高包封率长效神经生长因子脂质体及其制备方法
专利名称：高包封率长效神经生长因子脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及高包封率长效神经生长因子脂质体，属于蛋白多肽类药物技术领域。
背景技术：
神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)是人体神经系统最重要的生物活性物质之一，已证明确有促进神经突起生长和营养神经的双重作用，并能对中枢和周围神经系统损伤有明显修复作用，国外两位科学家(Levi-Montaleini和S. Cohen)因发现和提纯NGF 于1986年获诺贝尔医学奖。NGF具有三种亚基(α β Y )，当前NGF通常指具有生物活性的 β亚基，根据沉降系数也称2. 5S NGF，分子量^KD,等电点9. 3，由两条含118个氨基酸相同的单链组成。2001年我国在世界上首先批准生产上市NGF肌肉注射冻干粉针剂，制剂中采用 β-NGF加入5%甘露醇和人血白蛋白保护剂，主要用于周围神经损伤以及视神经病变， 多发性神经炎、带状疱疹和神经麻痹等。对老年痴呆，可明显缓解病人的认知记忆障碍。但因NGF不能通过血脑屏障，因此只能采取脑室注射方法。NGF在体内外均不稳定，体外采用冻干方法可以基本得到解决，而体内在多种酶的作用下，NGF静脉注射体内的半衰期仅为9分钟，因此NGF无论应用于周围神经，还是直接应用于中枢神经均难于满足临床要求，疗效也大打折扣。为了解决NGF体内的稳定性和通过血脑屏障这两大难题，在国家自然科学基金立项资助下(批准号30070901 2001. 01 2003. 12)将NGF制成脂质体，并且采取添加长循环辅料、柔性辅料、阳离子辅料等制成荷正电的长循环柔性纳米脂质体，动物试验初步证明在高剂量给药时，具有一定的脑靶向作用。但体内药动学实验结果其半衰期仅为Tl/2 = 0. 22池，包封率为34%，作为实际临床应用尚须进一步研究改进。国内有专利将NGF制成一般的长循环脂质体，加入酶抑制剂制成脂质体凝胶鼻喷雾剂，以期达到脑靶向作用，结果体内半衰期由9分钟提高到35分钟，包封率为34%，这仍难于满足临床要求。国内外也有大量研究论文及专利将肽类药包封在脂质体内以达到提高体内稳定性的作用，但其肽类的分子量限定在IOKD以下，而通常应用的i3-NGF(2.5SNGF)分子量为 ^KD,又因为其水溶性难将其包入脂质体中，包裹的NGF也因其水溶性容易泄漏。因其庞大的分子量，暴露在外，难以抵挡体内酶类的攻击。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种高包封率长效神经生长因子脂质体。本发明要解决的第二个技术问题是提供这种高包封率长效神经生长因子脂质体的制备方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，将NGF与脂质体活性膜材联结后，与其他脂质体成份用常规方法制成长循环脂质体。一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，将脂质体活性膜材与脂质体其他成分一起用常规方法制成长循环脂质体，加入NGF与活性膜材反应联结。一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，以常规方法制成长循环脂质体，将 NGF与脂质体活性膜材反应联结，将二者加到一起孵育，利用疏水作用，将后者插入到脂质体双分子层中。所述长循环脂质体的常规制备方法是成膜法、反向蒸发法、复乳法、注入法、熔融法、冷冻干燥法或离心法。所述脂质体活性膜材可以是DSPE-PEG-MAL、DSPE_PEG_SC、DSPE-PEG-BTC，其中 PEG平均分子量是2，000 6，000。活性成膜材料可以是以下三种1) DSPE-PEG-BTC (二硬脂酰乙醇胺-聚乙二醇-苯并三唑磷酸酯)其中活性基因BTC可以和NGF肽链中的α -氨基反应，并将二者结合起来。2)DSPE-PEG-SC(DSPE-PEG-Succinimidyl Carbonate, 二硬酯酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯)活性基团SC与NGF肽链中的氨基反应，并将二者结合起来。3) DSPE-PEG-MAL (DSPE-PEG-Maleimie，二硬酸酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺)活性基团MAL可以和NGF肽链中半胱氨酸的-SH反应，并将二者结合起来。以上反应均在常温下数小时内完成，随后进入冻干，确保NGF不被破坏。所述脂质体的常规其他成份是磷脂、胆固醇或各种表面活性剂。所用的脂质体活性成膜材料中含有磷脂部分(如DSPE)可以参与组成脂质体双分子层，所含的 PEG(PEG2000 6000)具有长链聚乙二醇分子，吸附大量水分子可以起屏蔽作用，阻挡体内的吞筮细胞的吞噬作用，避免酶类对NGF的破坏。此外常规脂质体双分子膜层，对NGF也具有一定的保护作用。所述方法中添加冻干支持剂，通过常规冻干工艺制成前体脂质体。所述方法中添加抗氧化剂和其他具有稳定作用或影响释放性能的助剂。一种高包封率长循环脂质体制剂，采用上述方法制备得到。可以在冻干前或以后加入酶抑制剂，增稠剂、防腐剂、支持剂，可以制成注射剂、凝胶剂、喷雾剂、溶液剂、粉针剂、 眼用鼻腔给药或局部给药剂型。所述制剂为静脉注射制剂、皮下注射制剂、肌肉注射制剂、髓鞘内注射制剂、呼吸道吸入制剂、口服制剂或外用制剂。本发明的创新之处还在于发现以上方法制备的NGF脂质体NGF收率可达到70 %以上(相当于包封率> 70% )，包封的NGF不能自由渗漏到外相水溶液中。如除去外水相的 NGF，则其包封率可达90%以上。本发明的创新之处在于制备NGF高包封长效脂质体，采用先制成含活性成膜材料的空白脂质体，再加入NGF与之反应连接。也可制成常规的长循环脂质体，将NGF与活性膜材结合，二者混合后，利用疏水作用后者插入前者的双分子层中。或者先将活性膜材与NGF 结合再与其他膜材一起制备脂质体。本发明的创新之处还在于如此制备的NGF高包封率的脂质体体内半衰期可以大大延长，以便于NGF更好的发挥对周围神经的再生营养作用，也便于NGF能更有效的通过血脑屏障。 本发明的优点是本发明通过NGF分子中的-SH，-NH2与脂质体特殊活性膜材_活性脂键合，大大提高了包封率，在活性酯中长链PEG保护下提高体内稳定性，解决NGF应用的关键问题。本发明通过脂质体活性膜材与NGF的键合可以达到90%以上的高包封率，粒度可以控制在50 IOOOnm范围内，并且在体内外稳定性均明显提高。脂质体的膜材为大豆磷脂，DSPE-PEG，胆固醇和其他脂质成份，可通过薄膜分散法，加压挤出法等脂质体的常规制备方法制备，也可将上述方法制备的脂质体加入适当的冻干保护剂制成前体脂质体冻干粉针。可用于静脉注射、肌肉注射、局部注射、雾化吸入等多种给药方法。下面结合本发明实施例对本发明作进一步说明，凡是依照本发明公开内容进行的任何本领域的等同替换均属于对本发明专利权的侵犯。
具体实施例方式实例1称取卵磷脂400mg,胆固醇 80mg，DSPE-PEG 108mg, DSPE-PEG-Mal 108mg 溶于 10 20ml氯仿溶液中，得到脂质体液在55°C水浴下旋转蒸发制成均勻薄膜，继续55°C下减压蒸发30min，除去氯仿，得到稠厚的胶壮物。加入适量硫酸铵溶液(123mm0l/L pH5. 4)，水浴冷却超声洗脱20分钟，得到的脂质体混悬液加入NGF，数量相当DSPE-PEG-Mal摩尔数的1 1/4，室温孵育4 10h。NGF 反应率为 74%，平均粒径 140nm VC = 0. 590。过膜后可得不同的粒径范围脂质体。上柱分离游离的NGF，成品包封率可以更高，并不渗漏。实例2DSPE-PEG-SC 与 NGF 摩尔比为 3 1，用 pH7. 5HEPES[N_(2_ 羟乙基)哌嗪-N-2-乙磺酸]缓冲液分别溶解，前者滴加到后者的缓冲液中，4°C下温和搅拌4h，透析纯化后冻干， 得DSPE-PEG-NGF。以DSPE-PEG-NGF为膜材一部分，用实例1或其他常规方法制备脂质体。实例3用实例1方法制备不含活性脂的普通长循环脂质体，用实例2方法制备 DSPE-PEG-NGFJf 2者混合孵育，利用疏水性后者插入前者脂质体的双分子层中。实例 4称取DSPE-PEG-BTC 和 NGF，[二者者摩尔比 O 5) 1]，分别以 4°C HEPES 缓冲液(0. Immol/mL)溶解，前者滴入后者缓冲液中，于4°C缓慢搅拌4h，用TLC或HPLC 跟踪反应，直到NGF完全消失，加入过量的甘氨酸经止反应，产物经透析纯化冻干得 DSPE-PEG-NGF。称取大豆磷脂，胆固醇，DSPE-PEG，DSPE-PEG-NGF(摩尔的比20 10 1 1)，溶于氯仿后，37°C旋转减压蒸发成膜，用硫酸铵缓冲液(123mm0l/L，pH5. 4)涡旋振荡，水溶超声，反复挤压过200nm聚碳酯膜，即得。包封率可达80%以上。
权利要求
1.一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特性在于将NGF与脂质体活性膜材联结后，与其他脂质体成份用常规方法制成长循环脂质体。
2.一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特性在于将脂质体活性膜材与脂质体其他成分一起用常规方法制成长循环脂质体，加入NGF与活性膜材反应联结。
3.一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特性在于以常规方法制成长循环脂质体，将NGF与脂质体活性膜材反应联结，将二者加到一起孵育，利用疏水作用，将后者插入到脂质体双分子层中。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特征在于所述长循环脂质体的常规制备方法是成膜法、反向蒸发法、复乳法、注入法、熔融法、冷冻干燥法和离心法。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特征在于所述脂质体活性膜材是DSPE-PEG-MAL、DSPE-PEG-SC、DSPE-PEG-BTC，其中PEG平均分子量是2，000 6，000。
6.根据权利要求5所述的一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特征在于 所述脂质体的常规其他成份是磷脂、胆固醇或各种表面活性剂。
7.根据权利要求1或2或3所述的一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特征在于所述方法中添加冻干支持剂，通过常规冻干工艺制成前体脂质体。
8.根据权利要求1或2或3所述的一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特征在于所述方法中添加抗氧化剂和其他具有稳定作用或影响释放性能的助剂。
9.根据权利要求1至8中任何一项所述的方法制备的一种高包封率长循环脂质体制剂，其特征在于所述制剂为静脉注射制剂、皮下注射制剂、肌肉注射制剂、髓鞘内注射制剂、呼吸道吸入制剂、口服制剂和外用制剂。
全文摘要
本发明涉及高包封率长效神经生长因子脂质体，属于蛋白多肽类药物技术领域。一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，将NGF与脂质体活性膜材联结后，与其他脂质体成份用常规方法制成长循环脂质体。本发明的优点是本发明通过NGF分子中的-SH，-NH2与脂质体特殊活性膜材-活性脂键合，大大提高了包封率，在活性酯中长链PEG保护下提高体内稳定性，解决NGF应用的关键问题。
文档编号A61K38/18GK102485214SQ200910250359
公开日2012年6月6日 申请日期2009年12月4日 优先权日2009年12月4日
发明者于彬, 陈春园, 陈春在, 陈骐 申请人:李晓为, 陈春园
技术领域：
本发明涉及高包封率长效神经生长因子脂质体，属于蛋白多肽类药物技术领域。
背景技术：
神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)是人体神经系统最重要的生物活性物质之一，已证明确有促进神经突起生长和营养神经的双重作用，并能对中枢和周围神经系统损伤有明显修复作用，国外两位科学家(Levi-Montaleini和S. Cohen)因发现和提纯NGF 于1986年获诺贝尔医学奖。NGF具有三种亚基(α β Y )，当前NGF通常指具有生物活性的 β亚基，根据沉降系数也称2. 5S NGF，分子量^KD,等电点9. 3，由两条含118个氨基酸相同的单链组成。2001年我国在世界上首先批准生产上市NGF肌肉注射冻干粉针剂，制剂中采用 β-NGF加入5%甘露醇和人血白蛋白保护剂，主要用于周围神经损伤以及视神经病变， 多发性神经炎、带状疱疹和神经麻痹等。对老年痴呆，可明显缓解病人的认知记忆障碍。但因NGF不能通过血脑屏障，因此只能采取脑室注射方法。NGF在体内外均不稳定，体外采用冻干方法可以基本得到解决，而体内在多种酶的作用下，NGF静脉注射体内的半衰期仅为9分钟，因此NGF无论应用于周围神经，还是直接应用于中枢神经均难于满足临床要求，疗效也大打折扣。为了解决NGF体内的稳定性和通过血脑屏障这两大难题，在国家自然科学基金立项资助下(批准号30070901 2001. 01 2003. 12)将NGF制成脂质体，并且采取添加长循环辅料、柔性辅料、阳离子辅料等制成荷正电的长循环柔性纳米脂质体，动物试验初步证明在高剂量给药时，具有一定的脑靶向作用。但体内药动学实验结果其半衰期仅为Tl/2 = 0. 22池，包封率为34%，作为实际临床应用尚须进一步研究改进。国内有专利将NGF制成一般的长循环脂质体，加入酶抑制剂制成脂质体凝胶鼻喷雾剂，以期达到脑靶向作用，结果体内半衰期由9分钟提高到35分钟，包封率为34%，这仍难于满足临床要求。国内外也有大量研究论文及专利将肽类药包封在脂质体内以达到提高体内稳定性的作用，但其肽类的分子量限定在IOKD以下，而通常应用的i3-NGF(2.5SNGF)分子量为 ^KD,又因为其水溶性难将其包入脂质体中，包裹的NGF也因其水溶性容易泄漏。因其庞大的分子量，暴露在外，难以抵挡体内酶类的攻击。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种高包封率长效神经生长因子脂质体。本发明要解决的第二个技术问题是提供这种高包封率长效神经生长因子脂质体的制备方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，将NGF与脂质体活性膜材联结后，与其他脂质体成份用常规方法制成长循环脂质体。一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，将脂质体活性膜材与脂质体其他成分一起用常规方法制成长循环脂质体，加入NGF与活性膜材反应联结。一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，以常规方法制成长循环脂质体，将 NGF与脂质体活性膜材反应联结，将二者加到一起孵育，利用疏水作用，将后者插入到脂质体双分子层中。所述长循环脂质体的常规制备方法是成膜法、反向蒸发法、复乳法、注入法、熔融法、冷冻干燥法或离心法。所述脂质体活性膜材可以是DSPE-PEG-MAL、DSPE_PEG_SC、DSPE-PEG-BTC，其中 PEG平均分子量是2，000 6，000。活性成膜材料可以是以下三种1) DSPE-PEG-BTC (二硬脂酰乙醇胺-聚乙二醇-苯并三唑磷酸酯)其中活性基因BTC可以和NGF肽链中的α -氨基反应，并将二者结合起来。2)DSPE-PEG-SC(DSPE-PEG-Succinimidyl Carbonate, 二硬酯酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯)活性基团SC与NGF肽链中的氨基反应，并将二者结合起来。3) DSPE-PEG-MAL (DSPE-PEG-Maleimie，二硬酸酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺)活性基团MAL可以和NGF肽链中半胱氨酸的-SH反应，并将二者结合起来。以上反应均在常温下数小时内完成，随后进入冻干，确保NGF不被破坏。所述脂质体的常规其他成份是磷脂、胆固醇或各种表面活性剂。所用的脂质体活性成膜材料中含有磷脂部分(如DSPE)可以参与组成脂质体双分子层，所含的 PEG(PEG2000 6000)具有长链聚乙二醇分子，吸附大量水分子可以起屏蔽作用，阻挡体内的吞筮细胞的吞噬作用，避免酶类对NGF的破坏。此外常规脂质体双分子膜层，对NGF也具有一定的保护作用。所述方法中添加冻干支持剂，通过常规冻干工艺制成前体脂质体。所述方法中添加抗氧化剂和其他具有稳定作用或影响释放性能的助剂。一种高包封率长循环脂质体制剂，采用上述方法制备得到。可以在冻干前或以后加入酶抑制剂，增稠剂、防腐剂、支持剂，可以制成注射剂、凝胶剂、喷雾剂、溶液剂、粉针剂、 眼用鼻腔给药或局部给药剂型。所述制剂为静脉注射制剂、皮下注射制剂、肌肉注射制剂、髓鞘内注射制剂、呼吸道吸入制剂、口服制剂或外用制剂。本发明的创新之处还在于发现以上方法制备的NGF脂质体NGF收率可达到70 %以上(相当于包封率> 70% )，包封的NGF不能自由渗漏到外相水溶液中。如除去外水相的 NGF，则其包封率可达90%以上。本发明的创新之处在于制备NGF高包封长效脂质体，采用先制成含活性成膜材料的空白脂质体，再加入NGF与之反应连接。也可制成常规的长循环脂质体，将NGF与活性膜材结合，二者混合后，利用疏水作用后者插入前者的双分子层中。或者先将活性膜材与NGF 结合再与其他膜材一起制备脂质体。本发明的创新之处还在于如此制备的NGF高包封率的脂质体体内半衰期可以大大延长，以便于NGF更好的发挥对周围神经的再生营养作用，也便于NGF能更有效的通过血脑屏障。 本发明的优点是本发明通过NGF分子中的-SH，-NH2与脂质体特殊活性膜材_活性脂键合，大大提高了包封率，在活性酯中长链PEG保护下提高体内稳定性，解决NGF应用的关键问题。本发明通过脂质体活性膜材与NGF的键合可以达到90%以上的高包封率，粒度可以控制在50 IOOOnm范围内，并且在体内外稳定性均明显提高。脂质体的膜材为大豆磷脂，DSPE-PEG，胆固醇和其他脂质成份，可通过薄膜分散法，加压挤出法等脂质体的常规制备方法制备，也可将上述方法制备的脂质体加入适当的冻干保护剂制成前体脂质体冻干粉针。可用于静脉注射、肌肉注射、局部注射、雾化吸入等多种给药方法。下面结合本发明实施例对本发明作进一步说明，凡是依照本发明公开内容进行的任何本领域的等同替换均属于对本发明专利权的侵犯。
具体实施例方式实例1称取卵磷脂400mg,胆固醇 80mg，DSPE-PEG 108mg, DSPE-PEG-Mal 108mg 溶于 10 20ml氯仿溶液中，得到脂质体液在55°C水浴下旋转蒸发制成均勻薄膜，继续55°C下减压蒸发30min，除去氯仿，得到稠厚的胶壮物。加入适量硫酸铵溶液(123mm0l/L pH5. 4)，水浴冷却超声洗脱20分钟，得到的脂质体混悬液加入NGF，数量相当DSPE-PEG-Mal摩尔数的1 1/4，室温孵育4 10h。NGF 反应率为 74%，平均粒径 140nm VC = 0. 590。过膜后可得不同的粒径范围脂质体。上柱分离游离的NGF，成品包封率可以更高，并不渗漏。实例2DSPE-PEG-SC 与 NGF 摩尔比为 3 1，用 pH7. 5HEPES[N_(2_ 羟乙基)哌嗪-N-2-乙磺酸]缓冲液分别溶解，前者滴加到后者的缓冲液中，4°C下温和搅拌4h，透析纯化后冻干， 得DSPE-PEG-NGF。以DSPE-PEG-NGF为膜材一部分，用实例1或其他常规方法制备脂质体。实例3用实例1方法制备不含活性脂的普通长循环脂质体，用实例2方法制备 DSPE-PEG-NGFJf 2者混合孵育，利用疏水性后者插入前者脂质体的双分子层中。实例 4称取DSPE-PEG-BTC 和 NGF，[二者者摩尔比 O 5) 1]，分别以 4°C HEPES 缓冲液(0. Immol/mL)溶解，前者滴入后者缓冲液中，于4°C缓慢搅拌4h，用TLC或HPLC 跟踪反应，直到NGF完全消失，加入过量的甘氨酸经止反应，产物经透析纯化冻干得 DSPE-PEG-NGF。称取大豆磷脂，胆固醇，DSPE-PEG，DSPE-PEG-NGF(摩尔的比20 10 1 1)，溶于氯仿后，37°C旋转减压蒸发成膜，用硫酸铵缓冲液(123mm0l/L，pH5. 4)涡旋振荡，水溶超声，反复挤压过200nm聚碳酯膜，即得。包封率可达80%以上。
权利要求
1.一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特性在于将NGF与脂质体活性膜材联结后，与其他脂质体成份用常规方法制成长循环脂质体。
2.一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特性在于将脂质体活性膜材与脂质体其他成分一起用常规方法制成长循环脂质体，加入NGF与活性膜材反应联结。
3.一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特性在于以常规方法制成长循环脂质体，将NGF与脂质体活性膜材反应联结，将二者加到一起孵育，利用疏水作用，将后者插入到脂质体双分子层中。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特征在于所述长循环脂质体的常规制备方法是成膜法、反向蒸发法、复乳法、注入法、熔融法、冷冻干燥法和离心法。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特征在于所述脂质体活性膜材是DSPE-PEG-MAL、DSPE-PEG-SC、DSPE-PEG-BTC，其中PEG平均分子量是2，000 6，000。
6.根据权利要求5所述的一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特征在于 所述脂质体的常规其他成份是磷脂、胆固醇或各种表面活性剂。
7.根据权利要求1或2或3所述的一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特征在于所述方法中添加冻干支持剂，通过常规冻干工艺制成前体脂质体。
8.根据权利要求1或2或3所述的一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，其特征在于所述方法中添加抗氧化剂和其他具有稳定作用或影响释放性能的助剂。
9.根据权利要求1至8中任何一项所述的方法制备的一种高包封率长循环脂质体制剂，其特征在于所述制剂为静脉注射制剂、皮下注射制剂、肌肉注射制剂、髓鞘内注射制剂、呼吸道吸入制剂、口服制剂和外用制剂。
全文摘要
本发明涉及高包封率长效神经生长因子脂质体，属于蛋白多肽类药物技术领域。一种高包封率长循环脂质体制剂的制备方法，将NGF与脂质体活性膜材联结后，与其他脂质体成份用常规方法制成长循环脂质体。本发明的优点是本发明通过NGF分子中的-SH，-NH2与脂质体特殊活性膜材-活性脂键合，大大提高了包封率，在活性酯中长链PEG保护下提高体内稳定性，解决NGF应用的关键问题。
文档编号A61K38/18GK102485214SQ200910250359
公开日2012年6月6日 申请日期2009年12月4日 优先权日2009年12月4日
发明者于彬, 陈春园, 陈春在, 陈骐 申请人:李晓为, 陈春园
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