鱼用浸泡疫苗组合佐剂及其应用和使用方法

专利名称：：鱼用浸泡疫苗组合佐剂及其应用和使用方法
技术领域：
：本发明涉及海洋生物疾病免疫防治技术，具体是鱼用浸泡疫苗组合佐剂及其应用和使用方法。
背景技术：
：我国养殖鱼类产量据世界首位，但鱼类的疾病防治技术研发速度较慢，开发的渔用疾病防治产品不能满足生产的需求，特别在渔用疫苗开发与应用方面，目前可供渔业生产上选择使用的产品不多。因此养殖中鱼类细菌性疾病治疗过多依靠投喂抗生素，其结果是长期的应用抗生素不仅会降低水产品的质量，还会导致细菌的耐药性增强，给以后的疾病控制增加难度。国外在鱼类疾病控制方面已普遍采用疫苗免疫的方法，包括注射用疫苗、浸泡用疫苗及口服疫苗等。国内的鱼用疫苗产品制剂种类不多，在鱼类疫苗研究方面多侧重于注射用疫苗。鱼类注射用疫苗对疾病预防效果明显，但注射免疫工作量大、工作效率低，且会对鱼体造成伤害。而鱼类浸泡用疫苗不存在上述缺点，但单纯的使用疫苗浸泡效果不佳。目前，有关鱼类浸泡免疫用疫苗产品因受浸泡免疫效果较差的限制，开发的产品不多。国内已开发的鱼类浸泡疫苗佐剂有莨菪碱、葡聚糖、MS1312，试验证实，使用后免疫保护率均不理想。而国外的鱼类浸泡免疫佐剂多为保密配方。基于以上现状，我国的鱼类浸泡疫苗研发速度处于缓慢发展状态，限制阻碍了产业的发展。因此提供鱼类浸泡疫苗佐剂，提高鱼类浸泡疫苗效果，对推动水产养殖用疫苗制剂产业的快速发展是非常必要的。
发明内容本发明的目的是为鱼类浸泡用疫苗提供一种高效的免疫组合佐剂。鱼类选用浸泡疫苗免疫，不仅操作方便节省时间，而且相对于注射免疫对鱼的损伤小，因此鱼类选用浸泡疫苗免疫是一种最佳的免疫方案。但选用浸泡疫苗免疫时，在通常不加浸泡疫苗佐剂或特异免疫增强剂的情况下，鱼体仅仅通过鳃部接触疫苗抗原，身体表面其他的可以激发免疫反应的部位多被体表的粘液所覆盖，导致可呈递疫苗抗原的细胞不能有效接触到疫苗抗原，因此使用能够去除鱼体粘液的佐剂成分，可以提高鱼类浸泡疫苗免疫的效果。研究经过试验研究发现二硫苏糖醇(简称DTT)，能温和溶解鱼体表粘液，VD3可以提高鱼类粘液免疫力，而消旋山莨菪碱(又称654-2)可使鱼体肌肉松弛，易于疫苗抗原向体内的渗入。三种佐剂通过组合使用能够有效提高鱼类浸泡疫苗免疫效果，具备佐剂的功能，且安全试验证实在使用浓度范围内对鱼类及环境安全。因此确定DTT、VD3和645-2作为鱼类浸泡疫苗免疫组合佐剂。因此，本发明鱼用浸泡疫苗组合佐剂其特征在于作为鱼类浸泡疫苗的组合佐剂包括DTT、VD3和645-2，其使用浓度范围分别为l-50mg/L、0.l-20mg/L和l-60mg/L。本发明的使用方法首先选用体表完好健康的待免疫鱼类，体重应在每尾2g以上将待免疫的鱼移入浓度范围为l-50mg/LDTT预处理液中，浸泡时间l_20min后，向其中加入浓度范围为0.l-20mg/L的VD3与待用疫苗，待2-20min之后再向其中加入浓度范围为l-60mg/L的645-2，待5-20min即完成免疫。将浓度分别在l-50mg/L、0.1-20mg/L和l_60mg/L的DTT、VD3和645-2免疫组合佐剂，应用于包括海水和淡水鱼类的浸泡疫苗中协同作用达到高效的免疫效果。本发明的积极效果在于用DTT、VD3、654-2组合制剂作为疫苗组合佐剂后显著提高疫苗的免疫效果，效果显著好于单一佐剂；使用方法简便，成本较低，使用安全，对鱼的存活率与生长速度没有影响，而且不需要额外的设施与工序，对环境及操作人员同样无害。具体实施例方式本发明鱼用浸泡疫苗组合佐剂其特征在于作为鱼类浸泡疫苗的组合佐剂包括DTT、VD3和645-2，其中DTT、VD3和645-2的使用浓度范围分别为1-50mg/L、0.l-20mg/L和l-60mg/L。考虑到免疫效果，上述DTT和645-2的纯度优于或相当于化学纯级。本发明的使用方法如下(1)首先选用体表完好健康的待免疫鱼类，体重应在每尾2g以上；(2)将待免疫的鱼移入浓度范围为l-50mg/LDTT预处理液中，浸泡时间l-20min后，向其中加入浓度范围为0.l-20mg/L的VD3与待用疫苗，维持2-20min，之后再向其中加入浓度范围为l-60mg/L的645-2再维持5-20min，完成免疫。为了保证免疫效果，浸泡时水中溶解氧保持7mg/L以上，温度变化控制在士2t:内。完成浸泡免疫后，小心将鱼移入养殖池进行养殖即可。以下通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1:应用本发明的浓度分别为lmg/L、0.lmg/L、60mg/L的DTT、VD3、654-2组合佐剂和灭活鳗弧菌(Vibrio.Anguillarum)疫苗对牙鲆浸泡免疫1材料(1)试验用鱼及养殖管理选用体重5g的健康牙鲆，试验前暂养1周，试验用海水稳定20-23°C，pH8.1-8.2，盐度30，试验期间投喂配合佴料，日投喂2次，24小时连续充气，流水养殖。(2)疫苗制备将V.anguilla進接种至2216E液体培养基，28°C培养24h;4t:下4000rpm离心20min，收集菌体；将收集的菌体置于灭菌的PBS，pH7.2中，制成1.0X108cells/mL的弧菌悬液，0.5X甲醛28t:下灭活48h后为试验用疫苗，4t:储存；同时将灭活后的菌体接种于TSB固体平板，置2『C下恒温培养24h、48h，确定无菌落长出。(3)浸泡免疫佐剂DTT、VD3、654-2，使用浓度分别为lmg/L、0.lmg/L、60mg/L。2试验方法(1)试验分组试验设注射免疫组、无佐剂疫苗浸泡免疫组、佐剂+疫苗浸泡免疫组、注射空白对照组，浸泡空白对照组，每组设三个平行，每组3X30尾鱼。(2)免疫方法试验鱼暂养1周后，注射免疫组每尾鱼腹腔注射浓度为1.0X108cells/mL的弧菌疫苗O.lml;无佐剂疫苗浸泡免疫组用海水配制疫苗浓度1.0X107cells/mL，浸泡60min;佐剂+疫苗浸泡免疫组为先用DTT溶液浸泡待免鱼20min，之后加入疫苗及VD3维持20min，再加入654-2维持20min;注射空白对照组与浸泡空白对4照分别用PBS溶液腹腔注射和海水浸泡，方法相同。(3)免疫后攻毒免疫30天后各组用V.Anguillarum攻毒，攻毒采用注射感染，剂量为5.0X106cells/尾。3试验结果攻毒15天后，统计个组的存活率，根据公式RPS=(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)X100X。计算免疫相当保护率。结果见表l表1应用DTT、VD3、654-2组合制剂为佐剂浸泡免疫牙鲆的免疫相对保护率平均魏98.3050827.11864鹏lj攻毒離死亡郫固201594.91525微繊且2000100200010020126038.9830520157523.7288120168018.64407组鄉峰泡顿组2042079.661022042079.661022031584.74576201995糊PBS组20199520201002020100浸鹏鄉202010020199581.35593实验结果表明，单纯用V.anguillarum灭活疫苗浸泡免疫牙鲆，免疫相对保护率仅为27%，使用佐剂DTT、VD3、654-2组合佐剂后，疫苗浸泡免疫相对保护率提高到81%，显然应用本发明后对海水鱼的免疫效果提高明显。实施例2:应用本发明的浓度分别为50mg/L、20mg/L、lmg/L的DTT、VD3、654-2组合佐剂和和灭活点状气单胞菌疫苗对罗非鱼浸泡免疫1材料(1)试验用鱼及养殖管理选用体重3g的健康罗非鱼，试验前暂养10天，试验用淡水温度27-28°C，pH7.1-7.2，试验期间投喂配合饵料，日投喂2次，日换水30%，24小时连续充气。(2)疫苗制备将点状气单胞菌接种到LB液体培养基，28t:培养24h;4t:下4000rpm离心20min，收集菌体；将收集的菌体置于灭菌的生理盐水中，pH7.2中，制成1.0X109cells/mL的菌悬液，0.5X甲醛28t:下灭活48h后为试验用疫苗，4t:储存；同时将灭活后的菌体接种于LB固体平板，置2『C下恒温培养24h、48h，确定无菌落长出。(3)浸泡免疫佐剂DTT、VD3、654-2，使用浓度分别为50mg/L、20mg/L、lmg/L。(4)疫苗使用浓度试验组中疫苗的有效浓度为1.OX108cells/mL。2试验方法(1)试验分组无佐剂疫苗浸泡免疫组、使用DTT、VD3、654-2佐剂组合+疫苗浸泡免疫组、浸泡空白对照组，每组设三个平行，每组3X40尾鱼。(2)免疫方法试验鱼暂养IO天后，浸泡免疫组用养殖用水配制疫苗达到浓度1.0X108cells/mL后将待免疫的鱼移入其中，浸泡8min;使用佐剂+浸泡疫苗免疫组用DTT溶液浸泡待免鱼lmin，之后加入疫苗及VD3维持2min，再加入654-2维持5min;浸泡空白对照只用海水浸泡，方法相同。(3)免疫后攻毒免疫30天后各组用点状气单胞菌攻毒，攻毒采用注射感染，剂量为5.0X107cells/尾。3试验结果攻毒15天后，统计各组的存活率，根据公式RPS=(1-免疫组死亡率对照组死亡率)X100X。计算免疫相当保护率。结果见表2表2.各免疫组免疫相对保护率统计<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实验结果表明，单纯用点状气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫罗非鱼，免疫相对保护率低仅为51.4%，使用DTT、VD3、654-2组合佐剂浸泡免疫组，浸泡免疫相对保护率提高到81.9%，效果提高了30%以上。表明使用组合佐剂后，对淡水鱼的浸泡免疫效果同样提高显权利要求一种鱼用浸泡疫苗组合佐剂，其特征在于上述的组合佐剂分别是二硫苏糖醇、维生素D3和消旋山莨菪碱的三种佐剂组合，其使用浓度分别为1-50mg/L、0.1-20mg/L和1-60mg/L。2.根据权利要求1所述的鱼用浸泡疫苗组合佐剂，其特征在于上述二硫苏糖醇和消旋山莨菪碱的纯度优于或相当于化学纯级。3.权利要求1所述的鱼用浸泡疫苗组合佐剂的使用方法，其特征在于(1)首先选用体表完好健康的待免疫鱼类，体重在每尾2g以上；(2)将待免疫的鱼移入浓度范围为l-50mg/L的二硫苏糖醇预处理液中浸泡l-20min，再向其中加入浓度范围为0.l-20mg/L的VD3与疫苗，待2-20min之后再向其中加入浓度范围为l-60mg/L的消旋山莨菪碱，待5-20min即完成浸泡免疫。4.利用权利要求1的浓度分别在l-50mg/L、0.l-20mg/L和l-60mg/L的二硫苏糖醇、维生素D3和消旋山莨菪碱免疫组合佐剂，应用于包括海水和淡水鱼类的浸泡疫苗中协同作用达到高效的免疫效果。全文摘要一种鱼用浸泡疫苗组合佐剂及其应用和使用方法，其特征在于该组合佐剂分别是二硫苏糖醇、维生素D3和消旋山莨菪碱的三种佐剂组合，其中二硫苏糖醇、维生素D3和消旋山莨菪碱的使用浓度分别为1－50mg/L、0.1－20mg/L和1－60mg/L，而应用于包括海水和淡水鱼类的浸泡疫苗中协同作用达到高效的免疫效果。使用时首先选用体重在每尾2g以上且体表完好的待免疫鱼类；将待免疫的鱼移入浓度范围为1-50mg/L的二硫苏糖醇预处理液中浸泡1-20min，再向其中加入浓度范围为0.1-20mg/L的VD3与疫苗浸泡2-20min，然后向其中加入浓度范围为1-60mg/L的消旋山莨菪碱浸泡5-20min即可。本发明显著提高疫苗的免疫效果，使用方法简便安全，成本低，无需额外设施与工序，且对鱼的存活率与生长速度无影响，对环境及操作人员同样无害。文档编号A61K39/39GK101791403SQ200910255828公开日2010年8月4日申请日期2009年12月31日优先权日2009年12月31日发明者王玉娟,王秀华,赵伟伟,黄倢申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所