合治疗。HeLa细胞用化合物I或MM对照寡核苷酸转染24小时并用10nM盐酸吉西他滨或1.25nM紫杉醇再处理48小时。在孵育期末测量胱天蛋白酶3的活性。表1中的数据显示，用化合物I与盐酸吉西他滨或紫杉醇组合处理的肿瘤细胞产生了比每个单独制剂的胱天蛋白酶3的酶促活性之和更大的胱天蛋白酶3的酶促活性。数据表示为与未处理的对照相比的胱天蛋白酶3活性百分比。“S.E.M”指的是平均数的标准误差。MM对照寡核苷酸处理未使肿瘤细胞对盐酸吉西他滨或紫杉醇敏感。
表1
检测实施例2人异种移植肿瘤模型的使用之前已有描述，在本领域中是已知的。下列肿瘤类型可用于进行下文描述的检测。U-87MG人成胶质细胞瘤获得自ATCC(Manasas，VA，美国)(Kiaris等人.，Neoplasia(2000)2(3)242-50)。
方法对于异种移植研究，就在移植前照射动物(450TBI(全身照射))，且细胞与matrigel混合(1∶1)。0.2mL体积的6×106U-87MG肿瘤细胞全部皮下(s.c.)注射到左后腰。当肿瘤体积达到约100mg时，用首次负荷剂量为50mg/kg的化合物I或MM对照寡核苷酸开始处理。在其他天施用化合物I或MM对照寡核苷酸的所有随后静脉内剂量(25mg/kg)。在负荷剂量一天后，开始用盐酸吉西他滨、盐酸阿霉素或紫杉醇的次最优剂量处理。盐酸吉西他滨每三天以2.5mg/kg腹膜内施用，共四剂。紫杉醇每四天以1mg/kg静脉内施用，共四剂。
每周两次进行二维测量，根据下列公式计算肿瘤体积(肿瘤体积)＝[(长度)(宽度2)(II/6)]。肿瘤体积数据转换成对数比例以平衡时间和处理组的差异。数据使用SAS PROC MIXED软件(SAS Institute，Inc.，Cary，N.C.)，以时间和处理差异的双向分析来分析。对于重复测量的优选相关模型是AR(顺序1自动回归(Auto Regressive of order 1))。
在每个时间点比较处理组。以每个处理组的平均数和标准误差对时间的数据作图。组合治疗中协同的存在以肿瘤生长延迟(TGD)度来评定。测定每个动物达到特定肿瘤尺寸(在此研究中为1500或2000或2500mg)的时间。没有达到那个尺寸的肿瘤包括在作为右删失值(right-censoredvalue)的分析中。假定为Weibull分布的最大似然分析用于计算每个处理组的平均时间和标准偏差。肿瘤生长延迟是每个处理组和对照组之间平均时间的差。如果组合治疗TGD显著高于个体治疗TGD的总和，则认为组合治疗具有协同作用。
结果表2中的数据显示化合物I和盐酸吉西他滨组合的效果。与任一化合物单独相比，组合产生统计上显著的(p＝0.0092)肿瘤生长延迟。因此，化合物I和盐酸吉西他滨的组合导致比肿瘤生长延迟之和多3到4.6天。
表2
序列表<110>伊莱利利公司<120>治疗癌症的组合疗法<130>X-16613<150>60/564540<151>2004-04-22<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的构建体<400>1tgtgctattc tgtgaatt18
权利要求
1.一种包含有效量的存活蛋白反义寡核苷酸和有效量的盐酸吉西他滨的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述存活蛋白反义寡核苷酸是化合物I。
3.包含存活蛋白反义寡核苷酸和盐酸吉西他滨的组合物在制备用于治疗癌症患者的药物中的应用。
4.一种治疗癌症患者的方法，其包括给予所述患者存活蛋白反义寡核苷酸和盐酸吉西他滨的治疗有效组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述存活蛋白反义寡核苷酸和盐酸吉西他滨在治疗有效间隔内分别施用。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述存活蛋白反义寡核苷酸是化合物I。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞癌、结直肠癌和淋巴瘤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述癌症是肝细胞癌。
9.一种存活蛋白反义寡核苷酸和盐酸吉西他滨的治疗有效组合在治疗癌症患者中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述存活蛋白反义寡核苷酸和盐酸吉西他滨在治疗有效间隔内分别施用。
11.根据权利要求10所述的应用，其中所述存活蛋白反义寡核苷酸是化合物I。
12.根据权利要求10或11所述的应用，其中所述癌症选自胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞癌、结直肠癌和淋巴瘤。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述癌症为肝细胞癌。
全文摘要
本发明涉及在患者中治疗癌症的方法，其包括施用有效量的存活蛋白反义寡核苷酸与有效量的盐酸吉西他滨。
文档编号A61P35/00GK1950094SQ200580011826
公开日2007年4月18日 申请日期2005年4月15日 优先权日2004年4月22日
发明者B·K·帕特尔 申请人:伊莱利利公司
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