作为Tie2抑制剂的取代的噻吩并[2,3－d]吡啶和噻唑并[2,3－d]吡啶的制作方法
专利名称：作为Tie2抑制剂的取代的噻吩并[2,3－d]吡啶和噻唑并[2,3－d]吡啶的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗血管生成活性的化合物或其药学上可接受的盐，它们可用于治疗动物或人体的血管生成相关性疾病的方法。本发明还涉及所述化合物、含有作为活性成分的所述化合物的药物组合物的制备方法，而且还涉及利用所述化合物制备用于在温血动物(例如人)产生抗血管生成作用的药物的方法。
Tie2受体酪氨酸激酶(也称为TEK)主要在内皮细胞和造血细胞中表达，它们是血管形成和维护所必不可少的(Jones，N.等，NatureReviews Molecular Cell Biology.，20012，257-67)。
血管生成是从现有血管系统产生新血管的基本过程。血管生成是几乎所有器官的形成和生理功能所必需的重要而又复杂的生物学过程。一般来讲，血管生成实质上是一个短暂过程，而且受到局部血管生成因子和血管抑制因子平衡的控制，这样一个多步过程包括血管萌芽、分支和内皮细胞形成小管(包括例如内皮细胞(EC)活化、血管抑制解除、降解酶的合成及释放、EC迁移、EC增生、EC组构及分化、血管成熟等过程)。
正常血管生成在许多过程中起着重要作用，并且处于严格控制之下。在成人，生理性血管生成主要限于伤口愈合以及若干女性生殖功能和胚胎发育过程。在不良性或病理性血管生成中，血管生成因子和血管抑制因子间的局部平衡失调，导致不当和/或结构异常性血管形成。伴有病理性血管生成的疾病包括糖尿病性视网膜病、牛皮癣、癌症、类风湿性关节炎、动脉粥样化、卡波西肉瘤(Kaposi′ssarcoma)和血管瘤(Fan等，1995，Trends Pharmacology.Science.1657-66；Folkman，1995，Nature Medicine 127-31)。在癌症中，超过1-2mm3的原发性瘤和继发性瘤的生长需要血管生成(Folkman，J.New England Journal of Medicine，1995；33，1757-1763)。
疾病发展依赖不良性血管生成的疾病(例如癌症)中，阻断血管生成可阻止疾病的发展(Folkman，J.1995，Nature Medicine.127-31)。科技文献介绍了许多在血管生成的调控方面起着决定性作用的因子。两大类血管生成因子为血管内皮生长因子(VEGF)和促血管生成素。这些多肽部分与它们各自的受体(跨膜酪氨酸激酶，主要是内皮细胞特异性的)相互作用，经过配体介导的信号转导诱导细胞反应。据推测，在正常血管生成和病理性血管生成中，VEGF和促血管生成素通过其相应受体的信号转导协同调控血管生成过程的各个方面。
受体酪氨酸激酶(RTK)在跨细胞质膜生物化学信号传导中起重要作用。这些跨膜分子的特征性组成为依次连接在一起的细胞外配体结合域、质膜段、细胞内酪氨酸激酶域。配体与受体结合刺激受体相关性酪氨酸激酶活性，导致受体和其它细胞内分子上的酪氨酸残基磷酸化。酪氨酸磷酸化中的这些变化启动信号级联，产生不同细胞反应。迄今为止，通过氨基酸序列同源性定义鉴定出至少19种不同RTK亚家族。目前，一种亚家族的成员有fms样酪氨酸激酶受体(即Flt或Flt1)、含激酶插入域的受体(即KDR)(也称为Flk-1)以及另一种fms样酪氨酸激酶受体(即Flt4)。其中两种相关性RTK即Flt和KDR与VEGF高亲和性结合(De Vries等，1992，Science 255989-991；Terman等，1992，Biochem.Biophys.Res.Comm.1992，1871579-1586)。VEGF与这两源异种细胞表达的受体结合伴有细胞蛋白酪氨酸磷酸化和钙流量变化。
最近鉴定出主要为内皮细胞特异性受体的第二个家族，这些受体调控血管解除抑制以及血管成熟。在正常血管生成和病理性血管生成中，Tie受体及其配体促血管生成素与VEGF紧密地协同作用。跨膜受体Tie1和Tie2构成参与维护血管完整性的内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体家族，而且它们参与血管生成性增生和血管再建。Tie1和Tie2在结构上有许多相同特征(例如，这两种受体的胞内域均包含被激酶插入区间断的酪氨酸激酶域)，因此构成一个独特的RTK亚家族。Tie1和Tie2受体之间氨基酸水平的总体序列同一性为44％，而它们的胞内域为76％同源性。目标性破坏Tie1基因导致以大出血和微血管完整性差为特征的致死性表型(Puri，M.等，1995EMBOJournal145884-5891)。Tie2缺陷型转基因小鼠出现血管萌芽和再建缺陷，在妊娠中期表现出由胚胎血管系统严重缺陷引起的致死性表型(E9.5-10.5)(Sato，T.等，1995Nature 37070-74)。
迄今为止，还没有鉴定出Tie1的配体，对它的信号转导能力也了解甚少。然而，人们认为Tie1通过与Tie2受体的异二聚化影响Tie2的信号转导(因此有可能调控Tie2自身磷酸化的能力(Marron，M.等，2000Journal of Biological Chemistry275，39741-39746)，最近对嵌合Tie1受体的研究表明，Tie-1可通过PI 3激酶/Akt信号转导途径抑制细胞凋亡(Kontos，C.D.等，2002Molecular and Cellular Biology22，1704-1713)。相比之下，已经鉴定出Tie2的许多配体(称为促血管生成素)，其中对促血管生成素1(Ang1)进行了最充分的表征。Ang1结合通过自身磷酸化诱导Tie2受体酪氨酸磷酸化，然后经信号转导激活其信号转导途径。据报道，Ang2在内皮细胞中起拮抗作用(Maisonpierre，P.等，1997Science277，55-60)。Tie2及其配体的敲出(knock-out)和转基因操作表明，对Tie2信号转导的严格空间和时间控制对新血管系统的正常发育是绝对必要的。还报道了至少另外两种配体(Ang3和Ang4)，这两种促血管生成素配体之间也可能产生异二聚化(具有改进与受体结合时的活性(激动/拮抗)的潜能)。Ang1激活Tie2受体抑制细胞凋亡(Papapetropoulos，A.等，2000Journal ofBiological Chemistry2759102-9105)、促进血管内皮细胞萌芽(Witzenbicher，B.等，1998Journal of Biological Chemistry273，18514-18521)、血管生成期间在体内促进血管成熟以及降低成熟微血管渗透性及随后的渗漏(Thurston，G.等，2000Nature Medicine6，460-463)。因此，有报道说，活化Tie2受体参与新血管的分支、萌芽和增生，在维持血管完整性和整体性上非常重要的外周内皮支持细胞的募集及相互作用似乎与促进微血管稳定性一致。不能活化Tie2或者抑制Tie2自身磷酸化可导致血管结构紊乱和基质/细胞联络中断(Brindle，N.，出版中，2002)，然后触发内皮细胞死亡，尤其是在缺乏存活或生长刺激因子情况下。基于上述报道的Tie2激酶活性的作用，抑制Tie2激酶可产生抗血管生成作用，因此可用于治疗伴有病理性血管生成的疾病。已证实，Tie2表达在多种肿瘤的新血管系统中向上调节，例如Peters，K.G.等，(British Journal of Cancer 1998；77，51-56)，表明抑制Tie2激酶活性将产生抗血管生成作用。支持这种假说的是，可溶性Tie2受体(胞外域)的研究证明了在体内肿瘤模型中的抗肿瘤活性(Pengnian，L.等，1997，Journal of Clinical Investigation1997100，2072-2078；Pengnian，L.等，1998，Proceedings of tbe NationalAcademy of Sciences 199895，8829-8834)。另外，这些实验还证明，正常健康个体的Tie2信号转导途径破坏完全可以耐受，因为在这些研究中未发现毒副作用。
对人原发性乳腺癌样品以及人和鼠乳腺癌细胞系的研究(Stratmann，A.等，2001，International Journal of Cancer91，273-282)表明，肿瘤血管生成的Tie2依赖途径可与KDR依赖途径同时存在，事实上，这两种途径可独立发挥作用(Siemeister G.等，1999CancerResearch59，3185-3191)也可以彼此协同起作用(例如据报道，VEGFA和Ang1联合诱导血管生成并产生非渗漏成熟血管，Thurston，G.等，1999Science286，2511-2514)。很有可能这些血管生成过程甚至共同存在于一个肿瘤中。
还证实，Tie2在称为静脉畸形(VM)的血管异常中起作用(Mulliken，J.B.和Young，A.E.1998，Vascular BirthmarksW.B.Saunders，Philadelphia)。这类缺陷可以是遗传性的，也可以是散发性的。VM常见于皮肤或粘膜，但是也可影响任何其它器官。典型病变为海绵状蓝到紫的血管团，血管团为大量扩张的内衬内皮细胞的血管。在遗传性VM中，最常见的缺陷是在Tie2编码序列中的Tie2激酶突变C2545T(Calvert，J.T.等，1999Human Molecular Genetics8，1279-1289)，这种突变在激酶域中产生R849W氨基酸取代。对这种Tie2突变体的分析表明，即使在缺乏配体的情况下，Tie2突变体也被组成型活化(Vikkula，M.等，1996Cell87，1181-1190)。
Tie2表达的上调还见于人关节连接的血管性滑膜关节翳，它与不良新血管形成的作用是一致的。
这样的实例进一步表明，抑制Tie2磷酸化及其随后的信号转导可用于治疗不良新血管形成的各种病症。迄今为止，本领域仅仅已知几种Tie2抑制剂。因此需要鉴定其它Tie2抑制剂，利用其抑制/调节Tie2信号转导途径的治疗潜力。
我们发现某些化合物具有对Tie2受体酪氨酸激酶的抑制活性，因此具有治疗伴有病理性血管生成的疾病的价值，例如癌症、类风湿性关节炎和其它不良的活动性血管生成疾病。
本发明的第一方面提供下式I的化合物以及其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐) 式I其中Z选自N和CH；W选自N和CH；X选自NH和CH2；
Y选自F、Cl、Br和I；n为1、2或3。
本发明的第二方面提供下式I的化合物以及其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐) 式I其中Z为N；W选自N和CH；X选自NH和CH2；Y选自F、Cl、Br和I；n为1、2或3。
本发明化合物特别包括例如这样的式I化合物或者其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐)其中Z为N，W为N，X、Y和n如上文中定义。本发明化合物还特别包括例如这样的式I化合物或者其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐)其中Z为N，W为CH，X、Y和n如上文中定义。
本发明的第三方面提供下式的I化合物以及其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐)
式I其中Z选自N和CH；W为N；X选自NH和CH2；Y选自F、Cl、Br和I；n为1、2或3。
本发明化合物特别包括例如这样的式I化合物或者其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐)其中Z为CH，W为N，X、Y和n如上文中定义。
本发明的第四方面提供下式的I化合物以及其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐) 式I其中
Z选自N和CH；W为CH；X选自NH和CH2；Y选自F、Cl、Br和I；n为1、2或3。
本发明化合物特别包括例如这样的式I化合物或者其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐)其中Z为CH，W为CH，X、Y和n如上文中定义。
如上所述，在本发明化合物中，Y选自氟、氯、溴和碘，特别选自氟和氯。
应当理解的是，n为2或3时，Y可以是相同或不同的。
本发明的具体化合物是一种或多种下列化合物(1)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氟苯基)脲；(2)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氟苯基)脲；(3)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氯苯基)脲；(4)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氯苯基)脲；(5)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氟苯基)乙酰胺；(6)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(2-氟苯基)乙酰胺；(7)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氯苯基)乙酰胺；(8)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2′-(2-氯苯基)乙酰胺；
(9)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氟苯基)脲；(10)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氟苯基)脲；(11)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氯苯基)脲；(12)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氯苯基)脲；(13)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氟苯基)乙酰胺；(14)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(2-氟苯基)乙酰胺；(15)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氯苯基)乙酰胺；(16)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(2-氯苯基)乙酰胺；以及它们的盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐)。
式I化合物的合适的药学上可接受的盐为例如式I化合物的酸加成盐，例如与无机酸或有机酸的酸加成盐，所述无机酸或有机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、三氟乙酸、柠檬酸或马来酸；或者例如具有足够酸性的式I化合物的盐，例如碱金属盐或碱土金属盐(例如钙盐或镁盐)、铵盐、或与有机碱的盐，所述有机碱如甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟基乙基)胺。
应当理解的是，由于以上定义的某些式I化合物存在一个或多个不对称碳原子，所以可以为旋光型或外消旋型，本发明定义中包括具有上述活性的任何这样的旋光型或外消旋型。可用本领域公知的有机化学标准技术合成旋光型化合物，例如用旋光原料合成或者通过拆分外消旋型。同样地，可用下文提及的标准实验室技术评价上述活性。
还应当理解的是，某些式I化合物可能存在溶剂合物以及非溶剂合物形式，例如水合物形式。还应当理解的是，本发明包括所有具有Tie2受体酪氨酸激酶抑制作用的溶剂合物形式。
还应当理解的是，某些式I化合物可能具有同质多晶，本发明包括所有具有Tie2受体酪氨酸激酶抑制作用的同质多晶。
还应当理解的是，本发明涉及式I化合物的具有Tie2受体酪氨酸激酶抑制作用的所有互变异构体。
虽然优选本发明化合物的药学上可接受的盐，但是本发明化合物的其它非药学上可接受的盐也是有用的，例如在制备本发明化合物的药学上可接受的盐时使用。
本发明的另一方面还提供本文定义的本发明化合物的前药。本发明化合物可以前药形式给予，前药在人体或动物体内分解得到式(I)化合物。前药的实例包括体内可水解的式(I)化合物的酰胺。
前药的各种形式是本领域已知的。有关这样的前药衍生物的例子参见a)Design of Prodrugs，H.Bundgaard编辑，(Elsevier，1985)，Methods in Enzymology，第42卷，第309-396页，K.Widder等编辑，(Academic Press，1985)；b)A Textbook of Drug Design and Development，Krogsgaard-Larsen和H.Bundgaard编辑，第5章，“Design and Application ofProdrugs”，H.Bundgaard编辑，第113-191页(1991)；c)H.Bundgaard，Advanced Drug Delivery Reviews，8，1-38(1992)；d)H.Bundgaard等，Journal of Pharmaceutical Sciences，77，285(1988)；e)N.Kakeya等，Chem Pharm Bull，32，692(1984)。
式I化合物或其药学上可接受的盐可通过任何已知适于制备相关化合物的方法制备。当这样的方法用于制备式I化合物时，这些方法为本发明的另一特征，并且通过以下的各种代表性方法举例说明。必需的原料可通过有机化学的标准方法获得。这类原料的制备结合下面的各种代表性方法进行介绍，并在后面的实施例中进行介绍。或者，通过与例子类似的方法获得必需的原料，这属于有机化学人员的普通技能。
本发明的再一方面提供式I化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中X为NH和Z，W、Y和n如式I中定义，所述方法包括使式II的胺与式III的异氰酸酯反应， 式II 式III此后如果需要i)将一种式(I)化合物转化为另一种式(I)化合物；ii)形成盐或溶剂合物。
上述方法适宜在合适的惰性溶剂或稀释剂(例如醚，例如四氢呋喃、DMF、DCM、DMA或吡啶)中进行。该方法最好在50℃以下(例如0-30℃)进行，优选在室温下进行。
式II的胺可以通过以下的反应流程(i)制备流程(i)其中(a)哌嗪/THF，(b)m-CPBA/DCM，(c)浓氨水/1，4-二烷，(d)二苯甲酮亚胺、1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁、双(亚苄基丙酮)钯和叔丁醇钠的二烷溶液，(e)HCl/THF 式IIa化合物可以通过以下的反应流程(ii)制备流程(ii) 式IIb的砜可以如下制备三甲基甲硅烷基氯、3-碘苯甲醛、甲酰胺和甲苯亚磺酸反应，得到{(3-碘苯基)[(4-甲基苯基)磺酰基]甲基}甲酰胺，然后使{(3-碘苯基)[(4-甲基苯基)磺酰基]甲基}甲酰胺与三氯氧化磷反应，得到式IIb的砜。
本发明的另一方面提供式I化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中X为CH2，Z、W、Y和n如式I中定义，所述方法包括使式II的胺与适当的酰基氯或酰基酯反应，本领域技术人员能够理解。
当需要式I化合物的药学上可接受的盐(例如酸加成盐)时，可使用常规方法通过例如式I化合物与合适的酸(如盐酸)反应获得。当需要式I化合物的游离碱形式时，式I化合物的酸加成盐可以用合适的碱进行处理，所述碱包括例如有机胺碱(如吡啶、2，6-二甲基吡啶、三甲基吡啶、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺、吗啉、N-甲基吗啉或二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯)或者例如碱金属或碱土金属的碳酸盐或氢氧化物(如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、氢氧化钠或氢氧化钾)。
某些式I化合物可为立体异构体形式。应当理解的是，本发明包括所有式I化合物的几何异构体和旋光异构体及其混合物(包括外消旋物)。互变异构体及其混合物也属于本发明。
异构体可通过常规方法(例如色谱法或分级结晶)拆分或离析。可使用常规方法(例如手性高效液相色谱法(HPLC))离析化合物的外消旋物或其它混合物，从而分离出各对映异构体。或者，所需的旋光异构体可以如下制备在不引起外消旋化的条件下通过合适的旋光原料反应而制备，或者通过用例如纯手性酸衍生化，然后用常规方法(例如HPLC、硅胶色谱法)分离非对映异构体衍生物而制备，或者可用非手性原料和手性试剂制备。所有立体异构体都属于本发明范畴。
本发明化合物可使用常规技术从它们的反应混合物中分离。
应当理解的是，在本文提及的一些反应中，可能需要保护化合物的任何敏感基团。在需要保护的情形下，合适的保护方法是本领域技术人员已知的。可依照标准规程使用常规保护基(例如参见T.W.Green，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，1991)。因此，如果反应物包含例如氨基、羧基或羟基等基团，在本文提及的一些反应中就可能需要保护所述基团。保护基可通过文献介绍的任何常规方法或者本领域化学工作者熟知的方法脱去，所选择的方法应适于脱去保护基团而对分子的其它基团干扰最小。
为了方便起见，下面给出保护基的具体实例，其中“低级”用于例如低级烷基时，表示该基团优选具有1-4个碳原子。应当理解的是，这些实例为非穷尽性实例。下文为脱去保护基而给出的具体方法实例同样是非穷尽性实例。当然，未特别提及的保护基的使用和脱保护的方法也属于本发明范畴。
羧基保护基可为酯形成性脂肪醇或芳基脂肪醇的残基，或者为酯形成性甲硅烷醇的残基(所述醇或甲硅烷醇优选包含1-20个碳原子)。羧基保护基的实例包括直链或支链(1-12C)烷基(例如异丙基和叔丁基)；低级烷氧基-低级烷基(例如甲氧基甲基、乙氧基甲基和异丁氧基甲基)；低级酰氧基-低级烷基(例如乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基和新戊酰氧基甲基)；低级烷氧基羰基氧基-低级烷基(例如-甲氧基羰基氧基乙基和1-乙氧基羰基氧基乙基)；芳基-低级烷基(例如苄基、4-甲氧基苄基、2-硝基苄基、4-硝基苄基、二苯甲基和2-苯并[c]呋喃酮基)；三(低级烷基)甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基)；三(低级烷基)甲硅烷基-低级烷基(例如三甲基甲硅烷基乙基)；以及(2-6C)烯基(例如烯丙基)。特别适合脱去羧基保护基的方法包括例如酸-、碱-、金属-或酶催化裂解。
羟基保护基的实例包括低级烷基(例如叔丁基)；低级烯基(例如烯丙基)；低级烷酰基(例如乙酰基)；低级烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基)；低级烯基氧基羰基(例如烯丙基氧基羰基)；芳基-低级烷氧基羰基(例如苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基和4-硝基苄氧基羰基)；三(低级烷基)甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基)以及芳基-低级烷基(例如苄基)。
氨基保护基的实例包括甲酰基、芳基-低级烷基(例如苄基和取代的苄基、4-甲氧基苄基、2-硝基苄基和2，4-二甲氧基苄基以及三苯基甲基)；二-4-茴香基甲基和呋喃基甲基；低级烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基)；低级烯基氧基羰基(例如烯丙基氧基羰基)；芳基-低级烷氧基羰基(例如苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基和4-硝基苄氧基羰基)；三烷基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基)；亚烷基(例如亚甲基)以及亚苄基和取代的亚苄基。
适于脱去羟基和氨基保护基的方法包括例如适用于2-硝基苄氧基羰基等基团的酸-、碱-、金属-或酶催化水解法，适用于例如苄基等基团的氢化法以及适用于例如2-硝基苄氧基羰基等基团的光解法。
还应当理解的是，本发明化合物的某些不同环取代基可通过标准芳族取代反应引入，或者在进行上述方法前或进行上述方法后立即通过常规官能团修饰产生，这类方法属于本发明的方法。这类反应和修饰方法包括，例如通过芳族取代反应方法引入取代基、还原取代基、烷化取代基和氧化取代基。这类方法所用试剂和反应条件是化学领域公知的。芳族取代反应的具体实例包括引入卤素。
生物学测定下列测定可用于测定本发明化合物用作体外Tie2抑制剂以及用作完整细胞的Tie2自身磷酸化抑制剂的效果。
a.体外受体酪氨酸激酶抑制测定为了测试化合物对Tie2受体酪氨酸激酶的抑制作用，用非细胞蛋白激酶测定测试化合物抑制蛋白激酶磷酸化含酪氨酸的多肽底物的能力，测定方法为ELISA型微量板测定法。在这种特定情形下，测定三种不同的重组人酪氨酸激酶Tie2、KDR和Flt的IC50值。
使用标准分子生物学克隆和诱变技术产生重组受体基因以促进产生酪氨酸激酶。这些基因中编码的重组蛋白片段仅仅是每种受体的细胞内C-末端部分，其中存在激酶域。克隆编码包含激酶域的片段的重组基因，在标准杆状病毒/Sf21系统(或替代的等同物)中表达。
蛋白表达后用宿主昆虫细胞制备裂解物，方法是用冰冷的裂解缓冲液(20mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)pH7.5、150mMNaCl、10％甘油、1％Triton X-100、1.5mM MgCl2、1mM乙二醇-双(β-氨基乙醚)N′，N′，N′，N′-四乙酸(EGTA))加上蛋白酶抑制剂处理，然后通过离心澄清。将Tie2、KDR和Flt1裂解物以等分量在-80℃贮藏。
通过测定这些重组蛋白磷酸化合成肽(由6∶3∶1比率的谷氨酸、丙氨酸和酪氨酸的随机共聚物组成)的能力，来确定它们的组成型激酶活性。具体地说，用100微升合成肽Sigma P3899(先用PBS按1∶500稀释1mg/ml母液(PBS)，然后包被板)包被Nunc MaxisorbTM96孔免疫板后，于4℃孵育过夜。在室温下用50mM HEPES(pH7.4)洗涤免疫板，以除去任何过量的未结合的合成肽。
测试Tie2、KDR或Flt1的活性，方法是在肽包被板中在室温下孵育适当的新鲜稀释的裂解物(分别为1∶200、1∶400和1∶1000)，裂解物的反应液包括100mM HEPES(pH7.4)、5微摩尔(或相应酶的Km浓度)三磷酸腺苷(ATP)、10mM MnCl2、0.1mM Na3VO4、0.2mM DL-二硫苏糖醇(DTT)、0.1％Triton X-100和试验化合物的DMSO溶液(最终浓度2.5％)，最终化合物浓度为0.05微摩尔至100微摩尔，孵育时间分别为60分钟(Tie2)或20分钟(KDR、Flt)。除去该测定的液体成分终止反应，然后用PBS-T(含0.5％吐温20的磷酸缓冲盐溶液)或者替代的等同洗涤缓冲液洗涤该板。
通过免疫学方法检测该反应的固定磷酸肽产物。首先，将板在室温下与鼠单克隆抗磷酸酪氨酸-HRP(辣根过氧化物酶)缀合抗体(4G10，Upstate Biotechnology UBI 16-105)孵育4小时。然后用PBS-T彻底洗涤，比色测定该板的每孔HRP活性，使用22’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6)]二铵盐晶体ABTS(Sigma P4922-根据产品说明书制备)为底物，孵育30-45分钟后显色，然后加入100μl 1M H2SO4终止反应。
定量显色并在Molecular Devices ThermoMax微量板读板仪上在405nm测量吸光度来确定酶活性。特定化合物的激酶抑制作用以IC50值表示，通过计算在测定中抑制50％磷酸化所需的试验化合物浓度而确定。用阳性(溶媒和ATP)对照值和阴性(溶媒而无ATP)对照值计算磷酸化程度。
b.细胞Tie2自身磷酸化该测定基于测量化合物抑制Tie2受体自身磷酸化的能力，自身磷酸化通常导致产生“活化”受体，然后“活化”受体启动与受体功能有关的的特定信号转导途径。
自身磷酸化可通过多种方法完成。已知杆状病毒系统中重组激酶域的表达可产生磷酸化活化受体。也有报道，在缺失配体的情况下，重组细胞系中受体的过量表达本身就能导致受体自身磷酸化(Heldin C-H.1995Cell80，213-223；Blume-J.P，Hunter T.2001Nature411，355-65)。此外，在大量文献实例中，构建了嵌合受体。在这些情形中，受体的天然外部细胞表面域被已知因为加入适当配体而易于二聚化的结构域取代(例如TrkA-Tie2/NGF配体(Marron，M.B.等，2000Journal of Biological Chemistry27539741-39746)或C-fms-Tie-1/CSF-1配体(Kontos，C.D.等，2002Molecular and CellularBiology22，1704-1713)。因此，当嵌合受体在宿主细胞系中表达而且加入各自的配体时，诱导嵌合受体的激酶域自身磷酸化。该方法的优点是通常允许使用已知(且常常容易获得)的配体，而不必鉴定和分离每种目标受体的天然配体。
当然，如果可获得配体，则可使用已知表达目标受体而且容易用配体刺激以实现配体诱导的磷酸化的天然细胞系或原代细胞。化合物抑制Tie2受体自身磷酸化的能力可通过此测定法测量，Tie2受体在例如EA.hy926/B3细胞(J.McLean/B.Tuchi，Univ.of N.Carolina atChapel Hill，CB-4100，300Bynum Hall，Chapel Hill，N.C.27599-41000，USA)或原代HUVEC(人脐静脉内皮细胞，市售的)中表达。
使用标准纯化技术可从肿瘤细胞上清液分离天然Ang1配体，或者使用标准分子生物学技术和表达系统可克隆和重组表达Ang1基因。在此情形下，可尝试生产自然状态配体或者作为重组蛋白的配体，所述重组蛋白例如可能已经遗传工程改造以包含其它纯化标记(例如多聚组氨酸肽、抗体Fc域)，以便于该过程。
用配体刺激EA.hy926/B3或HUVEC细胞Tie2受体为例，可以构建Ang1配体刺激的细胞受体磷酸化测定，可以将其用于分析测量化合物抑制该过程的潜能。例如在6孔板上，最初接种密度为5×105细胞/孔，让EA.hy926/B3细胞在适当的组织培养基加上10％胎牛血清(FCS)中生长两天。第三天，用只含1％FCS的培养基代替前述培养基，让细胞血清饥饿总共2小时。在血清饥饿1小时40分钟后，除去培养基，更换为1ml试验化合物稀释液(用低血清培养基配制，而且DMSO浓度保持低于0.8％)。在血清饥饿1.5小时后，加入原钒酸盐(orthovanidate)至最终浓度为0.1mM，血清饥饿持续最后10分钟。
在血清饥饿总共2小时后，加入配体和原钒酸盐以刺激细胞Tie2受体自身磷酸化(配体可以用低血清培养基稀释的纯化原料加入，或以包含配体的非纯化细胞上清液加入(例如重组表达哺乳动物细胞时))。
在37℃下与配体孵育10分钟后，在冰上冷却细胞，用大约5ml含1mM原钒酸盐的冷PBS洗涤，然后向细胞中加入1ml冰冷的裂解缓冲液((20mM Tris(pH 7.6)、150mM NaCl、50mM NaF、0.1％SDS、1％NP40、0.5％DOC、1mM原钒酸盐、1mM EDTA、1mM PMSF、30μl/ml抑肽酶、10μg/ml胃酶抑素、10μg/ml亮抑酶肽)，放置冰上10-20分钟。除去裂解物后移入1.5ml Eppendorf管，在4℃以13000rpm离心3分钟。将800μl每种裂解物移入新的2ml Eppendorf管用于免疫沉淀。将3mg＝15μl抗磷酸酪氨酸抗体(Santa Cruz PY99-sc-7020)加入裂解物，在4℃下孵育2小时。将600μl洗涤MagnaBind珠(山羊抗小鼠IgG，Pierce 21354)加入裂解物，将试管在4℃下旋转过夜。
用磁体处理样品1分钟，然后小心除去裂解上清液。然后将1ml裂解缓冲液加入所述珠并重复该步骤两次。将所述珠悬浮于25μl 94℃的2×Laemmli加样缓冲液(含β-巯基乙醇)，在室温下静置15分钟。
将试管暴露于磁体1分钟以除去珠粒，把珠粒与免疫沉淀分离获得的全部液体加样到聚丙烯酰胺/SDS蛋白凝胶(预制4-12％BisTrisNuPAGE/MOPS 12孔凝胶，Novex)。在200V下电泳蛋白凝胶，然后在50V/250mA下转印到NC膜上1小时30分钟。所有印迹点在室温下用5％Marvel/PBS-吐温处理1小时，从而降低检测抗体的非特异性结合。将兔抗-Tie2(Santa Cruz sc-324)用0.5％Marvel/PBS吐温以1∶500稀释，在4℃下孵育过夜。用PBS-吐温严格洗清印迹点，然后加入用0.5％Marvel/PBS-吐温以1∶5000稀释的山羊抗兔-POD缀合物(Dako P0448)。抗体在室温下放置1小时，随后用PBS-吐温洗清印迹点。不同免疫沉淀物样品的蛋白质印迹点用LumiGLO(NEB 7003)显影印迹。然后移入X-Ray暗盒，对胶片曝光15秒/30秒和60秒。使用FluorS BioRad图像分析系统评估属于磷酸化Tie2受体的蛋白条带相对强度。确定每种试验化合物稀释系的磷酸化百分率，通过标准方法用适当的对照样品作参考计算IC50值。
尽管式I化合物的药理学性质如预期那样随结构的改变而发生变化，但是一般来说，式I化合物具有的活性可用下列浓度或剂量利用一种或多种上述测试(a)和(b)证实测试(a)-IC50值范围，例如＜100μM；测试(b)-IC50值范围，例如＜50μM；例如，实施例1在测试(a)中的IC50值为16μM，在测试(b)中的IC50值为0.4μM。
本发明的再一方面提供药物组合物，该组合物包含上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体。
本发明组合物可为适于口服的剂型(例如片剂、锭剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、水混悬剂、油混悬剂、乳剂、可分散粉剂或颗粒剂、糖浆剂或酏剂)、适于局部使用的剂型(例如乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、或者水性或油性溶液剂或混悬剂)、适于吸入给药的剂型(例如细粉剂或液体气雾剂)、适于吹入给药的剂型(例如细粉剂)或适于肠胃外给药的剂型(例如静脉、皮下、肌内或肌内给药的无菌水溶液或油溶液，或直肠给药的栓剂)。
本发明组合物可通过常规方法使用本领域公知的常规药用赋形剂获得。因此，口服的组合物可包含例如一种或多种着色剂、甜味剂、矫味剂和/或防腐剂。
活性成分与一种或多种赋形剂混合制备成单一剂型的剂量应随需要治疗的宿主和具体的给药途径而变化。例如，人口服给药的制剂通常包含例如0.5mg-0.5g(更合适为0.5-100mg，例如1-30mg)活性剂和适量赋形剂，赋形剂可占组合物总重量的约5-98％。
就治疗或预防目的而言，式I化合物的剂量大小应当根据疾病的性质和严重程度、动物或患者的年龄和性别以及给药途径，按公知的医学原则而变化。
在式I化合物用于治疗或预防目的时，通常可给予的日剂量为例如0.1mg/kg-75mg/kg体重，如果需要，以分剂量给药。当肠胃外给药时，一般给予较低的剂量。因此，例如静脉给药的常用剂量为例如0.1mg/kg-30mg/kg体重。类似地，吸入给药的剂量为例如0.05mg/kg-25mg/kg体重。然而优选口服给药，尤其优选以片剂给药。一般说来，单位剂型将包含约0.5mg-0.5g的本发明化合物。
本文定义的本发明化合物主要在于抗血管生成作用。本发明化合物广泛用于治疗或预防伴有不良血管生成或病理性血管生成的疾病，包括癌症、糖尿病、牛皮癣、类风湿性关节炎、卡波西肉瘤、血管瘤、淋巴水肿、急性和慢性肾病、动脉粥样化、动脉再狭窄、自身免疫性疾病、急性炎症、过度瘢痕形成和粘连、子宫内膜异位、机能障碍性子宫出血以及视网膜血管增生性眼部疾病。癌症可侵袭任何组织，包括白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。具体地说，这类本发明化合物有利于减缓原发性及复发性实体瘤的生长，例如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和皮肤癌。
我们认为，本发明化合物的抗血管生成特性来自它们的Tie2受体酪氨酸激酶抑制特性。相应地，本发明化合物可用于在需要这种治疗的温血动物体内产生Tie2抑制作用。因此，全部或部分通过本发明化合物抑制Tie2受体酪氨酸激酶，本发明化合物可用于产生抗血管生成作用。
更具体地说，本发明化合物可抑制与Tie2相关的任何形式的癌症。例如，与Tie2相关的原发性和复发性实体瘤生长，尤其是那些主要依赖Tie2受体酪氨酸激酶生长和扩散的肿瘤。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐，用作药物。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用作温血动物(例如人)的Tie2受体酪氨酸激酶抑制剂的药物中的用途。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于在温血动物(例如人)产生抗血管生成作用的药物中的用途。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗温血动物(例如人)的癌症的药物中的用途。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗温血动物(例如人)的以下癌症的药物中的用途白血病、乳腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、睾丸癌、成神经细胞瘤、肝癌、胆管癌、肾细胞癌、子宫癌、甲状腺癌和皮肤癌。
本发明的另一方面提供抑制需要这种治疗的温血动物(例如人)的Tie2受体酪氨酸激酶的方法，该方法包括对所述动物给予有效量的上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供在需要这种治疗的温血动物(例如人)产生抗血管生成作用的方法，该方法包括对所述动物给予有效量的上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供治疗需要这种治疗的温血动物(例如人)的癌症的方法，该方法包括对所述动物给予有效量的上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供治疗需要这种治疗的温血动物(例如人)的选自以下癌症的方法白血病、乳腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、睾丸癌、成神经细胞瘤、肝癌、胆管癌、肾细胞癌、子宫癌、甲状腺癌和皮肤癌，该方法包括对所述动物给予有效量的上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐，用于抑制温血动物(例如人)的Tie2受体酪氨酸激酶。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐，用于在温血动物(例如人)产生抗血管生成作用。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗癌症。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗选自以下的癌症白血病、乳腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、睾丸癌、成神经细胞瘤、肝癌、胆管癌、肾细胞癌、子宫癌、甲状腺癌和皮肤癌。
如上所述，本发明化合物还具有抗其它不良或病理性血管生成介导疾病的活性，这些疾病包括牛皮癣、类风湿性关节炎、卡波西肉瘤、血管瘤、淋巴水肿、急性和慢性肾病、动脉粥样化、动脉再狭窄、自身免疫性疾病、急性炎症、过度瘢痕形成和粘连、子宫内膜异位、机能障碍性子宫出血以及视网膜血管增生性眼部疾病。
本文定义的抗血管生成活性可用作单独治疗或除本发明化合物外可包括一种或多种其它物质和/或治疗。这种联合治疗可通过同时、序贯或单独给予各种治疗来完成。在内科肿瘤学领域，使用不同疗法的联合疗法来治疗各个癌症患者是常见的。在内科肿瘤学领域，除上文定义的细胞周期抑制治疗外，这类联合疗法的其它疗法可为外科疗法、放射疗法或化学疗法。此种化学疗法可包括一种或多种以下抗肿瘤药物(i)抗侵袭剂(例如金属蛋白酶抑制剂(如马立马司他)和尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活物受体功能的抑制剂)；(ii)用于肿瘤的抗增生/抗肿瘤药物及其组合，例如烷化剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、白消安和亚硝基脲)；抗代谢剂(例如抗叶酸剂，例如氟嘧啶(如5-氟尿嘧啶和替加氟)、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和羟基脲，或者例如，优选欧洲专利申请562734中公开的一种抗代谢剂例如(2S)-2-{邻-氟-对-[N-{2，7-二甲基-4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-6-基甲基}-N-(丙-2-炔基)氨基]苯甲酰氨基}-4-(四唑-5-基)丁酸)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素如阿霉素、博来霉素、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、更生霉素和光辉霉素)；抗有丝分裂剂(例如长春生物碱如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春瑞滨，以及紫杉类药物如泰素和泰索帝)；以及拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(如依托泊苷和替尼泊苷)、安吖啶、托泊替康和喜树碱)；(iii)细胞抑制剂，例如抗雌激素类药(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和艾多昔芬)、抗雄激素类药(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑和依西美坦)和5α-还原酶抑制剂例如非那雄胺；(iv)生长因子功能抑制剂，例如这类抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体、法尼酰基转移酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族抑制剂(例如EGFR酪氨酸激酶抑制剂N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(ZD 1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(CP 358774)和6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033))，例如血小板衍生生长因子家族抑制剂以及例如肝细胞生长因子家族抑制剂；(v)作用机理与上文定义的药物不同的抗血管生成药，例如抑制血管内皮生长因子药，例如国际专利申请WO 97/22596、WO97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中公开的化合物以及通过其它机理起作用的药物(例如利诺胺、整联蛋白αvβ3功能抑制剂和血管生长抑素)；(vi)生物制剂治疗法，例如用螯合受体配体、阻断配体结合受体或者降低受体信号转导(例如由于增强受体降解或降低表达水平)的肽或蛋白(例如抗体或可溶性外受体域构建物)。
(vii)反义治疗法，例如靶向上述靶的反义药物，例如ISIS 2503，一种抗ras反义药物；(viii)基因治疗法，包括例如置换异常基因(例如异常的p53或者异常的BRCA1或BRCA2)的方法、GDEPT(基因定向酶前药治疗)方法(例如使用胞嘧啶脱氨基酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的方法)以及增强患者对化学疗法或放射疗法的耐受性的方法(例如多药抗性基因治疗)；(ix)免疫治疗法，包括例如离体和体内增强患者肿瘤细胞免疫原性的方法，例如用细胞因子(例如白介素2、白介素4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)转染的方法、降低T-细胞无反应性的方法、使用转染的免疫细胞(例如细胞因子转染的树突状细胞)的方法、使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法以及使用抗独特型抗体的方法。
这种联合治疗可通过同时、序贯或单独给予各个治疗组分来完成。这类联合药物产品使用上述剂量范围的本发明化合物以及批准剂量范围的其它药用活性药物。
本发明在这方面提供药物产品，该产品包含上文定义的式I化合物和上文定义的其它抗肿瘤药物，用于联合治疗癌症。
除治疗药物用途外，式I化合物及其药学上可接受的盐也可在体外和体内测试体系的开发和标准化中用作药理学工具，所述测试系统用于评价各种抑制剂对实验室动物(例如猫、狗、兔、猴、大鼠和小鼠)的细胞周期活性的作用，是寻找新型治疗药物的组成部分。
本发明现通过下列非限制性实施例说明，除非另有说明，否则(i)温度单位为摄氏度(℃)；在室温下或环境温度下进行操作，即18-25℃；(ii)有机溶液经无水硫酸镁干燥；在可达60℃的浴温下用旋转蒸发器减压(600-4000帕斯卡；4.5-30毫米汞柱)蒸发溶剂；(iii)色谱法是指硅胶快速色谱法；薄层色谱法(TLC)在硅胶板上进行；(iv)一般来讲，反应进程用TLC和/或分析型LC-MS跟踪，而给出的反应时间仅是示例性的；(v)最终产物具有符合要求的质子核磁共振(NMR)光谱数据和/或质谱数据；(vi)所给产量仅是示例性的，而不一定是通过最佳工艺过程获得的；如果需要更多物质，则重复进行制备；(vii)当给出的NMR数据为主要特征质子的δ值形式时，以相对于四甲基硅烷(TMS)内标的百万分之几(ppm)给出，除非另有说明，否则就用全氘二甲亚砜(DMSO-d6)作溶剂在300MHz进行测定；使用以下缩写词s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；b，宽峰；(viii)各种化学符号具有它们的常用含义；使用SI单位和符号；(ix)溶剂比为体积∶体积(v/v)；(x)质谱(MS)操作中采用70电子伏特的电子能，化学电离(CI)模式，使用直接暴露探头；其中所述电离通过电子碰撞(EI)、快速原子轰击(FAB)或电喷雾(ESP)实现；给出了m/z值；一般说来，仅报告指示母体质量的离子；除非另有说明，否则给出的质量离子为MH+；(xi)除非另有说明，否则没有折分包含不对称取代碳原子和/或硫原子的化合物；(xii)当指出某个合成类似于前面实施例介绍的合成时，各原料用量的毫摩尔比与前面实施例使用的毫摩尔比相同；(xvi)使用下列缩写词AcOH 乙酸AIBN 2，2′-偶氮二异丁腈DCM 二氯甲烷DIPEA 二异丙基乙胺DMA N，N-二甲基乙酰胺DMF N，N-二甲基甲酰胺DMSO 二甲亚砜DMTMM 氯化4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-dppf 1，1′-二(二苯膦基)二茂铁EtOAc酸乙酯HATU 六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲iPrMgCl 异丙基氯化镁LDA 二异丙基氨基锂
LHMDS 二(三甲基甲硅烷基)氨基锂m-CPBA间氯过苯甲酸MeOH 甲醇MeCN 乙腈MCX 混合型阳离子交换树脂MTBE 甲基叔丁基醚LCMS 液相色谱-质谱NMP 1-甲基-2-吡咯烷酮PhTosMIC α-甲苯磺酰基苄基胩POCl3磷酰氯RPHPLC反相高效液相色谱法TFA 三氟乙酸THF 四氢呋喃xvii)在指出某个合成得到酸加成盐(例如HCl盐)时，未指出该盐的化学计量关系。除非另有说明，否则所有NMR数据为游离碱物质的数据，分离的盐在转化为游离碱后进行表征。
实施例1N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氟苯基)脲将6-[4-(3-氨基苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺(64mg)的无水四氢呋喃(10ml)加入异氰酸3-氟苯酯(41mg)，在惰性气氛、室温下搅拌1小时。将混合物用DCM(5ml)稀释，然后用硅胶色谱纯化，依次用0-50％EtOAc/DCM、0-20％MeOH/DCM梯度洗脱，得到标题化合物(固体，71mg，77％)；1H NMR(DMSOd6)δ3.65(s，3H)，6.83(m，1H)，7.15(m，2H)，7.25(m，1H)，7.35(m，2H)，7.48(m，1H)，7.68(s，br 2H)，7.72(s，1H)，7.80(m，1H)，7.99(s，1H)，8.39(s，1H)，8.79(s，1H)，8.89(s，1H)；MS m/e MH+460。
实施例2N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氟苯基)脲将6-[4-(3-氨基苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺(64mg)的无水四氢呋喃(10ml)溶液加入异氰酸2-氟苯酯(34mg)，在惰性气氛、室温下搅拌1小时。混合物用DCM(5ml)稀释，然后用硅胶色谱纯化，依次用0-50％EtOAc/DCM、0-50％MeOH(含1％浓氨水)/DCM梯度洗脱，得到标题化合物(固体，76mg，82％)。
1H NMR(DMSOd6)δ3.58(s，3H)，7.00(m，1H)，7.20(m，5H)，7.58(s，br 2H)，7.68(s，1H)，7.78(m，1H)，7.91(s，1H)，8.04(m，1H)，8.34(s，1H)，8.45(s，1H)，9.00(s，1H)；MS m/e MH+460。
如下制备原料中间体1{(3-碘苯基)[(4-甲基苯基)磺酰基]甲基}甲酰胺在惰性气氛下，将三甲基甲硅烷基氯(9.1ml)加入到3-碘苯甲醛(15.1g)、甲酰胺(6.5ml)、MeCN(34ml)和甲苯(34ml)的搅拌溶液中。然后将反应物在50℃加热5小时。加入甲苯亚磺酸(15.3g)，将反应混合物在50℃加热5小时。冷却反应混合物至室温，加入甲基叔丁基醚(55ml)，搅拌5分钟。加入水(275ml)，冷却反应物至0℃，搅拌1小时。滤出固体，反应烧瓶用MTBE(2×35ml)洗涤，倒在滤饼上。将固体在真空烘箱中于60℃干燥10小时，得到不纯的标题化合物(固体，14g，51％)，将其直接使用无需再提纯。用EtOH结晶少量样品；主要(6∶1)旋转异构体的1H NMR(DMSO-d6)δ；2.43(s，3H)，6.42(d，1H)，7.15-8.00(m，9H)，9.73(d，1H)。
MS m/e MH+416。
中间体2(3-碘苯基)(异氰基)甲基4-甲基苯基砜在25℃，将POCl3(3.05ml)加入到{(3-碘苯基)[(4-甲基苯基)磺酰基]甲基}甲酰胺(6.23g)和无水THF(35ml)的搅拌溶液中，搅拌5分钟。冷却反应混合物至0℃，在45分钟内滴加Et3N(13.7ml)，保持内部温度在10℃以下。将反应混合物在5-10℃下再搅拌45分钟。加入EtOAc(140ml)和水(140ml)，然后搅拌5分钟。有机相依次用水(2×140ml)、NaHCO3(饱和水溶液，140ml)和盐水(140ml)洗涤。真空浓缩有机相，得到咖啡色树胶状物。使其通过硅胶垫，用DCM洗涤，真空浓缩，得到咖啡色树胶状物(纯度约为70％，3.5g，58％)；1H NMR(CDCl3)δ2.42(s，3H)，5.45(s，1H)，7.00-7.75(m，8H)；MS m/e(M-H)-396。
中间体34-(甲硫基)噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-甲醛在-78℃，将4-(甲硫基)噻吩并[2，3-d]嘧啶(J.Heterocycl.Chem.，1975，12，921-924)(1g)的THF(5ml)溶液加入到LDA[BuLi(1.6M己烷溶液，3.8ml)和二异丙胺(0.85ml)]和THF(20ml)的预制备溶液中。将反应混合物在-78℃搅拌1小时，然后加入DMF(1.1ml)。将反应混合物在-78℃搅拌30分钟，然后升至室温，再搅拌3小时。反应混合物用水稀释，产物用EtOAc(4×30ml)萃取。合并的有机萃取液用盐水(30ml)洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。用硅胶色谱法纯化(用DCM洗脱)，得到标题化合物(白色固体，117g，51％)；1H NMR(CDCl3)δ2.76(s，3H)，8.03(s，1H)，8.90(s，1H)，10.10(s，1H)；
MS m/e MH+211。
中间体4N-[4-(甲硫基)噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基亚甲基]甲胺在室温、惰性气氛下，将4-(甲硫基)噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-甲醛(13g)、甲胺(33％EtOH溶液，20.6ml)和无水MgSO4(20g)在DCM(465ml)中搅拌2天。过滤反应混合物，然后真空浓缩，得到标题化合物(棕色固体，13.8g，100％)；1H NMR(DMSOd6)δ2.70(s，3H)，3.45(s，3H)，7.82(s，1H)，8.62(s，1H)，8.89(s，1H)。
中间体56-[4-(3-碘苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]-4-(甲硫基)噻吩并[2，3-d]嘧啶将N-[4-(甲硫基)噻吩并[2，3-d[嘧啶-6-基亚甲基]甲胺(1.0g)、(3-碘苯基)(异氰基)甲基4-甲基苯基砜(3.4g，纯度70％)和哌嗪(0.77g)的THF(80ml)溶液在惰性气氛下搅拌4天。浓缩反应混合物，用水稀释，用EtOAc萃取。萃取液用NaHCO3饱和水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤后真空浓缩。硅胶色谱法纯化(依次用0-100％EtOAc/DCM、0-5％MeOH/DCM梯度洗脱)，然后用EtOH结晶，得到标题产物(固体，1.2g，57％)；1H NMR(DMSO-d6)δ2.68(s，3H)，3.60(s，3H)，7.04(t，1H)，7.37(d，1H)，7.55(d，1H)，7.70(s，1H)，7.94(m，2H)，8.89(s，1H)；MS m/e MH+465。
中间体66-[4-(3-碘苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]-4-(甲基磺酰基)噻吩并[2，3-d]嘧啶将m-CPBA(70-75％，399mg)加入到6-[4-(3-碘苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]-4-(甲硫基)噻吩并[2，3-d]嘧啶(300mg)的DCM(20ml)溶液中，搅拌24小时。加入焦亚硫酸钠水溶液，混合物用DCM萃取。有机相用NaHCO3饱和水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤后真空浓缩，得到标题化合物(黄色固体，220mg，68％)；1H NMR(DMSO-d6)δ3.50(s，3H)，3.66(s，3H)，7.04(t，1H)，7.38(d，1H)，7.59(d，1H)，8.00(m，3H)，9.34(s，1H)；MS m/e MH+497。
中间体76-[4-(3-碘苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺将6-[4-(3-碘苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]-4-(甲基磺酰基)噻吩并[2，3-d]嘧啶(200mg)和浓氨水(5ml)在1，4-二烷(15ml)中搅拌17小时。蒸发溶剂，残余物用硅胶色谱纯化(依次用0-50％EtOAc/DCM、0-20％MeOH/DCM梯度洗脱)，得到标题化合物(无色固体，136mg，78％)；1H NMR(DMSO-d6)δ3.58(s，3H)，7.06(t，1H)，7.42(d，1H)，7.56(d，1H)，7.65(m，3H)，7.95(m，2H)，8.32(s，1H)。
MS m/e MH+434。
中间体86-(4-{3-[(二苯基亚甲基)氨基]苯基}-1-甲基-1H-咪唑-5-基)噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺将6-[4-(3-碘苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺(860mg)、二苯甲酮亚胺(540mg)、1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁(120mg)、双(亚苄基丙酮)钯(100mg)和叔丁醇钠(960mg)的二烷(40ml)溶液脱气，然后在惰性气氛、90℃下加热。17小时后，冷却反应混合物，用水(50ml)稀释，用EtOAc(2×30ml)萃取，有机萃取液用盐水洗涤，干燥，过滤后真空浓缩。通过硅胶色谱纯化(用DCM/MeOH(0-10％)洗脱)，得到标题化合物(0.48g，50％)；1H NMR(CDCl3)δ3.32(s，3H)，5.75(bs，2H)，6.40-6.45(m，1H)，6.85-6.94(m，4H)，6.83-7.15(m，5H)，7.28-7.32(m，2H)，7.35-7.40(m，1H)，7.48(s，1H)，7.57-7.62(m，2H)，8.40(s，1H)；MS m/e MH+487。
中间体96-[4-(3-氨基苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺将2M HCl(0.75ml)加入到6-(4-{3-[(二苯基亚甲基)氨基]苯基}-1-甲基-1H-咪唑-5-基)噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺(0.45g)的THF(15ml)溶液中，搅拌10分钟，然后在水和EtOAc间分配。分离出水层，用浓氨水碱化至pH 9，用DCM(3×30ml)萃取，干燥合并的有机物，过滤后和真空浓缩，得到标题化合物(无色固体，0.33g，100％)；1H NMR(DMSO-d6)δ3.54(s，3H)，4.96(bs，2H)，6.36-6.39(m，1H)，6.55-6.57(m，1H)，6.83-6.88(m，2H)，7.56(bs，2H)，759(s，1H)，7.82(s，1H)，8.28(s，1H)；MS m/e MH+323。
权利要求
1.一种式I化合物及其盐或溶剂合物 式I其中Z选自N和CH；W选自N和CH；X选自NH和CH2；Y选自F、Cl、Br和I；n为1、2或3。
2.权利要求1的式I化合物及其盐或溶剂合物，其中Z为N。
3.权利要求1或2的式I化合物及其盐或溶剂合物，其中Y选自F和/或Cl。
4.权利要求1的式I化合物，所述化合物选自一种或多种下列化合物(1)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氟苯基)脲；(2)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氟苯基)脲；(3)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氯苯基)脲；(4)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氯苯基)脲；(5)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氟苯基)乙酰胺；(6)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(2-氟苯基)乙酰胺；(7)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氯苯基)乙酰胺；(8)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2′-(2-氯苯基)乙酰胺；(9)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氟苯基)脲；(10)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氟苯基)脲；(11)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氯苯基)脲；(12)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氯苯基)脲；(13)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氟苯基)乙酰胺；(14)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(2-氟苯基)乙酰胺；(15)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氯苯基)乙酰胺；(16)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(2-氯苯基)乙酰胺；以及它们的盐或溶剂合物。
5.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1-4中任一项限定的式I化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体。
6.权利要求1-4中任一项限定的式I化合物或其药学上可接受的盐，它们用作药物。
7.权利要求1-4中任一项限定的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用作温血动物例如人的Tie2受体酪氨酸激酶抑制剂的药物中的用途。
8.权利要求1-4中任一项限定的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于在温血动物例如人产生抗血管生成作用的药物中的用途。
9.一种制备式I化合物或者其盐或溶剂合物的方法，其中X为NH且Z、W、Y和n如式I中定义，所述方法包括使式II的胺与式III的异氰酸酯反应， 式II式III此后如果需要i)将一种式(I)化合物转化为另一种式(I)化合物；ii)形成盐或溶剂合物。
全文摘要
式(I)化合物，它可用于在温血动物例如人产生抗血管生成作用，其中各取代基如本发明说明书中定义。该化合物是Tie2受体酪氨酸激酶(TEK)抑制剂。
文档编号A61P35/00GK1942475SQ200580011955
公开日2007年4月4日 申请日期2005年2月1日 优先权日2004年2月5日
发明者C·D·琼斯, R·W·A·卢克, W·麦库尔 申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司
技术领域：
本发明涉及具有抗血管生成活性的化合物或其药学上可接受的盐，它们可用于治疗动物或人体的血管生成相关性疾病的方法。本发明还涉及所述化合物、含有作为活性成分的所述化合物的药物组合物的制备方法，而且还涉及利用所述化合物制备用于在温血动物(例如人)产生抗血管生成作用的药物的方法。
Tie2受体酪氨酸激酶(也称为TEK)主要在内皮细胞和造血细胞中表达，它们是血管形成和维护所必不可少的(Jones，N.等，NatureReviews Molecular Cell Biology.，20012，257-67)。
血管生成是从现有血管系统产生新血管的基本过程。血管生成是几乎所有器官的形成和生理功能所必需的重要而又复杂的生物学过程。一般来讲，血管生成实质上是一个短暂过程，而且受到局部血管生成因子和血管抑制因子平衡的控制，这样一个多步过程包括血管萌芽、分支和内皮细胞形成小管(包括例如内皮细胞(EC)活化、血管抑制解除、降解酶的合成及释放、EC迁移、EC增生、EC组构及分化、血管成熟等过程)。
正常血管生成在许多过程中起着重要作用，并且处于严格控制之下。在成人，生理性血管生成主要限于伤口愈合以及若干女性生殖功能和胚胎发育过程。在不良性或病理性血管生成中，血管生成因子和血管抑制因子间的局部平衡失调，导致不当和/或结构异常性血管形成。伴有病理性血管生成的疾病包括糖尿病性视网膜病、牛皮癣、癌症、类风湿性关节炎、动脉粥样化、卡波西肉瘤(Kaposi′ssarcoma)和血管瘤(Fan等，1995，Trends Pharmacology.Science.1657-66；Folkman，1995，Nature Medicine 127-31)。在癌症中，超过1-2mm3的原发性瘤和继发性瘤的生长需要血管生成(Folkman，J.New England Journal of Medicine，1995；33，1757-1763)。
疾病发展依赖不良性血管生成的疾病(例如癌症)中，阻断血管生成可阻止疾病的发展(Folkman，J.1995，Nature Medicine.127-31)。科技文献介绍了许多在血管生成的调控方面起着决定性作用的因子。两大类血管生成因子为血管内皮生长因子(VEGF)和促血管生成素。这些多肽部分与它们各自的受体(跨膜酪氨酸激酶，主要是内皮细胞特异性的)相互作用，经过配体介导的信号转导诱导细胞反应。据推测，在正常血管生成和病理性血管生成中，VEGF和促血管生成素通过其相应受体的信号转导协同调控血管生成过程的各个方面。
受体酪氨酸激酶(RTK)在跨细胞质膜生物化学信号传导中起重要作用。这些跨膜分子的特征性组成为依次连接在一起的细胞外配体结合域、质膜段、细胞内酪氨酸激酶域。配体与受体结合刺激受体相关性酪氨酸激酶活性，导致受体和其它细胞内分子上的酪氨酸残基磷酸化。酪氨酸磷酸化中的这些变化启动信号级联，产生不同细胞反应。迄今为止，通过氨基酸序列同源性定义鉴定出至少19种不同RTK亚家族。目前，一种亚家族的成员有fms样酪氨酸激酶受体(即Flt或Flt1)、含激酶插入域的受体(即KDR)(也称为Flk-1)以及另一种fms样酪氨酸激酶受体(即Flt4)。其中两种相关性RTK即Flt和KDR与VEGF高亲和性结合(De Vries等，1992，Science 255989-991；Terman等，1992，Biochem.Biophys.Res.Comm.1992，1871579-1586)。VEGF与这两源异种细胞表达的受体结合伴有细胞蛋白酪氨酸磷酸化和钙流量变化。
最近鉴定出主要为内皮细胞特异性受体的第二个家族，这些受体调控血管解除抑制以及血管成熟。在正常血管生成和病理性血管生成中，Tie受体及其配体促血管生成素与VEGF紧密地协同作用。跨膜受体Tie1和Tie2构成参与维护血管完整性的内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体家族，而且它们参与血管生成性增生和血管再建。Tie1和Tie2在结构上有许多相同特征(例如，这两种受体的胞内域均包含被激酶插入区间断的酪氨酸激酶域)，因此构成一个独特的RTK亚家族。Tie1和Tie2受体之间氨基酸水平的总体序列同一性为44％，而它们的胞内域为76％同源性。目标性破坏Tie1基因导致以大出血和微血管完整性差为特征的致死性表型(Puri，M.等，1995EMBOJournal145884-5891)。Tie2缺陷型转基因小鼠出现血管萌芽和再建缺陷，在妊娠中期表现出由胚胎血管系统严重缺陷引起的致死性表型(E9.5-10.5)(Sato，T.等，1995Nature 37070-74)。
迄今为止，还没有鉴定出Tie1的配体，对它的信号转导能力也了解甚少。然而，人们认为Tie1通过与Tie2受体的异二聚化影响Tie2的信号转导(因此有可能调控Tie2自身磷酸化的能力(Marron，M.等，2000Journal of Biological Chemistry275，39741-39746)，最近对嵌合Tie1受体的研究表明，Tie-1可通过PI 3激酶/Akt信号转导途径抑制细胞凋亡(Kontos，C.D.等，2002Molecular and Cellular Biology22，1704-1713)。相比之下，已经鉴定出Tie2的许多配体(称为促血管生成素)，其中对促血管生成素1(Ang1)进行了最充分的表征。Ang1结合通过自身磷酸化诱导Tie2受体酪氨酸磷酸化，然后经信号转导激活其信号转导途径。据报道，Ang2在内皮细胞中起拮抗作用(Maisonpierre，P.等，1997Science277，55-60)。Tie2及其配体的敲出(knock-out)和转基因操作表明，对Tie2信号转导的严格空间和时间控制对新血管系统的正常发育是绝对必要的。还报道了至少另外两种配体(Ang3和Ang4)，这两种促血管生成素配体之间也可能产生异二聚化(具有改进与受体结合时的活性(激动/拮抗)的潜能)。Ang1激活Tie2受体抑制细胞凋亡(Papapetropoulos，A.等，2000Journal ofBiological Chemistry2759102-9105)、促进血管内皮细胞萌芽(Witzenbicher，B.等，1998Journal of Biological Chemistry273，18514-18521)、血管生成期间在体内促进血管成熟以及降低成熟微血管渗透性及随后的渗漏(Thurston，G.等，2000Nature Medicine6，460-463)。因此，有报道说，活化Tie2受体参与新血管的分支、萌芽和增生，在维持血管完整性和整体性上非常重要的外周内皮支持细胞的募集及相互作用似乎与促进微血管稳定性一致。不能活化Tie2或者抑制Tie2自身磷酸化可导致血管结构紊乱和基质/细胞联络中断(Brindle，N.，出版中，2002)，然后触发内皮细胞死亡，尤其是在缺乏存活或生长刺激因子情况下。基于上述报道的Tie2激酶活性的作用，抑制Tie2激酶可产生抗血管生成作用，因此可用于治疗伴有病理性血管生成的疾病。已证实，Tie2表达在多种肿瘤的新血管系统中向上调节，例如Peters，K.G.等，(British Journal of Cancer 1998；77，51-56)，表明抑制Tie2激酶活性将产生抗血管生成作用。支持这种假说的是，可溶性Tie2受体(胞外域)的研究证明了在体内肿瘤模型中的抗肿瘤活性(Pengnian，L.等，1997，Journal of Clinical Investigation1997100，2072-2078；Pengnian，L.等，1998，Proceedings of tbe NationalAcademy of Sciences 199895，8829-8834)。另外，这些实验还证明，正常健康个体的Tie2信号转导途径破坏完全可以耐受，因为在这些研究中未发现毒副作用。
对人原发性乳腺癌样品以及人和鼠乳腺癌细胞系的研究(Stratmann，A.等，2001，International Journal of Cancer91，273-282)表明，肿瘤血管生成的Tie2依赖途径可与KDR依赖途径同时存在，事实上，这两种途径可独立发挥作用(Siemeister G.等，1999CancerResearch59，3185-3191)也可以彼此协同起作用(例如据报道，VEGFA和Ang1联合诱导血管生成并产生非渗漏成熟血管，Thurston，G.等，1999Science286，2511-2514)。很有可能这些血管生成过程甚至共同存在于一个肿瘤中。
还证实，Tie2在称为静脉畸形(VM)的血管异常中起作用(Mulliken，J.B.和Young，A.E.1998，Vascular BirthmarksW.B.Saunders，Philadelphia)。这类缺陷可以是遗传性的，也可以是散发性的。VM常见于皮肤或粘膜，但是也可影响任何其它器官。典型病变为海绵状蓝到紫的血管团，血管团为大量扩张的内衬内皮细胞的血管。在遗传性VM中，最常见的缺陷是在Tie2编码序列中的Tie2激酶突变C2545T(Calvert，J.T.等，1999Human Molecular Genetics8，1279-1289)，这种突变在激酶域中产生R849W氨基酸取代。对这种Tie2突变体的分析表明，即使在缺乏配体的情况下，Tie2突变体也被组成型活化(Vikkula，M.等，1996Cell87，1181-1190)。
Tie2表达的上调还见于人关节连接的血管性滑膜关节翳，它与不良新血管形成的作用是一致的。
这样的实例进一步表明，抑制Tie2磷酸化及其随后的信号转导可用于治疗不良新血管形成的各种病症。迄今为止，本领域仅仅已知几种Tie2抑制剂。因此需要鉴定其它Tie2抑制剂，利用其抑制/调节Tie2信号转导途径的治疗潜力。
我们发现某些化合物具有对Tie2受体酪氨酸激酶的抑制活性，因此具有治疗伴有病理性血管生成的疾病的价值，例如癌症、类风湿性关节炎和其它不良的活动性血管生成疾病。
本发明的第一方面提供下式I的化合物以及其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐) 式I其中Z选自N和CH；W选自N和CH；X选自NH和CH2；
Y选自F、Cl、Br和I；n为1、2或3。
本发明的第二方面提供下式I的化合物以及其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐) 式I其中Z为N；W选自N和CH；X选自NH和CH2；Y选自F、Cl、Br和I；n为1、2或3。
本发明化合物特别包括例如这样的式I化合物或者其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐)其中Z为N，W为N，X、Y和n如上文中定义。本发明化合物还特别包括例如这样的式I化合物或者其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐)其中Z为N，W为CH，X、Y和n如上文中定义。
本发明的第三方面提供下式的I化合物以及其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐)
式I其中Z选自N和CH；W为N；X选自NH和CH2；Y选自F、Cl、Br和I；n为1、2或3。
本发明化合物特别包括例如这样的式I化合物或者其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐)其中Z为CH，W为N，X、Y和n如上文中定义。
本发明的第四方面提供下式的I化合物以及其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐) 式I其中
Z选自N和CH；W为CH；X选自NH和CH2；Y选自F、Cl、Br和I；n为1、2或3。
本发明化合物特别包括例如这样的式I化合物或者其盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐)其中Z为CH，W为CH，X、Y和n如上文中定义。
如上所述，在本发明化合物中，Y选自氟、氯、溴和碘，特别选自氟和氯。
应当理解的是，n为2或3时，Y可以是相同或不同的。
本发明的具体化合物是一种或多种下列化合物(1)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氟苯基)脲；(2)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氟苯基)脲；(3)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氯苯基)脲；(4)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氯苯基)脲；(5)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氟苯基)乙酰胺；(6)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(2-氟苯基)乙酰胺；(7)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氯苯基)乙酰胺；(8)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2′-(2-氯苯基)乙酰胺；
(9)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氟苯基)脲；(10)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氟苯基)脲；(11)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氯苯基)脲；(12)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氯苯基)脲；(13)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氟苯基)乙酰胺；(14)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(2-氟苯基)乙酰胺；(15)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氯苯基)乙酰胺；(16)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(2-氯苯基)乙酰胺；以及它们的盐或溶剂合物(尤其是其药学上可接受的盐)。
式I化合物的合适的药学上可接受的盐为例如式I化合物的酸加成盐，例如与无机酸或有机酸的酸加成盐，所述无机酸或有机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、三氟乙酸、柠檬酸或马来酸；或者例如具有足够酸性的式I化合物的盐，例如碱金属盐或碱土金属盐(例如钙盐或镁盐)、铵盐、或与有机碱的盐，所述有机碱如甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟基乙基)胺。
应当理解的是，由于以上定义的某些式I化合物存在一个或多个不对称碳原子，所以可以为旋光型或外消旋型，本发明定义中包括具有上述活性的任何这样的旋光型或外消旋型。可用本领域公知的有机化学标准技术合成旋光型化合物，例如用旋光原料合成或者通过拆分外消旋型。同样地，可用下文提及的标准实验室技术评价上述活性。
还应当理解的是，某些式I化合物可能存在溶剂合物以及非溶剂合物形式，例如水合物形式。还应当理解的是，本发明包括所有具有Tie2受体酪氨酸激酶抑制作用的溶剂合物形式。
还应当理解的是，某些式I化合物可能具有同质多晶，本发明包括所有具有Tie2受体酪氨酸激酶抑制作用的同质多晶。
还应当理解的是，本发明涉及式I化合物的具有Tie2受体酪氨酸激酶抑制作用的所有互变异构体。
虽然优选本发明化合物的药学上可接受的盐，但是本发明化合物的其它非药学上可接受的盐也是有用的，例如在制备本发明化合物的药学上可接受的盐时使用。
本发明的另一方面还提供本文定义的本发明化合物的前药。本发明化合物可以前药形式给予，前药在人体或动物体内分解得到式(I)化合物。前药的实例包括体内可水解的式(I)化合物的酰胺。
前药的各种形式是本领域已知的。有关这样的前药衍生物的例子参见a)Design of Prodrugs，H.Bundgaard编辑，(Elsevier，1985)，Methods in Enzymology，第42卷，第309-396页，K.Widder等编辑，(Academic Press，1985)；b)A Textbook of Drug Design and Development，Krogsgaard-Larsen和H.Bundgaard编辑，第5章，“Design and Application ofProdrugs”，H.Bundgaard编辑，第113-191页(1991)；c)H.Bundgaard，Advanced Drug Delivery Reviews，8，1-38(1992)；d)H.Bundgaard等，Journal of Pharmaceutical Sciences，77，285(1988)；e)N.Kakeya等，Chem Pharm Bull，32，692(1984)。
式I化合物或其药学上可接受的盐可通过任何已知适于制备相关化合物的方法制备。当这样的方法用于制备式I化合物时，这些方法为本发明的另一特征，并且通过以下的各种代表性方法举例说明。必需的原料可通过有机化学的标准方法获得。这类原料的制备结合下面的各种代表性方法进行介绍，并在后面的实施例中进行介绍。或者，通过与例子类似的方法获得必需的原料，这属于有机化学人员的普通技能。
本发明的再一方面提供式I化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中X为NH和Z，W、Y和n如式I中定义，所述方法包括使式II的胺与式III的异氰酸酯反应， 式II 式III此后如果需要i)将一种式(I)化合物转化为另一种式(I)化合物；ii)形成盐或溶剂合物。
上述方法适宜在合适的惰性溶剂或稀释剂(例如醚，例如四氢呋喃、DMF、DCM、DMA或吡啶)中进行。该方法最好在50℃以下(例如0-30℃)进行，优选在室温下进行。
式II的胺可以通过以下的反应流程(i)制备流程(i)其中(a)哌嗪/THF，(b)m-CPBA/DCM，(c)浓氨水/1，4-二烷，(d)二苯甲酮亚胺、1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁、双(亚苄基丙酮)钯和叔丁醇钠的二烷溶液，(e)HCl/THF 式IIa化合物可以通过以下的反应流程(ii)制备流程(ii) 式IIb的砜可以如下制备三甲基甲硅烷基氯、3-碘苯甲醛、甲酰胺和甲苯亚磺酸反应，得到{(3-碘苯基)[(4-甲基苯基)磺酰基]甲基}甲酰胺，然后使{(3-碘苯基)[(4-甲基苯基)磺酰基]甲基}甲酰胺与三氯氧化磷反应，得到式IIb的砜。
本发明的另一方面提供式I化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中X为CH2，Z、W、Y和n如式I中定义，所述方法包括使式II的胺与适当的酰基氯或酰基酯反应，本领域技术人员能够理解。
当需要式I化合物的药学上可接受的盐(例如酸加成盐)时，可使用常规方法通过例如式I化合物与合适的酸(如盐酸)反应获得。当需要式I化合物的游离碱形式时，式I化合物的酸加成盐可以用合适的碱进行处理，所述碱包括例如有机胺碱(如吡啶、2，6-二甲基吡啶、三甲基吡啶、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺、吗啉、N-甲基吗啉或二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯)或者例如碱金属或碱土金属的碳酸盐或氢氧化物(如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、氢氧化钠或氢氧化钾)。
某些式I化合物可为立体异构体形式。应当理解的是，本发明包括所有式I化合物的几何异构体和旋光异构体及其混合物(包括外消旋物)。互变异构体及其混合物也属于本发明。
异构体可通过常规方法(例如色谱法或分级结晶)拆分或离析。可使用常规方法(例如手性高效液相色谱法(HPLC))离析化合物的外消旋物或其它混合物，从而分离出各对映异构体。或者，所需的旋光异构体可以如下制备在不引起外消旋化的条件下通过合适的旋光原料反应而制备，或者通过用例如纯手性酸衍生化，然后用常规方法(例如HPLC、硅胶色谱法)分离非对映异构体衍生物而制备，或者可用非手性原料和手性试剂制备。所有立体异构体都属于本发明范畴。
本发明化合物可使用常规技术从它们的反应混合物中分离。
应当理解的是，在本文提及的一些反应中，可能需要保护化合物的任何敏感基团。在需要保护的情形下，合适的保护方法是本领域技术人员已知的。可依照标准规程使用常规保护基(例如参见T.W.Green，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，1991)。因此，如果反应物包含例如氨基、羧基或羟基等基团，在本文提及的一些反应中就可能需要保护所述基团。保护基可通过文献介绍的任何常规方法或者本领域化学工作者熟知的方法脱去，所选择的方法应适于脱去保护基团而对分子的其它基团干扰最小。
为了方便起见，下面给出保护基的具体实例，其中“低级”用于例如低级烷基时，表示该基团优选具有1-4个碳原子。应当理解的是，这些实例为非穷尽性实例。下文为脱去保护基而给出的具体方法实例同样是非穷尽性实例。当然，未特别提及的保护基的使用和脱保护的方法也属于本发明范畴。
羧基保护基可为酯形成性脂肪醇或芳基脂肪醇的残基，或者为酯形成性甲硅烷醇的残基(所述醇或甲硅烷醇优选包含1-20个碳原子)。羧基保护基的实例包括直链或支链(1-12C)烷基(例如异丙基和叔丁基)；低级烷氧基-低级烷基(例如甲氧基甲基、乙氧基甲基和异丁氧基甲基)；低级酰氧基-低级烷基(例如乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基和新戊酰氧基甲基)；低级烷氧基羰基氧基-低级烷基(例如-甲氧基羰基氧基乙基和1-乙氧基羰基氧基乙基)；芳基-低级烷基(例如苄基、4-甲氧基苄基、2-硝基苄基、4-硝基苄基、二苯甲基和2-苯并[c]呋喃酮基)；三(低级烷基)甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基)；三(低级烷基)甲硅烷基-低级烷基(例如三甲基甲硅烷基乙基)；以及(2-6C)烯基(例如烯丙基)。特别适合脱去羧基保护基的方法包括例如酸-、碱-、金属-或酶催化裂解。
羟基保护基的实例包括低级烷基(例如叔丁基)；低级烯基(例如烯丙基)；低级烷酰基(例如乙酰基)；低级烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基)；低级烯基氧基羰基(例如烯丙基氧基羰基)；芳基-低级烷氧基羰基(例如苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基和4-硝基苄氧基羰基)；三(低级烷基)甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基)以及芳基-低级烷基(例如苄基)。
氨基保护基的实例包括甲酰基、芳基-低级烷基(例如苄基和取代的苄基、4-甲氧基苄基、2-硝基苄基和2，4-二甲氧基苄基以及三苯基甲基)；二-4-茴香基甲基和呋喃基甲基；低级烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基)；低级烯基氧基羰基(例如烯丙基氧基羰基)；芳基-低级烷氧基羰基(例如苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基和4-硝基苄氧基羰基)；三烷基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基)；亚烷基(例如亚甲基)以及亚苄基和取代的亚苄基。
适于脱去羟基和氨基保护基的方法包括例如适用于2-硝基苄氧基羰基等基团的酸-、碱-、金属-或酶催化水解法，适用于例如苄基等基团的氢化法以及适用于例如2-硝基苄氧基羰基等基团的光解法。
还应当理解的是，本发明化合物的某些不同环取代基可通过标准芳族取代反应引入，或者在进行上述方法前或进行上述方法后立即通过常规官能团修饰产生，这类方法属于本发明的方法。这类反应和修饰方法包括，例如通过芳族取代反应方法引入取代基、还原取代基、烷化取代基和氧化取代基。这类方法所用试剂和反应条件是化学领域公知的。芳族取代反应的具体实例包括引入卤素。
生物学测定下列测定可用于测定本发明化合物用作体外Tie2抑制剂以及用作完整细胞的Tie2自身磷酸化抑制剂的效果。
a.体外受体酪氨酸激酶抑制测定为了测试化合物对Tie2受体酪氨酸激酶的抑制作用，用非细胞蛋白激酶测定测试化合物抑制蛋白激酶磷酸化含酪氨酸的多肽底物的能力，测定方法为ELISA型微量板测定法。在这种特定情形下，测定三种不同的重组人酪氨酸激酶Tie2、KDR和Flt的IC50值。
使用标准分子生物学克隆和诱变技术产生重组受体基因以促进产生酪氨酸激酶。这些基因中编码的重组蛋白片段仅仅是每种受体的细胞内C-末端部分，其中存在激酶域。克隆编码包含激酶域的片段的重组基因，在标准杆状病毒/Sf21系统(或替代的等同物)中表达。
蛋白表达后用宿主昆虫细胞制备裂解物，方法是用冰冷的裂解缓冲液(20mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)pH7.5、150mMNaCl、10％甘油、1％Triton X-100、1.5mM MgCl2、1mM乙二醇-双(β-氨基乙醚)N′，N′，N′，N′-四乙酸(EGTA))加上蛋白酶抑制剂处理，然后通过离心澄清。将Tie2、KDR和Flt1裂解物以等分量在-80℃贮藏。
通过测定这些重组蛋白磷酸化合成肽(由6∶3∶1比率的谷氨酸、丙氨酸和酪氨酸的随机共聚物组成)的能力，来确定它们的组成型激酶活性。具体地说，用100微升合成肽Sigma P3899(先用PBS按1∶500稀释1mg/ml母液(PBS)，然后包被板)包被Nunc MaxisorbTM96孔免疫板后，于4℃孵育过夜。在室温下用50mM HEPES(pH7.4)洗涤免疫板，以除去任何过量的未结合的合成肽。
测试Tie2、KDR或Flt1的活性，方法是在肽包被板中在室温下孵育适当的新鲜稀释的裂解物(分别为1∶200、1∶400和1∶1000)，裂解物的反应液包括100mM HEPES(pH7.4)、5微摩尔(或相应酶的Km浓度)三磷酸腺苷(ATP)、10mM MnCl2、0.1mM Na3VO4、0.2mM DL-二硫苏糖醇(DTT)、0.1％Triton X-100和试验化合物的DMSO溶液(最终浓度2.5％)，最终化合物浓度为0.05微摩尔至100微摩尔，孵育时间分别为60分钟(Tie2)或20分钟(KDR、Flt)。除去该测定的液体成分终止反应，然后用PBS-T(含0.5％吐温20的磷酸缓冲盐溶液)或者替代的等同洗涤缓冲液洗涤该板。
通过免疫学方法检测该反应的固定磷酸肽产物。首先，将板在室温下与鼠单克隆抗磷酸酪氨酸-HRP(辣根过氧化物酶)缀合抗体(4G10，Upstate Biotechnology UBI 16-105)孵育4小时。然后用PBS-T彻底洗涤，比色测定该板的每孔HRP活性，使用22’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6)]二铵盐晶体ABTS(Sigma P4922-根据产品说明书制备)为底物，孵育30-45分钟后显色，然后加入100μl 1M H2SO4终止反应。
定量显色并在Molecular Devices ThermoMax微量板读板仪上在405nm测量吸光度来确定酶活性。特定化合物的激酶抑制作用以IC50值表示，通过计算在测定中抑制50％磷酸化所需的试验化合物浓度而确定。用阳性(溶媒和ATP)对照值和阴性(溶媒而无ATP)对照值计算磷酸化程度。
b.细胞Tie2自身磷酸化该测定基于测量化合物抑制Tie2受体自身磷酸化的能力，自身磷酸化通常导致产生“活化”受体，然后“活化”受体启动与受体功能有关的的特定信号转导途径。
自身磷酸化可通过多种方法完成。已知杆状病毒系统中重组激酶域的表达可产生磷酸化活化受体。也有报道，在缺失配体的情况下，重组细胞系中受体的过量表达本身就能导致受体自身磷酸化(Heldin C-H.1995Cell80，213-223；Blume-J.P，Hunter T.2001Nature411，355-65)。此外，在大量文献实例中，构建了嵌合受体。在这些情形中，受体的天然外部细胞表面域被已知因为加入适当配体而易于二聚化的结构域取代(例如TrkA-Tie2/NGF配体(Marron，M.B.等，2000Journal of Biological Chemistry27539741-39746)或C-fms-Tie-1/CSF-1配体(Kontos，C.D.等，2002Molecular and CellularBiology22，1704-1713)。因此，当嵌合受体在宿主细胞系中表达而且加入各自的配体时，诱导嵌合受体的激酶域自身磷酸化。该方法的优点是通常允许使用已知(且常常容易获得)的配体，而不必鉴定和分离每种目标受体的天然配体。
当然，如果可获得配体，则可使用已知表达目标受体而且容易用配体刺激以实现配体诱导的磷酸化的天然细胞系或原代细胞。化合物抑制Tie2受体自身磷酸化的能力可通过此测定法测量，Tie2受体在例如EA.hy926/B3细胞(J.McLean/B.Tuchi，Univ.of N.Carolina atChapel Hill，CB-4100，300Bynum Hall，Chapel Hill，N.C.27599-41000，USA)或原代HUVEC(人脐静脉内皮细胞，市售的)中表达。
使用标准纯化技术可从肿瘤细胞上清液分离天然Ang1配体，或者使用标准分子生物学技术和表达系统可克隆和重组表达Ang1基因。在此情形下，可尝试生产自然状态配体或者作为重组蛋白的配体，所述重组蛋白例如可能已经遗传工程改造以包含其它纯化标记(例如多聚组氨酸肽、抗体Fc域)，以便于该过程。
用配体刺激EA.hy926/B3或HUVEC细胞Tie2受体为例，可以构建Ang1配体刺激的细胞受体磷酸化测定，可以将其用于分析测量化合物抑制该过程的潜能。例如在6孔板上，最初接种密度为5×105细胞/孔，让EA.hy926/B3细胞在适当的组织培养基加上10％胎牛血清(FCS)中生长两天。第三天，用只含1％FCS的培养基代替前述培养基，让细胞血清饥饿总共2小时。在血清饥饿1小时40分钟后，除去培养基，更换为1ml试验化合物稀释液(用低血清培养基配制，而且DMSO浓度保持低于0.8％)。在血清饥饿1.5小时后，加入原钒酸盐(orthovanidate)至最终浓度为0.1mM，血清饥饿持续最后10分钟。
在血清饥饿总共2小时后，加入配体和原钒酸盐以刺激细胞Tie2受体自身磷酸化(配体可以用低血清培养基稀释的纯化原料加入，或以包含配体的非纯化细胞上清液加入(例如重组表达哺乳动物细胞时))。
在37℃下与配体孵育10分钟后，在冰上冷却细胞，用大约5ml含1mM原钒酸盐的冷PBS洗涤，然后向细胞中加入1ml冰冷的裂解缓冲液((20mM Tris(pH 7.6)、150mM NaCl、50mM NaF、0.1％SDS、1％NP40、0.5％DOC、1mM原钒酸盐、1mM EDTA、1mM PMSF、30μl/ml抑肽酶、10μg/ml胃酶抑素、10μg/ml亮抑酶肽)，放置冰上10-20分钟。除去裂解物后移入1.5ml Eppendorf管，在4℃以13000rpm离心3分钟。将800μl每种裂解物移入新的2ml Eppendorf管用于免疫沉淀。将3mg＝15μl抗磷酸酪氨酸抗体(Santa Cruz PY99-sc-7020)加入裂解物，在4℃下孵育2小时。将600μl洗涤MagnaBind珠(山羊抗小鼠IgG，Pierce 21354)加入裂解物，将试管在4℃下旋转过夜。
用磁体处理样品1分钟，然后小心除去裂解上清液。然后将1ml裂解缓冲液加入所述珠并重复该步骤两次。将所述珠悬浮于25μl 94℃的2×Laemmli加样缓冲液(含β-巯基乙醇)，在室温下静置15分钟。
将试管暴露于磁体1分钟以除去珠粒，把珠粒与免疫沉淀分离获得的全部液体加样到聚丙烯酰胺/SDS蛋白凝胶(预制4-12％BisTrisNuPAGE/MOPS 12孔凝胶，Novex)。在200V下电泳蛋白凝胶，然后在50V/250mA下转印到NC膜上1小时30分钟。所有印迹点在室温下用5％Marvel/PBS-吐温处理1小时，从而降低检测抗体的非特异性结合。将兔抗-Tie2(Santa Cruz sc-324)用0.5％Marvel/PBS吐温以1∶500稀释，在4℃下孵育过夜。用PBS-吐温严格洗清印迹点，然后加入用0.5％Marvel/PBS-吐温以1∶5000稀释的山羊抗兔-POD缀合物(Dako P0448)。抗体在室温下放置1小时，随后用PBS-吐温洗清印迹点。不同免疫沉淀物样品的蛋白质印迹点用LumiGLO(NEB 7003)显影印迹。然后移入X-Ray暗盒，对胶片曝光15秒/30秒和60秒。使用FluorS BioRad图像分析系统评估属于磷酸化Tie2受体的蛋白条带相对强度。确定每种试验化合物稀释系的磷酸化百分率，通过标准方法用适当的对照样品作参考计算IC50值。
尽管式I化合物的药理学性质如预期那样随结构的改变而发生变化，但是一般来说，式I化合物具有的活性可用下列浓度或剂量利用一种或多种上述测试(a)和(b)证实测试(a)-IC50值范围，例如＜100μM；测试(b)-IC50值范围，例如＜50μM；例如，实施例1在测试(a)中的IC50值为16μM，在测试(b)中的IC50值为0.4μM。
本发明的再一方面提供药物组合物，该组合物包含上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体。
本发明组合物可为适于口服的剂型(例如片剂、锭剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、水混悬剂、油混悬剂、乳剂、可分散粉剂或颗粒剂、糖浆剂或酏剂)、适于局部使用的剂型(例如乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、或者水性或油性溶液剂或混悬剂)、适于吸入给药的剂型(例如细粉剂或液体气雾剂)、适于吹入给药的剂型(例如细粉剂)或适于肠胃外给药的剂型(例如静脉、皮下、肌内或肌内给药的无菌水溶液或油溶液，或直肠给药的栓剂)。
本发明组合物可通过常规方法使用本领域公知的常规药用赋形剂获得。因此，口服的组合物可包含例如一种或多种着色剂、甜味剂、矫味剂和/或防腐剂。
活性成分与一种或多种赋形剂混合制备成单一剂型的剂量应随需要治疗的宿主和具体的给药途径而变化。例如，人口服给药的制剂通常包含例如0.5mg-0.5g(更合适为0.5-100mg，例如1-30mg)活性剂和适量赋形剂，赋形剂可占组合物总重量的约5-98％。
就治疗或预防目的而言，式I化合物的剂量大小应当根据疾病的性质和严重程度、动物或患者的年龄和性别以及给药途径，按公知的医学原则而变化。
在式I化合物用于治疗或预防目的时，通常可给予的日剂量为例如0.1mg/kg-75mg/kg体重，如果需要，以分剂量给药。当肠胃外给药时，一般给予较低的剂量。因此，例如静脉给药的常用剂量为例如0.1mg/kg-30mg/kg体重。类似地，吸入给药的剂量为例如0.05mg/kg-25mg/kg体重。然而优选口服给药，尤其优选以片剂给药。一般说来，单位剂型将包含约0.5mg-0.5g的本发明化合物。
本文定义的本发明化合物主要在于抗血管生成作用。本发明化合物广泛用于治疗或预防伴有不良血管生成或病理性血管生成的疾病，包括癌症、糖尿病、牛皮癣、类风湿性关节炎、卡波西肉瘤、血管瘤、淋巴水肿、急性和慢性肾病、动脉粥样化、动脉再狭窄、自身免疫性疾病、急性炎症、过度瘢痕形成和粘连、子宫内膜异位、机能障碍性子宫出血以及视网膜血管增生性眼部疾病。癌症可侵袭任何组织，包括白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。具体地说，这类本发明化合物有利于减缓原发性及复发性实体瘤的生长，例如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和皮肤癌。
我们认为，本发明化合物的抗血管生成特性来自它们的Tie2受体酪氨酸激酶抑制特性。相应地，本发明化合物可用于在需要这种治疗的温血动物体内产生Tie2抑制作用。因此，全部或部分通过本发明化合物抑制Tie2受体酪氨酸激酶，本发明化合物可用于产生抗血管生成作用。
更具体地说，本发明化合物可抑制与Tie2相关的任何形式的癌症。例如，与Tie2相关的原发性和复发性实体瘤生长，尤其是那些主要依赖Tie2受体酪氨酸激酶生长和扩散的肿瘤。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐，用作药物。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用作温血动物(例如人)的Tie2受体酪氨酸激酶抑制剂的药物中的用途。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于在温血动物(例如人)产生抗血管生成作用的药物中的用途。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗温血动物(例如人)的癌症的药物中的用途。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗温血动物(例如人)的以下癌症的药物中的用途白血病、乳腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、睾丸癌、成神经细胞瘤、肝癌、胆管癌、肾细胞癌、子宫癌、甲状腺癌和皮肤癌。
本发明的另一方面提供抑制需要这种治疗的温血动物(例如人)的Tie2受体酪氨酸激酶的方法，该方法包括对所述动物给予有效量的上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供在需要这种治疗的温血动物(例如人)产生抗血管生成作用的方法，该方法包括对所述动物给予有效量的上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供治疗需要这种治疗的温血动物(例如人)的癌症的方法，该方法包括对所述动物给予有效量的上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供治疗需要这种治疗的温血动物(例如人)的选自以下癌症的方法白血病、乳腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、睾丸癌、成神经细胞瘤、肝癌、胆管癌、肾细胞癌、子宫癌、甲状腺癌和皮肤癌，该方法包括对所述动物给予有效量的上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐，用于抑制温血动物(例如人)的Tie2受体酪氨酸激酶。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐，用于在温血动物(例如人)产生抗血管生成作用。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗癌症。
本发明的另一方面提供上文定义的式I化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗选自以下的癌症白血病、乳腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、睾丸癌、成神经细胞瘤、肝癌、胆管癌、肾细胞癌、子宫癌、甲状腺癌和皮肤癌。
如上所述，本发明化合物还具有抗其它不良或病理性血管生成介导疾病的活性，这些疾病包括牛皮癣、类风湿性关节炎、卡波西肉瘤、血管瘤、淋巴水肿、急性和慢性肾病、动脉粥样化、动脉再狭窄、自身免疫性疾病、急性炎症、过度瘢痕形成和粘连、子宫内膜异位、机能障碍性子宫出血以及视网膜血管增生性眼部疾病。
本文定义的抗血管生成活性可用作单独治疗或除本发明化合物外可包括一种或多种其它物质和/或治疗。这种联合治疗可通过同时、序贯或单独给予各种治疗来完成。在内科肿瘤学领域，使用不同疗法的联合疗法来治疗各个癌症患者是常见的。在内科肿瘤学领域，除上文定义的细胞周期抑制治疗外，这类联合疗法的其它疗法可为外科疗法、放射疗法或化学疗法。此种化学疗法可包括一种或多种以下抗肿瘤药物(i)抗侵袭剂(例如金属蛋白酶抑制剂(如马立马司他)和尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活物受体功能的抑制剂)；(ii)用于肿瘤的抗增生/抗肿瘤药物及其组合，例如烷化剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、白消安和亚硝基脲)；抗代谢剂(例如抗叶酸剂，例如氟嘧啶(如5-氟尿嘧啶和替加氟)、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和羟基脲，或者例如，优选欧洲专利申请562734中公开的一种抗代谢剂例如(2S)-2-{邻-氟-对-[N-{2，7-二甲基-4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-6-基甲基}-N-(丙-2-炔基)氨基]苯甲酰氨基}-4-(四唑-5-基)丁酸)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素如阿霉素、博来霉素、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、更生霉素和光辉霉素)；抗有丝分裂剂(例如长春生物碱如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春瑞滨，以及紫杉类药物如泰素和泰索帝)；以及拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(如依托泊苷和替尼泊苷)、安吖啶、托泊替康和喜树碱)；(iii)细胞抑制剂，例如抗雌激素类药(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和艾多昔芬)、抗雄激素类药(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑和依西美坦)和5α-还原酶抑制剂例如非那雄胺；(iv)生长因子功能抑制剂，例如这类抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体、法尼酰基转移酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族抑制剂(例如EGFR酪氨酸激酶抑制剂N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(ZD 1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(CP 358774)和6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033))，例如血小板衍生生长因子家族抑制剂以及例如肝细胞生长因子家族抑制剂；(v)作用机理与上文定义的药物不同的抗血管生成药，例如抑制血管内皮生长因子药，例如国际专利申请WO 97/22596、WO97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中公开的化合物以及通过其它机理起作用的药物(例如利诺胺、整联蛋白αvβ3功能抑制剂和血管生长抑素)；(vi)生物制剂治疗法，例如用螯合受体配体、阻断配体结合受体或者降低受体信号转导(例如由于增强受体降解或降低表达水平)的肽或蛋白(例如抗体或可溶性外受体域构建物)。
(vii)反义治疗法，例如靶向上述靶的反义药物，例如ISIS 2503，一种抗ras反义药物；(viii)基因治疗法，包括例如置换异常基因(例如异常的p53或者异常的BRCA1或BRCA2)的方法、GDEPT(基因定向酶前药治疗)方法(例如使用胞嘧啶脱氨基酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的方法)以及增强患者对化学疗法或放射疗法的耐受性的方法(例如多药抗性基因治疗)；(ix)免疫治疗法，包括例如离体和体内增强患者肿瘤细胞免疫原性的方法，例如用细胞因子(例如白介素2、白介素4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)转染的方法、降低T-细胞无反应性的方法、使用转染的免疫细胞(例如细胞因子转染的树突状细胞)的方法、使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法以及使用抗独特型抗体的方法。
这种联合治疗可通过同时、序贯或单独给予各个治疗组分来完成。这类联合药物产品使用上述剂量范围的本发明化合物以及批准剂量范围的其它药用活性药物。
本发明在这方面提供药物产品，该产品包含上文定义的式I化合物和上文定义的其它抗肿瘤药物，用于联合治疗癌症。
除治疗药物用途外，式I化合物及其药学上可接受的盐也可在体外和体内测试体系的开发和标准化中用作药理学工具，所述测试系统用于评价各种抑制剂对实验室动物(例如猫、狗、兔、猴、大鼠和小鼠)的细胞周期活性的作用，是寻找新型治疗药物的组成部分。
本发明现通过下列非限制性实施例说明，除非另有说明，否则(i)温度单位为摄氏度(℃)；在室温下或环境温度下进行操作，即18-25℃；(ii)有机溶液经无水硫酸镁干燥；在可达60℃的浴温下用旋转蒸发器减压(600-4000帕斯卡；4.5-30毫米汞柱)蒸发溶剂；(iii)色谱法是指硅胶快速色谱法；薄层色谱法(TLC)在硅胶板上进行；(iv)一般来讲，反应进程用TLC和/或分析型LC-MS跟踪，而给出的反应时间仅是示例性的；(v)最终产物具有符合要求的质子核磁共振(NMR)光谱数据和/或质谱数据；(vi)所给产量仅是示例性的，而不一定是通过最佳工艺过程获得的；如果需要更多物质，则重复进行制备；(vii)当给出的NMR数据为主要特征质子的δ值形式时，以相对于四甲基硅烷(TMS)内标的百万分之几(ppm)给出，除非另有说明，否则就用全氘二甲亚砜(DMSO-d6)作溶剂在300MHz进行测定；使用以下缩写词s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；b，宽峰；(viii)各种化学符号具有它们的常用含义；使用SI单位和符号；(ix)溶剂比为体积∶体积(v/v)；(x)质谱(MS)操作中采用70电子伏特的电子能，化学电离(CI)模式，使用直接暴露探头；其中所述电离通过电子碰撞(EI)、快速原子轰击(FAB)或电喷雾(ESP)实现；给出了m/z值；一般说来，仅报告指示母体质量的离子；除非另有说明，否则给出的质量离子为MH+；(xi)除非另有说明，否则没有折分包含不对称取代碳原子和/或硫原子的化合物；(xii)当指出某个合成类似于前面实施例介绍的合成时，各原料用量的毫摩尔比与前面实施例使用的毫摩尔比相同；(xvi)使用下列缩写词AcOH 乙酸AIBN 2，2′-偶氮二异丁腈DCM 二氯甲烷DIPEA 二异丙基乙胺DMA N，N-二甲基乙酰胺DMF N，N-二甲基甲酰胺DMSO 二甲亚砜DMTMM 氯化4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-dppf 1，1′-二(二苯膦基)二茂铁EtOAc酸乙酯HATU 六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲iPrMgCl 异丙基氯化镁LDA 二异丙基氨基锂
LHMDS 二(三甲基甲硅烷基)氨基锂m-CPBA间氯过苯甲酸MeOH 甲醇MeCN 乙腈MCX 混合型阳离子交换树脂MTBE 甲基叔丁基醚LCMS 液相色谱-质谱NMP 1-甲基-2-吡咯烷酮PhTosMIC α-甲苯磺酰基苄基胩POCl3磷酰氯RPHPLC反相高效液相色谱法TFA 三氟乙酸THF 四氢呋喃xvii)在指出某个合成得到酸加成盐(例如HCl盐)时，未指出该盐的化学计量关系。除非另有说明，否则所有NMR数据为游离碱物质的数据，分离的盐在转化为游离碱后进行表征。
实施例1N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氟苯基)脲将6-[4-(3-氨基苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺(64mg)的无水四氢呋喃(10ml)加入异氰酸3-氟苯酯(41mg)，在惰性气氛、室温下搅拌1小时。将混合物用DCM(5ml)稀释，然后用硅胶色谱纯化，依次用0-50％EtOAc/DCM、0-20％MeOH/DCM梯度洗脱，得到标题化合物(固体，71mg，77％)；1H NMR(DMSOd6)δ3.65(s，3H)，6.83(m，1H)，7.15(m，2H)，7.25(m，1H)，7.35(m，2H)，7.48(m，1H)，7.68(s，br 2H)，7.72(s，1H)，7.80(m，1H)，7.99(s，1H)，8.39(s，1H)，8.79(s，1H)，8.89(s，1H)；MS m/e MH+460。
实施例2N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氟苯基)脲将6-[4-(3-氨基苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺(64mg)的无水四氢呋喃(10ml)溶液加入异氰酸2-氟苯酯(34mg)，在惰性气氛、室温下搅拌1小时。混合物用DCM(5ml)稀释，然后用硅胶色谱纯化，依次用0-50％EtOAc/DCM、0-50％MeOH(含1％浓氨水)/DCM梯度洗脱，得到标题化合物(固体，76mg，82％)。
1H NMR(DMSOd6)δ3.58(s，3H)，7.00(m，1H)，7.20(m，5H)，7.58(s，br 2H)，7.68(s，1H)，7.78(m，1H)，7.91(s，1H)，8.04(m，1H)，8.34(s，1H)，8.45(s，1H)，9.00(s，1H)；MS m/e MH+460。
如下制备原料中间体1{(3-碘苯基)[(4-甲基苯基)磺酰基]甲基}甲酰胺在惰性气氛下，将三甲基甲硅烷基氯(9.1ml)加入到3-碘苯甲醛(15.1g)、甲酰胺(6.5ml)、MeCN(34ml)和甲苯(34ml)的搅拌溶液中。然后将反应物在50℃加热5小时。加入甲苯亚磺酸(15.3g)，将反应混合物在50℃加热5小时。冷却反应混合物至室温，加入甲基叔丁基醚(55ml)，搅拌5分钟。加入水(275ml)，冷却反应物至0℃，搅拌1小时。滤出固体，反应烧瓶用MTBE(2×35ml)洗涤，倒在滤饼上。将固体在真空烘箱中于60℃干燥10小时，得到不纯的标题化合物(固体，14g，51％)，将其直接使用无需再提纯。用EtOH结晶少量样品；主要(6∶1)旋转异构体的1H NMR(DMSO-d6)δ；2.43(s，3H)，6.42(d，1H)，7.15-8.00(m，9H)，9.73(d，1H)。
MS m/e MH+416。
中间体2(3-碘苯基)(异氰基)甲基4-甲基苯基砜在25℃，将POCl3(3.05ml)加入到{(3-碘苯基)[(4-甲基苯基)磺酰基]甲基}甲酰胺(6.23g)和无水THF(35ml)的搅拌溶液中，搅拌5分钟。冷却反应混合物至0℃，在45分钟内滴加Et3N(13.7ml)，保持内部温度在10℃以下。将反应混合物在5-10℃下再搅拌45分钟。加入EtOAc(140ml)和水(140ml)，然后搅拌5分钟。有机相依次用水(2×140ml)、NaHCO3(饱和水溶液，140ml)和盐水(140ml)洗涤。真空浓缩有机相，得到咖啡色树胶状物。使其通过硅胶垫，用DCM洗涤，真空浓缩，得到咖啡色树胶状物(纯度约为70％，3.5g，58％)；1H NMR(CDCl3)δ2.42(s，3H)，5.45(s，1H)，7.00-7.75(m，8H)；MS m/e(M-H)-396。
中间体34-(甲硫基)噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-甲醛在-78℃，将4-(甲硫基)噻吩并[2，3-d]嘧啶(J.Heterocycl.Chem.，1975，12，921-924)(1g)的THF(5ml)溶液加入到LDA[BuLi(1.6M己烷溶液，3.8ml)和二异丙胺(0.85ml)]和THF(20ml)的预制备溶液中。将反应混合物在-78℃搅拌1小时，然后加入DMF(1.1ml)。将反应混合物在-78℃搅拌30分钟，然后升至室温，再搅拌3小时。反应混合物用水稀释，产物用EtOAc(4×30ml)萃取。合并的有机萃取液用盐水(30ml)洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。用硅胶色谱法纯化(用DCM洗脱)，得到标题化合物(白色固体，117g，51％)；1H NMR(CDCl3)δ2.76(s，3H)，8.03(s，1H)，8.90(s，1H)，10.10(s，1H)；
MS m/e MH+211。
中间体4N-[4-(甲硫基)噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基亚甲基]甲胺在室温、惰性气氛下，将4-(甲硫基)噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-甲醛(13g)、甲胺(33％EtOH溶液，20.6ml)和无水MgSO4(20g)在DCM(465ml)中搅拌2天。过滤反应混合物，然后真空浓缩，得到标题化合物(棕色固体，13.8g，100％)；1H NMR(DMSOd6)δ2.70(s，3H)，3.45(s，3H)，7.82(s，1H)，8.62(s，1H)，8.89(s，1H)。
中间体56-[4-(3-碘苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]-4-(甲硫基)噻吩并[2，3-d]嘧啶将N-[4-(甲硫基)噻吩并[2，3-d[嘧啶-6-基亚甲基]甲胺(1.0g)、(3-碘苯基)(异氰基)甲基4-甲基苯基砜(3.4g，纯度70％)和哌嗪(0.77g)的THF(80ml)溶液在惰性气氛下搅拌4天。浓缩反应混合物，用水稀释，用EtOAc萃取。萃取液用NaHCO3饱和水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤后真空浓缩。硅胶色谱法纯化(依次用0-100％EtOAc/DCM、0-5％MeOH/DCM梯度洗脱)，然后用EtOH结晶，得到标题产物(固体，1.2g，57％)；1H NMR(DMSO-d6)δ2.68(s，3H)，3.60(s，3H)，7.04(t，1H)，7.37(d，1H)，7.55(d，1H)，7.70(s，1H)，7.94(m，2H)，8.89(s，1H)；MS m/e MH+465。
中间体66-[4-(3-碘苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]-4-(甲基磺酰基)噻吩并[2，3-d]嘧啶将m-CPBA(70-75％，399mg)加入到6-[4-(3-碘苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]-4-(甲硫基)噻吩并[2，3-d]嘧啶(300mg)的DCM(20ml)溶液中，搅拌24小时。加入焦亚硫酸钠水溶液，混合物用DCM萃取。有机相用NaHCO3饱和水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤后真空浓缩，得到标题化合物(黄色固体，220mg，68％)；1H NMR(DMSO-d6)δ3.50(s，3H)，3.66(s，3H)，7.04(t，1H)，7.38(d，1H)，7.59(d，1H)，8.00(m，3H)，9.34(s，1H)；MS m/e MH+497。
中间体76-[4-(3-碘苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺将6-[4-(3-碘苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]-4-(甲基磺酰基)噻吩并[2，3-d]嘧啶(200mg)和浓氨水(5ml)在1，4-二烷(15ml)中搅拌17小时。蒸发溶剂，残余物用硅胶色谱纯化(依次用0-50％EtOAc/DCM、0-20％MeOH/DCM梯度洗脱)，得到标题化合物(无色固体，136mg，78％)；1H NMR(DMSO-d6)δ3.58(s，3H)，7.06(t，1H)，7.42(d，1H)，7.56(d，1H)，7.65(m，3H)，7.95(m，2H)，8.32(s，1H)。
MS m/e MH+434。
中间体86-(4-{3-[(二苯基亚甲基)氨基]苯基}-1-甲基-1H-咪唑-5-基)噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺将6-[4-(3-碘苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺(860mg)、二苯甲酮亚胺(540mg)、1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁(120mg)、双(亚苄基丙酮)钯(100mg)和叔丁醇钠(960mg)的二烷(40ml)溶液脱气，然后在惰性气氛、90℃下加热。17小时后，冷却反应混合物，用水(50ml)稀释，用EtOAc(2×30ml)萃取，有机萃取液用盐水洗涤，干燥，过滤后真空浓缩。通过硅胶色谱纯化(用DCM/MeOH(0-10％)洗脱)，得到标题化合物(0.48g，50％)；1H NMR(CDCl3)δ3.32(s，3H)，5.75(bs，2H)，6.40-6.45(m，1H)，6.85-6.94(m，4H)，6.83-7.15(m，5H)，7.28-7.32(m，2H)，7.35-7.40(m，1H)，7.48(s，1H)，7.57-7.62(m，2H)，8.40(s，1H)；MS m/e MH+487。
中间体96-[4-(3-氨基苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺将2M HCl(0.75ml)加入到6-(4-{3-[(二苯基亚甲基)氨基]苯基}-1-甲基-1H-咪唑-5-基)噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺(0.45g)的THF(15ml)溶液中，搅拌10分钟，然后在水和EtOAc间分配。分离出水层，用浓氨水碱化至pH 9，用DCM(3×30ml)萃取，干燥合并的有机物，过滤后和真空浓缩，得到标题化合物(无色固体，0.33g，100％)；1H NMR(DMSO-d6)δ3.54(s，3H)，4.96(bs，2H)，6.36-6.39(m，1H)，6.55-6.57(m，1H)，6.83-6.88(m，2H)，7.56(bs，2H)，759(s，1H)，7.82(s，1H)，8.28(s，1H)；MS m/e MH+323。
权利要求
1.一种式I化合物及其盐或溶剂合物 式I其中Z选自N和CH；W选自N和CH；X选自NH和CH2；Y选自F、Cl、Br和I；n为1、2或3。
2.权利要求1的式I化合物及其盐或溶剂合物，其中Z为N。
3.权利要求1或2的式I化合物及其盐或溶剂合物，其中Y选自F和/或Cl。
4.权利要求1的式I化合物，所述化合物选自一种或多种下列化合物(1)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氟苯基)脲；(2)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氟苯基)脲；(3)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氯苯基)脲；(4)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氯苯基)脲；(5)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氟苯基)乙酰胺；(6)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(2-氟苯基)乙酰胺；(7)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氯苯基)乙酰胺；(8)N-{3-[5-(4-氨基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2′-(2-氯苯基)乙酰胺；(9)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氟苯基)脲；(10)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氟苯基)脲；(11)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(3-氯苯基)脲；(12)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-N′-(2-氯苯基)脲；(13)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氟苯基)乙酰胺；(14)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(2-氟苯基)乙酰胺；(15)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(3-氯苯基)乙酰胺；(16)N-{3-[5-(4-氨基噻唑并[2，3-d]嘧啶-6-基)-1-甲基-1H-咪唑-4-基]苯基}-2-(2-氯苯基)乙酰胺；以及它们的盐或溶剂合物。
5.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1-4中任一项限定的式I化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体。
6.权利要求1-4中任一项限定的式I化合物或其药学上可接受的盐，它们用作药物。
7.权利要求1-4中任一项限定的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用作温血动物例如人的Tie2受体酪氨酸激酶抑制剂的药物中的用途。
8.权利要求1-4中任一项限定的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于在温血动物例如人产生抗血管生成作用的药物中的用途。
9.一种制备式I化合物或者其盐或溶剂合物的方法，其中X为NH且Z、W、Y和n如式I中定义，所述方法包括使式II的胺与式III的异氰酸酯反应， 式II式III此后如果需要i)将一种式(I)化合物转化为另一种式(I)化合物；ii)形成盐或溶剂合物。
全文摘要
式(I)化合物，它可用于在温血动物例如人产生抗血管生成作用，其中各取代基如本发明说明书中定义。该化合物是Tie2受体酪氨酸激酶(TEK)抑制剂。
文档编号A61P35/00GK1942475SQ200580011955
公开日2007年4月4日 申请日期2005年2月1日 优先权日2004年2月5日
发明者C·D·琼斯, R·W·A·卢克, W·麦库尔 申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司
最新回复(0)