螠蛏贝壳提取物的制备方法
专利名称：螠蛏贝壳提取物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种提取物的制备方法，特别是一种螆蛏贝壳提取物的制备方法，该
提取物具有抑菌活性、抗氧化活性和诱导植物抗性的作用，可作为添加剂用于制备治疗和 预防清除体内过氧化物的药物、食品防腐剂、作为皮肤表浅伤口的抑菌消炎药物和诱导植 物抗性的生物农药。
背景技术：
贝壳含有大量的碳酰，可用来烧制石灰。贝壳灰替代石灰用于生产蒸压加气混凝 土砌块，具有较好的社会效益和经济效益。贝壳也是重要的中药材，可治疗各种疾病。如鲍 的贝壳用于眼疾，宝贝的贝壳明目解毒，乌贼的内壳用于治疗外伤、癫痫、心脏病和胃病，并 用来止血，文蛤的壳能治疗慢性气管炎、淋巴结核、胃及十二指肠溃疡，红螺壳用于治疗胃 痛；以牡蛎贝壳为原料制备碳酸钙的工艺日益引起人们的重视，该种碳酸钙具有一定的生 物活性，富含多种对人体有益的微量元素，如Zn、Mg、P、Fe、K、Cu等，易于被人体吸收；利用 废弃扇贝壳制备新型的吸附材料，贝壳开发利用的前景是相当广阔的，不仅可以向食用、药 用方向转化，而且可向化工、饲料、农药、化妆品方向转化。 鎰蛏(Sinonovacula constricta Iamarck)俗名蛏子、青子、竹蚶、海蛏，隶属于 软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(LameUibranchia)、真瓣鳃目(Eulamellibranchia)、蛏科 (Pharellidae)，为中国和日本所特有，也是中国沿海养殖的重要贝类之一。目前对螆蛏贝 壳化学成分的研究并不多，对其提取物活性的研究则更少。在药品、生物农药、食品保鲜剂、 防腐剂及化妆品等方面还没有对其进行加工利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法简单、好操作、易控制、成本低的螆蛏贝壳提取物
的制备方法，以便制得具有良好抑菌、抗氧化和植物诱抗活性的产品，用于作为药品、生物
农药、食品保鲜剂、防腐剂及化妆品等产品的添加剂，克服现有技术的不足。 本发明的螆蛏贝壳提取物的制备方法，由如下步骤组成 a、选取新鲜的螆蛏贝壳去肉； b、利用机械破碎方式对a步骤所述的贝壳进行破碎，形成贝壳粉末，其贝壳粉末 的目数控制在50目 120目之间； c、用生理盐水提取贝壳粉末，贝壳粉末与生理盐水的配比为每千克贝壳粉末加 入2升生理盐水；分三次提取，第一次提取时间为一天，然后利用抽滤装置过滤收集滤液； 第二次提取时间为两天，利用抽滤装置过滤收集滤液；第三次提取时间为三天，利用抽滤装 置过滤收集滤液； d、把c步骤中三次提取的滤液混合得生理盐水提取液，再对生理盐水提取液进行 冷冻干燥，得螆蛏贝壳的生理盐水提取物。 本发明的方法制备的螆蛏贝壳提取物的制备方法，工艺步骤非常简单，好操作，容易控制，成本低，原料来源广阔，为药品、生物农药、食品保鲜剂、防腐剂及化妆品等产品提 供了一种较好的添加剂。
具体实施例方式
本发明的工艺步骤如下
a、选取新鲜的螆蛏贝壳去肉； b、选用机械式破碎设备对a步骤所述的贝壳进行破碎，形成贝壳粉末，其贝壳粉 末的目数控制在50目或60目或70目或80目或90目或IOO目或IIO目或120目，即在50 目 120目之间均可； c、用浓度为0.9X的生理盐水提取贝壳粉末，贝壳粉末与生理盐水的配比为每 千克贝壳粉末加入2升生理盐水；分三次提取，第一次提取时间为一天，然后利用抽滤装置 过滤收集滤液；第二次提取时间为两天，利用抽滤装置过滤收集滤液；第三次提取时间为 三天，利用抽滤装置过滤收集滤液； d、把c步骤中三次提取的滤液混合得生理盐水提取液，再对生理盐水提取液进行 冷冻干燥，得粉末状的螆蛏贝壳生理盐水提取物。 本发明的提取物可作为药品、生物农药、食品保鲜剂、防腐剂及化妆品等产品的添 加剂。 为了对本发明的提取物进行检测，将30g的螆蛏贝壳按上述方法制取提取物，并 将提取物溶于lOOmL水中用于检测其活性。 滤纸片法检测组织提取液的抑菌活性大肠杆菌Escherichia coli(EC)、变形 杆菌Proteus vulgaris (PV)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (SA)、产气杆菌 Enterobacter aerogenes (EA)禾口枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis (BS)用牛肉膏蛋白胨培 养基，乳酸菌Lactobacterium delbruckii (LD)用MRS培养基。酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae(SC)用YPD培养基。以上各种菌分别接种于相应的液体培养基，振荡培养24h 作指示菌。分别用移液枪取指示菌液lOOii L于相应的固体培养基，用无菌三角涂棒涂抹均 匀，然后将平板分成六个区，每个区分别放入一张滤纸片，再分别用移液枪移取贝壳提取物 样品10iiL滴入滤纸片中央，置于37t:培养箱中培养。每个处理做3次重复，阳性对照为 75%酒精，阴性对照为无菌水。三天后观察指示菌的生长情况，测定抑菌圈的直径大小。结 果该提取物对指示菌基本都具备抑菌作用(乳酸菌除外)，尤其对酵母菌、枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果非常显著，因此用这种螆蛏贝壳提取物开发食品添 加剂可因其抑菌活性而延长产品的保藏时间，还可直接开发成食品保鲜防腐剂。由于该提 取物对金黄色葡萄球菌作用明显，因此可以作为治疗皮肤表浅创伤的药物或应用于化妆品 的添加剂。 超氧阴离子自由基(02—)清除作用的测定取邻苯三酚O. lmL于试管中，加入pH 8. 2的Tris-HCl缓冲溶液5mL，加入螆蛏贝壳提取物的溶液0. 25mL，迅速混匀。在25。C反 应15min。使用lcm比色皿，以蒸馏水做空白对照，在320nm处时测吸光度At，并测定本底 扣除水解液自身的干扰。提取物溶液对超氧阴离子自由基清除率的计算公式如下清除率 S(%) = Ao-(Ai-Aj)/AoX100X。式中，Ao为试剂空白的吸光度值为样液的吸光度值； A,.为样液本底的吸光度值。虽然超氧阴离子自由基(02—)不能直接诱导生物和食品体系中的脂类氧化，但它会在金属离子催化下发生Fenton反应产生有高活性的 0H，因此常用样 品对超氧阴离子自由基(02—)的清除能力来反映其抗氧化活性。试剂空白时的吸光度值Ao 为0.862，经清除率公式S(X) = Ao-(Ai-Aj)/AoX100计算超氧阴离子自由基清除率。结 果螆蛏贝壳提取物溶液的超氧阴离子自由基清除率56. 30% 。因此可用作抗氧化药物的制 备或食品抗氧化添加剂。羟自由基('0H)清除作用的测定取9mmol/L的FeS04 lmL、9mmol/L的水杨酸-乙 醇溶液lmL、样品酶解液lmL，最后加入8. 8mmol/L的H202 lmL启动反应。在37。C反应30分 钟。以水为参比，用可见光分光光度计在510nm下测各个提取液吸光度值。提取物对羟自 由基的清除效果用清除率表示，按下式计算
SA = [ (Ac-As) / (Ac-Ao) ] X 100 % 式中，Ac为对照组0D值；As为样品组0D值；A。为空白组0D值。
羟基自由基(*0H)是一种能够激发油脂过氧化反应的较强的氧化剂，被认为是体 内最活跃的活性氧自由基，辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成，是造成生物有机体 过氧化损伤的主要因素。羟自由基可介导许多病理变化，如引发不饱和脂肪酸的脂质过氧 化反应，并损伤生物膜的功能和结构，因此羟自由基的清除对于生物体具有重要意义。H202 和Fe2+混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的*0H，能被水杨酸有效的捕捉，并生 成有色物质；但若加入具有清除作用的物质，便会与水杨酸竞争，从而使有色产物生成量减 少。 对照组0D值Ac 1. 053，空白组0D值AoO. 018。 经公式SA = [ (Ac-As)/ (Ac-Ao)]X100X算出羟自由基清除率SX，该样品清除羟自由基(*0H)的清除率为60%， 因此可用作抗氧化药物的制备或食品抗氧化添加剂。 大豆子叶法测定植物诱抗活性将发芽大豆，放入洗净的解剖盘当中浇水浸没，放 入光照培养箱培养，每天浇水培养4-5天待大豆长出两片真叶后即可进行活性测定。在无 菌条件下，将刚刚长出真叶的大豆子叶剪下，用8%次氯酸钠溶液灭菌5分钟，再用无菌水 冲洗。用刀片削去子叶外表皮厚约lmm，直径约6mm的伤口 ，用无菌水浸泡清洗，约30秒后 取出，滤纸拭干后放入铺有湿滤纸培养皿中，每皿IO片子叶作为一个处理。每组样液一个 处理，每个处理做一次重复，对照组用无菌水。使用微量移液器取配置好的螆蛏贝壳提取液 每10 ii L加在一个伤口上。处理后的子叶在28°C黑暗的温箱中培养24小时后，将每皿中的 子叶转移到一个盛有lOmL双蒸水的试管中，充分振荡，用紫外分光光度计在286nm处测定 0D值。结果该螆蛏贝壳提取物的溶液处理的样品OD值明显高于阳性对照(壳寡糖)，因此 植物诱抗活性显著，可应用于生物农药的开发。 根据上述的检测可知，本发明的提取物具有抗氧化、抑菌和植物诱抗等多种显著 生物活性；原料来源丰富，价格低廉，制备方法简便；螆蛏是中国沿海养殖的重要贝类良种 之一，而螆蛏的组织加工后，其壳往往被废弃，因此来源丰富且可增强废物利用，减少环境 污染。
权利要求
一种螠蛏贝壳提取物的制备方法，其特征在于由如下步骤组成a、选取新鲜的螠蛏贝壳去肉；b、利用机械破碎方式对a步骤所述的贝壳进行破碎，形成贝壳粉末，其贝壳粉末的目数控制在50目～120目之间；c、用生理盐水提取贝壳粉末，贝壳粉末与生理盐水的配比为每千克贝壳粉末加入2升生理盐水；分三次提取，第一次提取时间为一天，然后利用抽滤装置过滤收集滤液；第二次提取时间为两天，利用抽滤装置过滤收集滤液；第三次提取时间为三天，利用抽滤装置过滤收集滤液；d、把c步骤中三次提取的滤液混合得生理盐水提取液，再对生理盐水提取液进行冷冻干燥，得螠蛏贝壳的生理盐水提取物。
全文摘要
一种螠蛏贝壳提取物的制备方法，步骤如下选取新鲜的螠蛏贝壳去肉；利用机械破碎方式对贝壳进行破碎，形成贝壳粉末，其贝壳粉末的目数控制在50目～120目之间；用生理盐水提取贝壳粉末，贝壳粉末与生理盐水的配比为每千克贝壳粉末加入2升生理盐水；分三次提取，第一次提取时间为一天，然后利用抽滤装置过滤收集滤液；第二次提取时间为两天，利用抽滤装置过滤收集滤液；第三次提取时间为三天，利用抽滤装置过滤收集滤液；三次提取的滤液混合得生理盐水提取液，再对生理盐水提取液进行冷冻干燥，得螠蛏贝壳的生理盐水提取物。具有工艺步骤简单、好操作、容易控制、成本低、原料来源广阔的优点。
文档编号A61P31/02GK101716189SQ20091024896
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者张付云 申请人:大连水产学院
技术领域：
本发明涉及一种提取物的制备方法，特别是一种螆蛏贝壳提取物的制备方法，该
提取物具有抑菌活性、抗氧化活性和诱导植物抗性的作用，可作为添加剂用于制备治疗和 预防清除体内过氧化物的药物、食品防腐剂、作为皮肤表浅伤口的抑菌消炎药物和诱导植 物抗性的生物农药。
背景技术：
贝壳含有大量的碳酰，可用来烧制石灰。贝壳灰替代石灰用于生产蒸压加气混凝 土砌块，具有较好的社会效益和经济效益。贝壳也是重要的中药材，可治疗各种疾病。如鲍 的贝壳用于眼疾，宝贝的贝壳明目解毒，乌贼的内壳用于治疗外伤、癫痫、心脏病和胃病，并 用来止血，文蛤的壳能治疗慢性气管炎、淋巴结核、胃及十二指肠溃疡，红螺壳用于治疗胃 痛；以牡蛎贝壳为原料制备碳酸钙的工艺日益引起人们的重视，该种碳酸钙具有一定的生 物活性，富含多种对人体有益的微量元素，如Zn、Mg、P、Fe、K、Cu等，易于被人体吸收；利用 废弃扇贝壳制备新型的吸附材料，贝壳开发利用的前景是相当广阔的，不仅可以向食用、药 用方向转化，而且可向化工、饲料、农药、化妆品方向转化。 鎰蛏(Sinonovacula constricta Iamarck)俗名蛏子、青子、竹蚶、海蛏，隶属于 软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(LameUibranchia)、真瓣鳃目(Eulamellibranchia)、蛏科 (Pharellidae)，为中国和日本所特有，也是中国沿海养殖的重要贝类之一。目前对螆蛏贝 壳化学成分的研究并不多，对其提取物活性的研究则更少。在药品、生物农药、食品保鲜剂、 防腐剂及化妆品等方面还没有对其进行加工利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法简单、好操作、易控制、成本低的螆蛏贝壳提取物
的制备方法，以便制得具有良好抑菌、抗氧化和植物诱抗活性的产品，用于作为药品、生物
农药、食品保鲜剂、防腐剂及化妆品等产品的添加剂，克服现有技术的不足。 本发明的螆蛏贝壳提取物的制备方法，由如下步骤组成 a、选取新鲜的螆蛏贝壳去肉； b、利用机械破碎方式对a步骤所述的贝壳进行破碎，形成贝壳粉末，其贝壳粉末 的目数控制在50目 120目之间； c、用生理盐水提取贝壳粉末，贝壳粉末与生理盐水的配比为每千克贝壳粉末加 入2升生理盐水；分三次提取，第一次提取时间为一天，然后利用抽滤装置过滤收集滤液； 第二次提取时间为两天，利用抽滤装置过滤收集滤液；第三次提取时间为三天，利用抽滤装 置过滤收集滤液； d、把c步骤中三次提取的滤液混合得生理盐水提取液，再对生理盐水提取液进行 冷冻干燥，得螆蛏贝壳的生理盐水提取物。 本发明的方法制备的螆蛏贝壳提取物的制备方法，工艺步骤非常简单，好操作，容易控制，成本低，原料来源广阔，为药品、生物农药、食品保鲜剂、防腐剂及化妆品等产品提 供了一种较好的添加剂。
具体实施例方式
本发明的工艺步骤如下
a、选取新鲜的螆蛏贝壳去肉； b、选用机械式破碎设备对a步骤所述的贝壳进行破碎，形成贝壳粉末，其贝壳粉 末的目数控制在50目或60目或70目或80目或90目或IOO目或IIO目或120目，即在50 目 120目之间均可； c、用浓度为0.9X的生理盐水提取贝壳粉末，贝壳粉末与生理盐水的配比为每 千克贝壳粉末加入2升生理盐水；分三次提取，第一次提取时间为一天，然后利用抽滤装置 过滤收集滤液；第二次提取时间为两天，利用抽滤装置过滤收集滤液；第三次提取时间为 三天，利用抽滤装置过滤收集滤液； d、把c步骤中三次提取的滤液混合得生理盐水提取液，再对生理盐水提取液进行 冷冻干燥，得粉末状的螆蛏贝壳生理盐水提取物。 本发明的提取物可作为药品、生物农药、食品保鲜剂、防腐剂及化妆品等产品的添 加剂。 为了对本发明的提取物进行检测，将30g的螆蛏贝壳按上述方法制取提取物，并 将提取物溶于lOOmL水中用于检测其活性。 滤纸片法检测组织提取液的抑菌活性大肠杆菌Escherichia coli(EC)、变形 杆菌Proteus vulgaris (PV)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (SA)、产气杆菌 Enterobacter aerogenes (EA)禾口枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis (BS)用牛肉膏蛋白胨培 养基，乳酸菌Lactobacterium delbruckii (LD)用MRS培养基。酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae(SC)用YPD培养基。以上各种菌分别接种于相应的液体培养基，振荡培养24h 作指示菌。分别用移液枪取指示菌液lOOii L于相应的固体培养基，用无菌三角涂棒涂抹均 匀，然后将平板分成六个区，每个区分别放入一张滤纸片，再分别用移液枪移取贝壳提取物 样品10iiL滴入滤纸片中央，置于37t:培养箱中培养。每个处理做3次重复，阳性对照为 75%酒精，阴性对照为无菌水。三天后观察指示菌的生长情况，测定抑菌圈的直径大小。结 果该提取物对指示菌基本都具备抑菌作用(乳酸菌除外)，尤其对酵母菌、枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果非常显著，因此用这种螆蛏贝壳提取物开发食品添 加剂可因其抑菌活性而延长产品的保藏时间，还可直接开发成食品保鲜防腐剂。由于该提 取物对金黄色葡萄球菌作用明显，因此可以作为治疗皮肤表浅创伤的药物或应用于化妆品 的添加剂。 超氧阴离子自由基(02—)清除作用的测定取邻苯三酚O. lmL于试管中，加入pH 8. 2的Tris-HCl缓冲溶液5mL，加入螆蛏贝壳提取物的溶液0. 25mL，迅速混匀。在25。C反 应15min。使用lcm比色皿，以蒸馏水做空白对照，在320nm处时测吸光度At，并测定本底 扣除水解液自身的干扰。提取物溶液对超氧阴离子自由基清除率的计算公式如下清除率 S(%) = Ao-(Ai-Aj)/AoX100X。式中，Ao为试剂空白的吸光度值为样液的吸光度值； A,.为样液本底的吸光度值。虽然超氧阴离子自由基(02—)不能直接诱导生物和食品体系中的脂类氧化，但它会在金属离子催化下发生Fenton反应产生有高活性的 0H，因此常用样 品对超氧阴离子自由基(02—)的清除能力来反映其抗氧化活性。试剂空白时的吸光度值Ao 为0.862，经清除率公式S(X) = Ao-(Ai-Aj)/AoX100计算超氧阴离子自由基清除率。结 果螆蛏贝壳提取物溶液的超氧阴离子自由基清除率56. 30% 。因此可用作抗氧化药物的制 备或食品抗氧化添加剂。羟自由基('0H)清除作用的测定取9mmol/L的FeS04 lmL、9mmol/L的水杨酸-乙 醇溶液lmL、样品酶解液lmL，最后加入8. 8mmol/L的H202 lmL启动反应。在37。C反应30分 钟。以水为参比，用可见光分光光度计在510nm下测各个提取液吸光度值。提取物对羟自 由基的清除效果用清除率表示，按下式计算
SA = [ (Ac-As) / (Ac-Ao) ] X 100 % 式中，Ac为对照组0D值；As为样品组0D值；A。为空白组0D值。
羟基自由基(*0H)是一种能够激发油脂过氧化反应的较强的氧化剂，被认为是体 内最活跃的活性氧自由基，辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成，是造成生物有机体 过氧化损伤的主要因素。羟自由基可介导许多病理变化，如引发不饱和脂肪酸的脂质过氧 化反应，并损伤生物膜的功能和结构，因此羟自由基的清除对于生物体具有重要意义。H202 和Fe2+混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的*0H，能被水杨酸有效的捕捉，并生 成有色物质；但若加入具有清除作用的物质，便会与水杨酸竞争，从而使有色产物生成量减 少。 对照组0D值Ac 1. 053，空白组0D值AoO. 018。 经公式SA = [ (Ac-As)/ (Ac-Ao)]X100X算出羟自由基清除率SX，该样品清除羟自由基(*0H)的清除率为60%， 因此可用作抗氧化药物的制备或食品抗氧化添加剂。 大豆子叶法测定植物诱抗活性将发芽大豆，放入洗净的解剖盘当中浇水浸没，放 入光照培养箱培养，每天浇水培养4-5天待大豆长出两片真叶后即可进行活性测定。在无 菌条件下，将刚刚长出真叶的大豆子叶剪下，用8%次氯酸钠溶液灭菌5分钟，再用无菌水 冲洗。用刀片削去子叶外表皮厚约lmm，直径约6mm的伤口 ，用无菌水浸泡清洗，约30秒后 取出，滤纸拭干后放入铺有湿滤纸培养皿中，每皿IO片子叶作为一个处理。每组样液一个 处理，每个处理做一次重复，对照组用无菌水。使用微量移液器取配置好的螆蛏贝壳提取液 每10 ii L加在一个伤口上。处理后的子叶在28°C黑暗的温箱中培养24小时后，将每皿中的 子叶转移到一个盛有lOmL双蒸水的试管中，充分振荡，用紫外分光光度计在286nm处测定 0D值。结果该螆蛏贝壳提取物的溶液处理的样品OD值明显高于阳性对照(壳寡糖)，因此 植物诱抗活性显著，可应用于生物农药的开发。 根据上述的检测可知，本发明的提取物具有抗氧化、抑菌和植物诱抗等多种显著 生物活性；原料来源丰富，价格低廉，制备方法简便；螆蛏是中国沿海养殖的重要贝类良种 之一，而螆蛏的组织加工后，其壳往往被废弃，因此来源丰富且可增强废物利用，减少环境 污染。
权利要求
一种螠蛏贝壳提取物的制备方法，其特征在于由如下步骤组成a、选取新鲜的螠蛏贝壳去肉；b、利用机械破碎方式对a步骤所述的贝壳进行破碎，形成贝壳粉末，其贝壳粉末的目数控制在50目～120目之间；c、用生理盐水提取贝壳粉末，贝壳粉末与生理盐水的配比为每千克贝壳粉末加入2升生理盐水；分三次提取，第一次提取时间为一天，然后利用抽滤装置过滤收集滤液；第二次提取时间为两天，利用抽滤装置过滤收集滤液；第三次提取时间为三天，利用抽滤装置过滤收集滤液；d、把c步骤中三次提取的滤液混合得生理盐水提取液，再对生理盐水提取液进行冷冻干燥，得螠蛏贝壳的生理盐水提取物。
全文摘要
一种螠蛏贝壳提取物的制备方法，步骤如下选取新鲜的螠蛏贝壳去肉；利用机械破碎方式对贝壳进行破碎，形成贝壳粉末，其贝壳粉末的目数控制在50目～120目之间；用生理盐水提取贝壳粉末，贝壳粉末与生理盐水的配比为每千克贝壳粉末加入2升生理盐水；分三次提取，第一次提取时间为一天，然后利用抽滤装置过滤收集滤液；第二次提取时间为两天，利用抽滤装置过滤收集滤液；第三次提取时间为三天，利用抽滤装置过滤收集滤液；三次提取的滤液混合得生理盐水提取液，再对生理盐水提取液进行冷冻干燥，得螠蛏贝壳的生理盐水提取物。具有工艺步骤简单、好操作、容易控制、成本低、原料来源广阔的优点。
文档编号A61P31/02GK101716189SQ20091024896
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者张付云 申请人:大连水产学院
最新回复(0)