新的法尼基蛋白转移酶抑制剂的制作方法
专利名称：新的法尼基蛋白转移酶抑制剂的制作方法
背景技术：
1995年4月20日公开的WO 95/10514、WO 95/10515、WO 95/10516、1997年7月3日公开的WO 97/23478及1998年12月32日公开的WO98/57949公开了用于抑制法尼基蛋白转移酶的三环化合物。
关于现有的法尼基蛋白转移酶抑制剂，本领域中最偏好可用于抑制法尼基蛋白转移酶的化合物。此贡献由本发明提供。
发明概述本发明提供选自下列的化合物 另一具体实施方案中，本发明提供制备中间体化合物(4)的方法 包括(a)使化合物(3) 溶于包括适宜非质子溶剂(例如CH2Cl2、CHCl3或苯)及二甲基乙酰胺的溶剂混合物中，该非质子溶剂对二甲基乙酰胺的摩尔比约1-10∶1.0。优选该非质子溶剂对二甲基乙酰胺的摩尔比为3.5∶1.0；(b)使反应混合物冷却至约(-)10℃至约(+)10℃的温度；
(c)添加约10至约40摩尔当量的亚硫酰溴(即SOBr2；优选SOBr2为新鲜制备(即于72小时内制备并使用)，更优选SOBr2于48小时内制备并使用；(d)在约(-)10℃至约(+)40℃的温度搅拌反应混合物(通常反应搅拌约4至约10小时，优选约4小时)；(e)以适当碱性水溶液如NaOH、NaHCO3、NH4OH等的水溶液碱化反应混合物。优选该碱性水溶液浓度为1N；及(f)以适当有机溶剂如CH2Cl2、乙酸乙酯等萃取所得溶液。
通常，上述方法所得的中间体化合物(4)使用本领域已知技术(如快速硅胶柱层析、HPLC等)纯化。
本发明化合物为具有良好药代动力学稳定性的强效法尼基蛋白转移酶抑制剂。
本发明的化合物(i)强效抑制法尼基蛋白转移酶，但不体外抑制香叶基香叶基蛋白转移酶I；(ii)阻断作为法尼基受体的转化Ras形式所诱导的表型变化而不阻断经基因工程化为香叶基香叶基受体的转化Ras形式所诱导的表型变化；(iii)阻断作为法尼基受体的Ras的细胞内加工，但不阻断经基因工程化为香叶基香叶基受体的Ras的细胞内加工；及(iv)阻断培养物中因转化Ras诱导的异常细胞生长。
本发明化合物可抑制法尼基蛋白转移酶及抑制原癌基因蛋白质Ras的法尼基化。因此，本发明又提供一种抑制哺乳类动物(尤其人类)法尼基蛋白转移酶(如ras法尼基蛋白转移酶)的方法，包括施用有效量(如治疗有效量)的下列三环化合物。对患者施用本发明的化合物而抑制法尼基蛋白转移酶可用以治疗下列癌症。
本发明提供一种抑制或治疗细胞(包含转化细胞)异常生长的方法，包括施用有效量(如治疗有效量)的本发明化合物。细胞异常生长是指与正常调节机制无关的细胞生长(如丧失接触抑制作用)。包含下列细胞的异常生长(1)表达活化Ras原癌基因的肿瘤细胞(肿瘤)；(2)其中Ras蛋白质因另一基因中原癌基因突变而活化的肿瘤细胞；(3)其中发生异常Ras活化的其他增殖性疾病的良性及恶性细胞。
本发明也提供一种抑制或治疗肿瘤生长的方法，包括对需此治疗的哺乳类动物(如人类)施用有效量(如治疗有效量)的本文所述三环化合物。尤其是，本发明提供一种抑制或治疗表达活化Ras原癌基因的肿瘤生长的方法，包括施用有效量(如治疗有效量)的下述化合物。
可抑制或治疗的肿瘤实例包含(但不限于)肺癌(如肺腺癌瘤)、胰癌(如胰癌如外分泌胰癌)、结肠癌(如结直肠癌例如结肠腺瘤及结肠腺癌)、髓细胞白血病(例如急性髓细胞白血病(AML))、甲状腺滤泡癌、脊髓发育不良综合征(MDS)、膀胱癌、表皮癌、黑色素瘤、乳癌及前列腺癌。
相信本发明也可提供一种抑制或治疗良性及恶性的增殖性疾病的方法，其中Ras蛋白质因其他基因中原癌基因突变引起异常活化，即Ras基因本身没有因突变成原癌形式而活化，所述抑制或治疗可通过对需此治疗的哺乳类动物(如人类)施用有效量(如治疗有效量)的本文所述的三环化合物来实施。例如良性增殖性疾病纤维神经瘤或其中Ras因酪氨酸激酶原癌基因(如neu、src、abl、lck及fyn)的突变或过度表达而活化的肿瘤可由本发明的三环化合物抑制或治疗。
用于本发明方法的三环化合物可抑制或治疗细胞异常生长。未受理论限制，相信这些化合物可经由抑制G-蛋白功能如Ras p21而阻断G-蛋白异戊二烯化而发挥功能，因而可用于治疗增殖性疾病如肿瘤生长及癌症。未受理论限制，相信这些化合物可抑制ras法尼基蛋白转移酶且因此显示对ras转化细胞的抗增殖活性。
发明详述本文中，使用术语具有下列定义，除非另有说明MH+-代表质谱中分子离子加上分子的氢；BOC-代表叔丁氧羰基；CH2Cl2-代表二氯甲烷；CIMS-代表化学离子化质谱；DEC-代表EDCI，其代表1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二酰亚胺盐酸盐；DMF-代表N，N-二甲基甲酰胺；Et-代表乙基；EtOAc-代表乙酸乙酯；EtOH-代表乙醇；HOBT-代表1-羟基苯并三唑水合物；IPA-代表异丙醇；
iPrOH-代表异丙醇；Me-代表甲基；MeOH-代表甲醇；MS-代表质谱；FAB-代表FABMS，其代表快速原子轰击质谱；HRMS-代表高分辨率质谱；NMM-代表N-甲基吗啉；Et3N-代表TEA，其代表三乙胺；t-BUTYL-代表-C(CH3)3；THF-代表四氢呋喃；FPT-代表法尼基蛋白转移酶。
本发明某些化合物可以不同异构形式存在(如对映异构体、非对映异构体、对映体)。本发明包含纯或混合物形式的所有这些异构体，包含消旋混合物。也包含烯醇形式。
某些三环化合物性质为酸性，如带有羧基或酚类羟基的此类化合物。此类化合物可形成药物可接受盐。盐的实例包含钠、钾、钙、铝、金及银盐。也包含与药物可接受胺如氨、烷基胺、羟基烷基胺、N-甲基葡糖胺等所形成的盐。
某些碱性三环化合物也可形成药物可接受盐如酸加成盐。例如，吡啶上的氮原子可与强酸形成盐，而具有碱性取代基如氨基的化合物也可与弱酸形成盐。形成盐的适当酸实例为盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、水杨酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸、马来酸、甲烷磺酸及其他无机酸及本领域已知的羧酸。该盐由游离碱形式与足量所需酸以常用方式接触生成盐而制备。该游离碱形式可由适当稀碱水溶液如NaOH稀水溶液、碳酸钾、氨及碳酸氢钠处理该盐而再生。游离碱形式在某些物理性质方面不同于其个别盐形式，如在极性溶剂中的溶解度，但酸及碱盐就本发明目的而言则与其个别游离碱形式均等。
所有酸及碱盐为本发明范围内的药物可接受盐，并且所有酸及碱盐被视为均等于用于本发明目的的相应化合物的游离形式。
本发明化合物可存在未溶剂化以及溶剂化形式，包含水合形式如半-水合物。通常，与药物可接受溶剂如水、乙醇等的溶剂化形式均等于本发明目的的未溶剂化形式。
下列方法可用以制造本发明化合物。
实施例制备实施例1步骤1 化合物(1)(见美国专利IN0549制备实施例9步骤D)20克(0.05摩尔)溶于1升无水THF。此溶液中添加冷却至-40℃的格氏试剂(80毫升，1.56M THF(250毫升)，0.125摩尔，2.5当量)。搅拌反应混合物0.5小时并接着以NH4Cl(100毫升)中止反应。蒸馏移除THF(1200毫升)及添加500毫升CH2Cl2，pH以10％HCl调整至5。水相以CH2Cl2(250毫升)萃取及有机相与水相分离。合并的有机相以饱和NaHCO3洗涤，接着以无水Na2SO4干燥及通过短硅胶垫。接着添加300毫升乙腈，蒸馏CH2Cl2直至仅留下300毫升。沉淀出结晶，收集并干燥获得15.9克(64％)标的氮杂酮；MH+＝501。
步骤2 于上述步骤1所得的化合物(3)(5.0克，9.97毫摩尔)于CH2Cl2(25毫升)溶液中添加二甲基乙酰胺(9.5克，109毫摩尔，10毫升)，反应混合物冷却到0℃。于反应混合物中缓慢添加亚硫酰溴(自NaBr及SOCl2新制备的35毫升)。反应搅拌4小时。反应混合物接着分配于饱和NaHCO3及CH2Cl2间。有机相以Na2SO4干燥接着用快速柱层析(硅胶，1％MeOH-NH3-CH2Cl2)纯化，获得固体产物(0.82克，17％产率)；mp＝73-75℃；MS(FAB)m/z 483(MH+)。
步骤3 于上述步骤2所得的化合物(4)(3.51克，7.3毫摩尔)于甲苯(70毫升)的溶液中缓慢添加Et3N(2.5克，25毫摩尔，3.6毫升)，使反应混合物回流。于反应混合物中添加氯代甲酸乙酯(3.96克，36.5毫摩尔，3.5毫升)，继续回流16小时。反应混合物分配于EtOAc及1N NaOH间。有机相以MgSO4干燥，接着用快速柱层析(硅胶，20％EtOAc-己烷)纯化，获得固体产物(3.70克，94％产率)；mp＝63-64℃；MS(FAB)m/z541(MH+)。
步骤4 于80毫升浓HCl中添加上述步骤3的化合物(5)(3.65克，6.8毫摩尔)。反应混合物回流16小时。接着冷却，倒入冰中及以50％NaOH水溶液碱化至pH＝10。水相以CH2Cl2萃取。有机相浓缩获得2.02克化合物(6)，mp＝88-89℃；MS m/z(实测强度)469(MH+)。
步骤5 使用Chiralpack AD柱及20％异丙醇-80％己烷-0.2％二乙胺作为洗脱液在HPLC上分离，获得对映异构体胺7及8。
化合物(7)mp＝82-83℃；[α]D22＝116.8°(7.64毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 469(MH+)。
化合物(8)mp＝88-89℃；[α]D22＝+150.0°(6.02毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 469(MH+)。
制备实施例2步骤1 制备实施例1步骤5的化合物(7)(0.74克，1.58毫摩尔)、哌啶基乙酸N-BOC(0.72克，3.16毫摩尔)、HOBT(0.27克，2.05毫摩尔)、DEC(0.39克，2.05毫摩尔)及无水DMF(10毫升)的混合物在25℃搅拌16小时。混合物真空浓缩，以CH2Cl2稀释及以饱和NaHCO3水溶液和10％NaH2PO4水溶液洗涤。有机相以无水MgSO4干燥及真空浓缩，获得固体(-)异构体化合物(9)(1.19克，100％产率)；mp＝73-74℃；MS(FAB)m/z 694.2(MH+)。
步骤2 化合物(9)(1.06克，上述步骤1的粗残留物)、无水二氯甲烷(15毫升)及三氟乙酸(4毫升)的溶液在0℃搅拌3小时。溶液于冰浴中冷却及以50％氢氧化钠水溶液处理直至碱性。混合物倒入二氯甲烷中，以水洗涤。有机相以无水MgSO4干燥及真空浓缩，获得化合物(10)(0.82克，100％产率)；mp＝94-95℃；MS(FAB)m/z 594(MH+)。
实例1化合物(11)的制备
化合物(7)(0.2克，0.43毫摩尔)(得自制备实施例1步骤5)、吡啶基乙酸N-氧化物(0.13克，0.86毫摩尔)、HOBT(0.075克，0.55毫摩尔)、DEC(0.106克，0.55毫摩尔)、N-甲基吗啉(0.06毫升，0.55毫摩尔)及无水DMF(5毫升)的混合物在25℃搅拌16小时。混合物真空浓缩，以CH2Cl2稀释，以饱和NaHCO3(水溶液)及饱和NaH2PO4(水溶液)洗涤。有机相以无水MgSO4干燥及真空浓缩，获得残留物，用快速柱层析(硅胶，5％MeOH/CH2Cl2+NH4OH)纯化，获得固体化合物(11)(0.12克，73％产率)。mp＝137-139℃；[α]D22＝-70.1°(10.1毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 604(MH+)。
实例2化合物12的制备 如实例1的相同程序制备化合物(12)，但使用制备实施例1步骤5的化合物(8)替代化合物(7)(产率89％)；mp＝142-143℃；[α]D22＝+75.2°(10.0毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 604(MH+)。
实例3化合物13的制备 于制备实施例1步骤5的化合物(7)(0.10克，0.21毫摩尔)及溶于无水二氯甲烷(5毫升)的三乙胺(0.043克，0.06毫升，0.43毫摩尔)中添加甲烷磺酰氯(0.037克，0.03毫升，0.32毫摩尔)。在室温搅拌过夜，溶液以二氯甲烷(100毫升)稀释，以饱和NaHCO3洗涤及无水硫酸镁干燥。过滤、真空浓缩获得化合物(13)(0.10克，89％，mp＝84-85℃)；[α]D22＝-73.1°(7毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 547(MH+)。
实例4化合物(14)的制备 如实例3的相同程序制备化合物(14)，但使用制备实施例1步骤5的化合物(8)替代化合物(7)(产率99％)；mp＝91-92℃；[α]D22＝+95.0°(10.0毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 547(MH+)。
实例5化合物(15)的制备 于制备实施例1步骤5的化合物(7)(0.78克，1.31毫摩尔)的无水二氯甲烷(20毫升)溶液中添加三甲基甲硅烷基异氰酸酯(1.21克，1.42毫升，10.51毫摩尔)。在25℃搅拌48小时后，溶液倒入二氯甲烷中，以饱和碳酸氢钠及盐水洗涤。有机相以无水MgSO4干燥，真空浓缩获得灰白色固体。用快速柱层析(硅胶)使用5％甲醇-含氢氧化铵的二氯甲烷进一步纯化，获得白色固体化合物(15)(0.56克，67％产率)。丙酮重结晶获得分析样品；mp＝146-147℃；[α]D25＝-68.8°(8.2毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 637(MH+)。
实例6化合物(16)的制备
如实例5的相同程序制备化合物(16)，但使用制备实施例1步骤5的化合物(8)替代化合物(7)(产率74％)；mp＝142-143℃；[α]D22＝+78.3°(11.8毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 637(MH+)。
分析1.体外酶分析法尼基蛋白转移酶的抑制作用。法尼基蛋白转移酶(FPT)基本上如Yokoyama，K等人(Yokoyama，K等人(1991)，对蛋白质戊二烯基化特异性的关联，Proc.Natl.Acad.Sci USA 885302-5306，其内容并于本文供参考)所述用硫酸铵分级接着用Q-Sepharose(Pharmacia公司)阴离子交换色谱法从大鼠脑部分地纯化。人类法尼基蛋白转移酶也使用编码a及b亚基的cDNA克隆在大肠杆菌中表达。所用方法类似于公开文献(Omer，C等人(1993)，重组人类法尼基蛋白转移酶的表征克隆、表达、法尼基二磷酸盐结合、及与酵母戊二烯基-蛋白转移酶的同源性，生物化学325167-5176)。人类法尼基蛋白转移酶从上述大肠杆菌的可溶蛋白级份部分地纯化。本文的三环法尼基蛋白转移酶抑制剂以类似效力抑制人类及大鼠的酶。制备两类val12-Ha-Ras蛋白质作为此类酶的底物，不同之处为其羧基端序列。一类末端为半胱氨酸-缬氨酸-丝氨酸(Ras-CVLS)，另一类末端为胱氨酸-缬氨酸-亮氨酸-亮氨酸(Ras-CVLL)。Ras-CVLS为法尼基蛋白转移酶的底物而Ras-CVLL为香叶基香叶基蛋白转移酶I的底物。编码此类蛋白质的cDNA经构建使得蛋白质含有6个组氨酸残基的氨基端延伸。两种蛋白质均于大肠杆菌中表达并使用金属鳌合剂亲和层析法纯化。放射标记的异戊二烯基焦磷酸盐底物[3H]法尼基焦磷酸盐及[3H]香叶基香叶基焦磷酸盐均购自DuPont/New England Nuclear。
测量法尼基蛋白转移酶活性的数种方法已有描述(Reiss等人1990，Cell 6281；Schaber等人1990，J.Biol.Chem.26514701；Manne等人1990，PNAS877541；及Barbacid & Manne 1993，USP5,185,248)。使用Reiss等人，1990(Cell 6281)所述类似条件，通过测量[3H]法尼基焦磷酸盐的[3H]法尼基转化成Ras-CVLS而评估活性。反应混合物含40mM Hepes，pH 7.5；20mM氯化镁；5mM二硫苏糖醇；0.25μM[3H]法尼基焦磷酸盐；10毫升Q-Sepharose-纯化的法尼基蛋白转移酶；所示浓度的三环化合物或二甲基亚砜(DMSO)载体对照组(5％DMSO终浓度)；及5mM Ras-CVLS，总体积为100毫升。反应在室温进行30分钟，接着以0.5毫升4％十二烷基硫酸钠(SDS)终止，接着以0.5毫升冷却的30％TCA终止。使样品置于冰上45分钟及使用Brandel细胞收集机于GF/C滤纸垫上收集沉淀的Ras蛋白质。滤纸以6％TCA、2％SDS洗涤一次及于Wallac 1204 Betaplate BS液体闪烁计数器测量放射活性。相对于DMSO载体对照组计算抑制百分比。
2.软琼脂分析不依赖锚定的生长是肿瘤发生细胞系的特征。人类肿瘤细胞悬浮于含0.3％琼脂糖及所示浓度的法尼基转移酶抑制剂的生长培养基中。溶液铺在以含相同浓度法尼基转移酶抑制剂的0.6％琼脂糖固化的生长培养基上作为顶层。顶层固化后，板在37℃于5％CO2孵育10-16天使克隆系自然生长。孵育后，克隆系以MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑盐，噻唑基蓝)(1毫克/毫升PBS)覆盖琼脂而染色。计数并测定IC50。
分析结果示于下表1
表1 施用及剂量就本发明所述化合物制备药物组合物而言，惰性药物可接受载体可为固体或液体。固体制剂包含粉剂、锭剂、可分散颗粒剂、胶囊、扁胶囊及栓剂。粉剂及锭剂可包括约5至约95％活性成分。适宜的固体载体为本领域已知，如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖或乳糖。锭剂、粉剂、扁胶囊及胶囊可作为适于口服的固体剂型使用。药物可接受载体及制造各种组合物的方法实例可见于A.Gennaro(编辑)，雷鸣顿氏(Remington′s)药物科学，第18版(1990)，宾州依士顿Mack出版公司。
液体制剂包含溶液、悬浮液及乳液。其实例包括水或水-丙二醇溶液以非经肠道注射或添加甜味剂及起雾剂供口服溶液、悬浮液及乳液用。液体制剂也可包含鼻内施用的溶液。
适用于吸入的气溶胶制剂可包含溶液及粉状固体，其可与药物可接受载体组合，如惰性压缩气体如氮气。
也包含固体制剂，其在使用前立即转化成液体制剂供口服或非经肠道给药。液体剂型包含溶液、悬浮液及乳液。
本发明化合物优选口服给药，每日一次。
本发明化合物也可为经皮递送。经皮组合物可为霜、洗液、气溶胶和/或乳液形式，且可包含本领域就此目的惯用的基质或储存形的经皮贴片。
优选药物制剂为单位剂型。此剂型中，制剂分成含适当量活性成分(有效达所需目的的量)的适当大小单位剂量。
本发明化合物对需此治疗的患者(如哺乳类例如人类)以有效量(如治疗有效量)给药。给药量足以抑制FPT。
单位剂量制剂中活性化合物量可变或依据特定用途调整至约0.01毫克至约1000毫克，优选约0.01毫克至约75 0毫克，更优选约0.01毫克至约500毫克，及最优选约0.01毫克至约250毫克。
所用实际剂量可依据患者需求及欲治疗病况严重性而变化。确定特定状况的适当剂量摄取为本领域技术人员所熟知。就便利而言，总日剂量可分为数次且若需要于一日间分数次给药。
本发明化合物和/或其药物可接受盐的给药量及次数将依据临床医师判断考虑如患者年龄、病况、体重及欲治疗病症的严重性等因素而调整。口服给药的一般推荐日剂量可为约0.04毫克/天至约4000毫克/天，分两次至四次剂量给药。
虽然本发明已由上述特定具体实施方案加以描述，但其许多改变、修饰及变化将为本领域技术人员所熟知。所有此类改变、修饰及变化均落于本发明精神及范围内。
权利要求
1.一种选自下列的化合物， 或其药物可接受盐。
2.一种下式的化合物， 或其药物可接受盐。
3.一种下式的化合物， 或其药物可接受盐。
4.一种下式的化合物， 或其药物可接受盐。
5.一种下式的化合物， 或其药物可接受盐。
6.一种下式的化合物， 或其药物可接受盐。
7.一种下式的化合物， 或其药物可接受盐。
8.一种抑制FPT的方法，包括对需此治疗的患者施用有效抑制FPT量的如权利要求1的化合物。
9.一种抑制肿瘤生长的方法，包括对需此治疗的患者施用有效抑制肿瘤量的如权利要求1的化合物。
10.一种药物组合物，包括有效量的如权利要求1的化合物及药物可接受载体。
11.一种抑制胰肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、髓细胞白血病肿瘤细胞、甲状腺滤泡肿瘤细胞、脊髓发育不良肿瘤细胞、表皮癌肿瘤细胞、膀胱肿瘤细胞或结肠肿瘤细胞的方法，包括对需此治疗的患者施用有效抑制肿瘤量的如权利要求1的化合物。
12.一种制备化合物(4)的方法， 包括以下步骤(a)使化合物(3) 溶于包括适宜非质子溶剂及二甲基乙酰胺的溶剂混合物中；(b)使反应混合物冷却至(-)10℃至(+)10℃的温度；(c)添加亚硫酰溴；(d)在(-)10℃至(+)40℃的温度搅拌反应混合物；(e)碱化反应混合物；及(f)以适当有机溶剂萃取所得溶液。
13.如权利要求12的方法，其中非质子溶剂为CH2Cl2。
14.如权利要求12的方法，其中反应在0℃搅拌4小时。
15.如权利要求12的方法，包括(a)使化合物(3)溶于CH2Cl2(3.5摩尔)及二甲基乙酰胺(1.0摩尔)的溶剂混合物中；(b)使反应混合物冷却至0℃的温度；(c)添加亚硫酰溴；(d)在0℃的温度搅拌反应混合物4小时；(e)以NaHCO3水溶液碱化；(f)以CH2Cl2萃取所得溶液；及(g)用快速硅胶柱层析纯化产物。
全文摘要
本发明描述了用于抑制法尼基蛋白转移酶的化合物。本发明还公开了包含这种化合物的药物组合物以及使用它们来治疗与FPT相关的疾病的方法。
文档编号A61P35/00GK1476444SQ01819460
公开日2004年2月18日 申请日期2001年11月27日 优先权日2000年11月29日
发明者F·G·诺洛奇, B·维布范, V·M·吉里亚瓦拉班, 施雄卫, F G 诺洛奇, 吉里亚瓦拉班, 挤 申请人:先灵公司
背景技术：
1995年4月20日公开的WO 95/10514、WO 95/10515、WO 95/10516、1997年7月3日公开的WO 97/23478及1998年12月32日公开的WO98/57949公开了用于抑制法尼基蛋白转移酶的三环化合物。
关于现有的法尼基蛋白转移酶抑制剂，本领域中最偏好可用于抑制法尼基蛋白转移酶的化合物。此贡献由本发明提供。
发明概述本发明提供选自下列的化合物 另一具体实施方案中，本发明提供制备中间体化合物(4)的方法 包括(a)使化合物(3) 溶于包括适宜非质子溶剂(例如CH2Cl2、CHCl3或苯)及二甲基乙酰胺的溶剂混合物中，该非质子溶剂对二甲基乙酰胺的摩尔比约1-10∶1.0。优选该非质子溶剂对二甲基乙酰胺的摩尔比为3.5∶1.0；(b)使反应混合物冷却至约(-)10℃至约(+)10℃的温度；
(c)添加约10至约40摩尔当量的亚硫酰溴(即SOBr2；优选SOBr2为新鲜制备(即于72小时内制备并使用)，更优选SOBr2于48小时内制备并使用；(d)在约(-)10℃至约(+)40℃的温度搅拌反应混合物(通常反应搅拌约4至约10小时，优选约4小时)；(e)以适当碱性水溶液如NaOH、NaHCO3、NH4OH等的水溶液碱化反应混合物。优选该碱性水溶液浓度为1N；及(f)以适当有机溶剂如CH2Cl2、乙酸乙酯等萃取所得溶液。
通常，上述方法所得的中间体化合物(4)使用本领域已知技术(如快速硅胶柱层析、HPLC等)纯化。
本发明化合物为具有良好药代动力学稳定性的强效法尼基蛋白转移酶抑制剂。
本发明的化合物(i)强效抑制法尼基蛋白转移酶，但不体外抑制香叶基香叶基蛋白转移酶I；(ii)阻断作为法尼基受体的转化Ras形式所诱导的表型变化而不阻断经基因工程化为香叶基香叶基受体的转化Ras形式所诱导的表型变化；(iii)阻断作为法尼基受体的Ras的细胞内加工，但不阻断经基因工程化为香叶基香叶基受体的Ras的细胞内加工；及(iv)阻断培养物中因转化Ras诱导的异常细胞生长。
本发明化合物可抑制法尼基蛋白转移酶及抑制原癌基因蛋白质Ras的法尼基化。因此，本发明又提供一种抑制哺乳类动物(尤其人类)法尼基蛋白转移酶(如ras法尼基蛋白转移酶)的方法，包括施用有效量(如治疗有效量)的下列三环化合物。对患者施用本发明的化合物而抑制法尼基蛋白转移酶可用以治疗下列癌症。
本发明提供一种抑制或治疗细胞(包含转化细胞)异常生长的方法，包括施用有效量(如治疗有效量)的本发明化合物。细胞异常生长是指与正常调节机制无关的细胞生长(如丧失接触抑制作用)。包含下列细胞的异常生长(1)表达活化Ras原癌基因的肿瘤细胞(肿瘤)；(2)其中Ras蛋白质因另一基因中原癌基因突变而活化的肿瘤细胞；(3)其中发生异常Ras活化的其他增殖性疾病的良性及恶性细胞。
本发明也提供一种抑制或治疗肿瘤生长的方法，包括对需此治疗的哺乳类动物(如人类)施用有效量(如治疗有效量)的本文所述三环化合物。尤其是，本发明提供一种抑制或治疗表达活化Ras原癌基因的肿瘤生长的方法，包括施用有效量(如治疗有效量)的下述化合物。
可抑制或治疗的肿瘤实例包含(但不限于)肺癌(如肺腺癌瘤)、胰癌(如胰癌如外分泌胰癌)、结肠癌(如结直肠癌例如结肠腺瘤及结肠腺癌)、髓细胞白血病(例如急性髓细胞白血病(AML))、甲状腺滤泡癌、脊髓发育不良综合征(MDS)、膀胱癌、表皮癌、黑色素瘤、乳癌及前列腺癌。
相信本发明也可提供一种抑制或治疗良性及恶性的增殖性疾病的方法，其中Ras蛋白质因其他基因中原癌基因突变引起异常活化，即Ras基因本身没有因突变成原癌形式而活化，所述抑制或治疗可通过对需此治疗的哺乳类动物(如人类)施用有效量(如治疗有效量)的本文所述的三环化合物来实施。例如良性增殖性疾病纤维神经瘤或其中Ras因酪氨酸激酶原癌基因(如neu、src、abl、lck及fyn)的突变或过度表达而活化的肿瘤可由本发明的三环化合物抑制或治疗。
用于本发明方法的三环化合物可抑制或治疗细胞异常生长。未受理论限制，相信这些化合物可经由抑制G-蛋白功能如Ras p21而阻断G-蛋白异戊二烯化而发挥功能，因而可用于治疗增殖性疾病如肿瘤生长及癌症。未受理论限制，相信这些化合物可抑制ras法尼基蛋白转移酶且因此显示对ras转化细胞的抗增殖活性。
发明详述本文中，使用术语具有下列定义，除非另有说明MH+-代表质谱中分子离子加上分子的氢；BOC-代表叔丁氧羰基；CH2Cl2-代表二氯甲烷；CIMS-代表化学离子化质谱；DEC-代表EDCI，其代表1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二酰亚胺盐酸盐；DMF-代表N，N-二甲基甲酰胺；Et-代表乙基；EtOAc-代表乙酸乙酯；EtOH-代表乙醇；HOBT-代表1-羟基苯并三唑水合物；IPA-代表异丙醇；
iPrOH-代表异丙醇；Me-代表甲基；MeOH-代表甲醇；MS-代表质谱；FAB-代表FABMS，其代表快速原子轰击质谱；HRMS-代表高分辨率质谱；NMM-代表N-甲基吗啉；Et3N-代表TEA，其代表三乙胺；t-BUTYL-代表-C(CH3)3；THF-代表四氢呋喃；FPT-代表法尼基蛋白转移酶。
本发明某些化合物可以不同异构形式存在(如对映异构体、非对映异构体、对映体)。本发明包含纯或混合物形式的所有这些异构体，包含消旋混合物。也包含烯醇形式。
某些三环化合物性质为酸性，如带有羧基或酚类羟基的此类化合物。此类化合物可形成药物可接受盐。盐的实例包含钠、钾、钙、铝、金及银盐。也包含与药物可接受胺如氨、烷基胺、羟基烷基胺、N-甲基葡糖胺等所形成的盐。
某些碱性三环化合物也可形成药物可接受盐如酸加成盐。例如，吡啶上的氮原子可与强酸形成盐，而具有碱性取代基如氨基的化合物也可与弱酸形成盐。形成盐的适当酸实例为盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、水杨酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸、马来酸、甲烷磺酸及其他无机酸及本领域已知的羧酸。该盐由游离碱形式与足量所需酸以常用方式接触生成盐而制备。该游离碱形式可由适当稀碱水溶液如NaOH稀水溶液、碳酸钾、氨及碳酸氢钠处理该盐而再生。游离碱形式在某些物理性质方面不同于其个别盐形式，如在极性溶剂中的溶解度，但酸及碱盐就本发明目的而言则与其个别游离碱形式均等。
所有酸及碱盐为本发明范围内的药物可接受盐，并且所有酸及碱盐被视为均等于用于本发明目的的相应化合物的游离形式。
本发明化合物可存在未溶剂化以及溶剂化形式，包含水合形式如半-水合物。通常，与药物可接受溶剂如水、乙醇等的溶剂化形式均等于本发明目的的未溶剂化形式。
下列方法可用以制造本发明化合物。
实施例制备实施例1步骤1 化合物(1)(见美国专利IN0549制备实施例9步骤D)20克(0.05摩尔)溶于1升无水THF。此溶液中添加冷却至-40℃的格氏试剂(80毫升，1.56M THF(250毫升)，0.125摩尔，2.5当量)。搅拌反应混合物0.5小时并接着以NH4Cl(100毫升)中止反应。蒸馏移除THF(1200毫升)及添加500毫升CH2Cl2，pH以10％HCl调整至5。水相以CH2Cl2(250毫升)萃取及有机相与水相分离。合并的有机相以饱和NaHCO3洗涤，接着以无水Na2SO4干燥及通过短硅胶垫。接着添加300毫升乙腈，蒸馏CH2Cl2直至仅留下300毫升。沉淀出结晶，收集并干燥获得15.9克(64％)标的氮杂酮；MH+＝501。
步骤2 于上述步骤1所得的化合物(3)(5.0克，9.97毫摩尔)于CH2Cl2(25毫升)溶液中添加二甲基乙酰胺(9.5克，109毫摩尔，10毫升)，反应混合物冷却到0℃。于反应混合物中缓慢添加亚硫酰溴(自NaBr及SOCl2新制备的35毫升)。反应搅拌4小时。反应混合物接着分配于饱和NaHCO3及CH2Cl2间。有机相以Na2SO4干燥接着用快速柱层析(硅胶，1％MeOH-NH3-CH2Cl2)纯化，获得固体产物(0.82克，17％产率)；mp＝73-75℃；MS(FAB)m/z 483(MH+)。
步骤3 于上述步骤2所得的化合物(4)(3.51克，7.3毫摩尔)于甲苯(70毫升)的溶液中缓慢添加Et3N(2.5克，25毫摩尔，3.6毫升)，使反应混合物回流。于反应混合物中添加氯代甲酸乙酯(3.96克，36.5毫摩尔，3.5毫升)，继续回流16小时。反应混合物分配于EtOAc及1N NaOH间。有机相以MgSO4干燥，接着用快速柱层析(硅胶，20％EtOAc-己烷)纯化，获得固体产物(3.70克，94％产率)；mp＝63-64℃；MS(FAB)m/z541(MH+)。
步骤4 于80毫升浓HCl中添加上述步骤3的化合物(5)(3.65克，6.8毫摩尔)。反应混合物回流16小时。接着冷却，倒入冰中及以50％NaOH水溶液碱化至pH＝10。水相以CH2Cl2萃取。有机相浓缩获得2.02克化合物(6)，mp＝88-89℃；MS m/z(实测强度)469(MH+)。
步骤5 使用Chiralpack AD柱及20％异丙醇-80％己烷-0.2％二乙胺作为洗脱液在HPLC上分离，获得对映异构体胺7及8。
化合物(7)mp＝82-83℃；[α]D22＝116.8°(7.64毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 469(MH+)。
化合物(8)mp＝88-89℃；[α]D22＝+150.0°(6.02毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 469(MH+)。
制备实施例2步骤1 制备实施例1步骤5的化合物(7)(0.74克，1.58毫摩尔)、哌啶基乙酸N-BOC(0.72克，3.16毫摩尔)、HOBT(0.27克，2.05毫摩尔)、DEC(0.39克，2.05毫摩尔)及无水DMF(10毫升)的混合物在25℃搅拌16小时。混合物真空浓缩，以CH2Cl2稀释及以饱和NaHCO3水溶液和10％NaH2PO4水溶液洗涤。有机相以无水MgSO4干燥及真空浓缩，获得固体(-)异构体化合物(9)(1.19克，100％产率)；mp＝73-74℃；MS(FAB)m/z 694.2(MH+)。
步骤2 化合物(9)(1.06克，上述步骤1的粗残留物)、无水二氯甲烷(15毫升)及三氟乙酸(4毫升)的溶液在0℃搅拌3小时。溶液于冰浴中冷却及以50％氢氧化钠水溶液处理直至碱性。混合物倒入二氯甲烷中，以水洗涤。有机相以无水MgSO4干燥及真空浓缩，获得化合物(10)(0.82克，100％产率)；mp＝94-95℃；MS(FAB)m/z 594(MH+)。
实例1化合物(11)的制备
化合物(7)(0.2克，0.43毫摩尔)(得自制备实施例1步骤5)、吡啶基乙酸N-氧化物(0.13克，0.86毫摩尔)、HOBT(0.075克，0.55毫摩尔)、DEC(0.106克，0.55毫摩尔)、N-甲基吗啉(0.06毫升，0.55毫摩尔)及无水DMF(5毫升)的混合物在25℃搅拌16小时。混合物真空浓缩，以CH2Cl2稀释，以饱和NaHCO3(水溶液)及饱和NaH2PO4(水溶液)洗涤。有机相以无水MgSO4干燥及真空浓缩，获得残留物，用快速柱层析(硅胶，5％MeOH/CH2Cl2+NH4OH)纯化，获得固体化合物(11)(0.12克，73％产率)。mp＝137-139℃；[α]D22＝-70.1°(10.1毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 604(MH+)。
实例2化合物12的制备 如实例1的相同程序制备化合物(12)，但使用制备实施例1步骤5的化合物(8)替代化合物(7)(产率89％)；mp＝142-143℃；[α]D22＝+75.2°(10.0毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 604(MH+)。
实例3化合物13的制备 于制备实施例1步骤5的化合物(7)(0.10克，0.21毫摩尔)及溶于无水二氯甲烷(5毫升)的三乙胺(0.043克，0.06毫升，0.43毫摩尔)中添加甲烷磺酰氯(0.037克，0.03毫升，0.32毫摩尔)。在室温搅拌过夜，溶液以二氯甲烷(100毫升)稀释，以饱和NaHCO3洗涤及无水硫酸镁干燥。过滤、真空浓缩获得化合物(13)(0.10克，89％，mp＝84-85℃)；[α]D22＝-73.1°(7毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 547(MH+)。
实例4化合物(14)的制备 如实例3的相同程序制备化合物(14)，但使用制备实施例1步骤5的化合物(8)替代化合物(7)(产率99％)；mp＝91-92℃；[α]D22＝+95.0°(10.0毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 547(MH+)。
实例5化合物(15)的制备 于制备实施例1步骤5的化合物(7)(0.78克，1.31毫摩尔)的无水二氯甲烷(20毫升)溶液中添加三甲基甲硅烷基异氰酸酯(1.21克，1.42毫升，10.51毫摩尔)。在25℃搅拌48小时后，溶液倒入二氯甲烷中，以饱和碳酸氢钠及盐水洗涤。有机相以无水MgSO4干燥，真空浓缩获得灰白色固体。用快速柱层析(硅胶)使用5％甲醇-含氢氧化铵的二氯甲烷进一步纯化，获得白色固体化合物(15)(0.56克，67％产率)。丙酮重结晶获得分析样品；mp＝146-147℃；[α]D25＝-68.8°(8.2毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 637(MH+)。
实例6化合物(16)的制备
如实例5的相同程序制备化合物(16)，但使用制备实施例1步骤5的化合物(8)替代化合物(7)(产率74％)；mp＝142-143℃；[α]D22＝+78.3°(11.8毫克/2毫升CHCl3)；MS(FAB)m/z 637(MH+)。
分析1.体外酶分析法尼基蛋白转移酶的抑制作用。法尼基蛋白转移酶(FPT)基本上如Yokoyama，K等人(Yokoyama，K等人(1991)，对蛋白质戊二烯基化特异性的关联，Proc.Natl.Acad.Sci USA 885302-5306，其内容并于本文供参考)所述用硫酸铵分级接着用Q-Sepharose(Pharmacia公司)阴离子交换色谱法从大鼠脑部分地纯化。人类法尼基蛋白转移酶也使用编码a及b亚基的cDNA克隆在大肠杆菌中表达。所用方法类似于公开文献(Omer，C等人(1993)，重组人类法尼基蛋白转移酶的表征克隆、表达、法尼基二磷酸盐结合、及与酵母戊二烯基-蛋白转移酶的同源性，生物化学325167-5176)。人类法尼基蛋白转移酶从上述大肠杆菌的可溶蛋白级份部分地纯化。本文的三环法尼基蛋白转移酶抑制剂以类似效力抑制人类及大鼠的酶。制备两类val12-Ha-Ras蛋白质作为此类酶的底物，不同之处为其羧基端序列。一类末端为半胱氨酸-缬氨酸-丝氨酸(Ras-CVLS)，另一类末端为胱氨酸-缬氨酸-亮氨酸-亮氨酸(Ras-CVLL)。Ras-CVLS为法尼基蛋白转移酶的底物而Ras-CVLL为香叶基香叶基蛋白转移酶I的底物。编码此类蛋白质的cDNA经构建使得蛋白质含有6个组氨酸残基的氨基端延伸。两种蛋白质均于大肠杆菌中表达并使用金属鳌合剂亲和层析法纯化。放射标记的异戊二烯基焦磷酸盐底物[3H]法尼基焦磷酸盐及[3H]香叶基香叶基焦磷酸盐均购自DuPont/New England Nuclear。
测量法尼基蛋白转移酶活性的数种方法已有描述(Reiss等人1990，Cell 6281；Schaber等人1990，J.Biol.Chem.26514701；Manne等人1990，PNAS877541；及Barbacid & Manne 1993，USP5,185,248)。使用Reiss等人，1990(Cell 6281)所述类似条件，通过测量[3H]法尼基焦磷酸盐的[3H]法尼基转化成Ras-CVLS而评估活性。反应混合物含40mM Hepes，pH 7.5；20mM氯化镁；5mM二硫苏糖醇；0.25μM[3H]法尼基焦磷酸盐；10毫升Q-Sepharose-纯化的法尼基蛋白转移酶；所示浓度的三环化合物或二甲基亚砜(DMSO)载体对照组(5％DMSO终浓度)；及5mM Ras-CVLS，总体积为100毫升。反应在室温进行30分钟，接着以0.5毫升4％十二烷基硫酸钠(SDS)终止，接着以0.5毫升冷却的30％TCA终止。使样品置于冰上45分钟及使用Brandel细胞收集机于GF/C滤纸垫上收集沉淀的Ras蛋白质。滤纸以6％TCA、2％SDS洗涤一次及于Wallac 1204 Betaplate BS液体闪烁计数器测量放射活性。相对于DMSO载体对照组计算抑制百分比。
2.软琼脂分析不依赖锚定的生长是肿瘤发生细胞系的特征。人类肿瘤细胞悬浮于含0.3％琼脂糖及所示浓度的法尼基转移酶抑制剂的生长培养基中。溶液铺在以含相同浓度法尼基转移酶抑制剂的0.6％琼脂糖固化的生长培养基上作为顶层。顶层固化后，板在37℃于5％CO2孵育10-16天使克隆系自然生长。孵育后，克隆系以MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑盐，噻唑基蓝)(1毫克/毫升PBS)覆盖琼脂而染色。计数并测定IC50。
分析结果示于下表1
表1 施用及剂量就本发明所述化合物制备药物组合物而言，惰性药物可接受载体可为固体或液体。固体制剂包含粉剂、锭剂、可分散颗粒剂、胶囊、扁胶囊及栓剂。粉剂及锭剂可包括约5至约95％活性成分。适宜的固体载体为本领域已知，如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖或乳糖。锭剂、粉剂、扁胶囊及胶囊可作为适于口服的固体剂型使用。药物可接受载体及制造各种组合物的方法实例可见于A.Gennaro(编辑)，雷鸣顿氏(Remington′s)药物科学，第18版(1990)，宾州依士顿Mack出版公司。
液体制剂包含溶液、悬浮液及乳液。其实例包括水或水-丙二醇溶液以非经肠道注射或添加甜味剂及起雾剂供口服溶液、悬浮液及乳液用。液体制剂也可包含鼻内施用的溶液。
适用于吸入的气溶胶制剂可包含溶液及粉状固体，其可与药物可接受载体组合，如惰性压缩气体如氮气。
也包含固体制剂，其在使用前立即转化成液体制剂供口服或非经肠道给药。液体剂型包含溶液、悬浮液及乳液。
本发明化合物优选口服给药，每日一次。
本发明化合物也可为经皮递送。经皮组合物可为霜、洗液、气溶胶和/或乳液形式，且可包含本领域就此目的惯用的基质或储存形的经皮贴片。
优选药物制剂为单位剂型。此剂型中，制剂分成含适当量活性成分(有效达所需目的的量)的适当大小单位剂量。
本发明化合物对需此治疗的患者(如哺乳类例如人类)以有效量(如治疗有效量)给药。给药量足以抑制FPT。
单位剂量制剂中活性化合物量可变或依据特定用途调整至约0.01毫克至约1000毫克，优选约0.01毫克至约75 0毫克，更优选约0.01毫克至约500毫克，及最优选约0.01毫克至约250毫克。
所用实际剂量可依据患者需求及欲治疗病况严重性而变化。确定特定状况的适当剂量摄取为本领域技术人员所熟知。就便利而言，总日剂量可分为数次且若需要于一日间分数次给药。
本发明化合物和/或其药物可接受盐的给药量及次数将依据临床医师判断考虑如患者年龄、病况、体重及欲治疗病症的严重性等因素而调整。口服给药的一般推荐日剂量可为约0.04毫克/天至约4000毫克/天，分两次至四次剂量给药。
虽然本发明已由上述特定具体实施方案加以描述，但其许多改变、修饰及变化将为本领域技术人员所熟知。所有此类改变、修饰及变化均落于本发明精神及范围内。
权利要求
1.一种选自下列的化合物， 或其药物可接受盐。
2.一种下式的化合物， 或其药物可接受盐。
3.一种下式的化合物， 或其药物可接受盐。
4.一种下式的化合物， 或其药物可接受盐。
5.一种下式的化合物， 或其药物可接受盐。
6.一种下式的化合物， 或其药物可接受盐。
7.一种下式的化合物， 或其药物可接受盐。
8.一种抑制FPT的方法，包括对需此治疗的患者施用有效抑制FPT量的如权利要求1的化合物。
9.一种抑制肿瘤生长的方法，包括对需此治疗的患者施用有效抑制肿瘤量的如权利要求1的化合物。
10.一种药物组合物，包括有效量的如权利要求1的化合物及药物可接受载体。
11.一种抑制胰肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、髓细胞白血病肿瘤细胞、甲状腺滤泡肿瘤细胞、脊髓发育不良肿瘤细胞、表皮癌肿瘤细胞、膀胱肿瘤细胞或结肠肿瘤细胞的方法，包括对需此治疗的患者施用有效抑制肿瘤量的如权利要求1的化合物。
12.一种制备化合物(4)的方法， 包括以下步骤(a)使化合物(3) 溶于包括适宜非质子溶剂及二甲基乙酰胺的溶剂混合物中；(b)使反应混合物冷却至(-)10℃至(+)10℃的温度；(c)添加亚硫酰溴；(d)在(-)10℃至(+)40℃的温度搅拌反应混合物；(e)碱化反应混合物；及(f)以适当有机溶剂萃取所得溶液。
13.如权利要求12的方法，其中非质子溶剂为CH2Cl2。
14.如权利要求12的方法，其中反应在0℃搅拌4小时。
15.如权利要求12的方法，包括(a)使化合物(3)溶于CH2Cl2(3.5摩尔)及二甲基乙酰胺(1.0摩尔)的溶剂混合物中；(b)使反应混合物冷却至0℃的温度；(c)添加亚硫酰溴；(d)在0℃的温度搅拌反应混合物4小时；(e)以NaHCO3水溶液碱化；(f)以CH2Cl2萃取所得溶液；及(g)用快速硅胶柱层析纯化产物。
全文摘要
本发明描述了用于抑制法尼基蛋白转移酶的化合物。本发明还公开了包含这种化合物的药物组合物以及使用它们来治疗与FPT相关的疾病的方法。
文档编号A61P35/00GK1476444SQ01819460
公开日2004年2月18日 申请日期2001年11月27日 优先权日2000年11月29日
发明者F·G·诺洛奇, B·维布范, V·M·吉里亚瓦拉班, 施雄卫, F G 诺洛奇, 吉里亚瓦拉班, 挤 申请人:先灵公司
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