本本发明涉及作物病害，具体提供大丽轮枝菌致病相关基因vdgh7a作为抗棉花黄萎病菌靶标基因的应用。
背景技术：
1、棉花是一种重要的天然纤维作物，作为战略物资在国民经济中的地位举足轻重。棉花黄萎病制约着棉花产量提高和品质改善，造成严重的经济损失，被称为棉花的“癌症”。大丽轮枝菌是引起棉花黄萎病的罪魁祸首。由于该病原菌有稳定的休眠结构微菌核，是维管束侵染病害，变异性强且与寄主协同进化，因此其致病机理十分复杂，病原菌与寄主互作机制仍不清楚，是有效防治该病的关键难题，而对病原真菌基因功能的研究是解决上述问题的关键之一。
2、为了抵抗病原菌的侵染，植物通过增强细胞壁和产生抗菌物质来阻止或减弱病原菌的侵染，但是许多病原菌已经成功破坏植物的物理防御，植物则形成了更为复杂的防御反应来抑制病原菌的进一步侵染。植物进化出了复杂的防御系统，通过感知病原菌的入侵并将信号传递给植物细胞，诱导植物免疫应答提出的“之字模型”对病原菌与植物在致病与抗病之间军备竞赛的动态平衡做出了系统阐释。
3、植物通过受体蛋白识别病原菌的病原相关分子模式，从而抵御病原菌的侵染；植物利用nbs-lrr类蛋白等抗性r蛋白特异性识别病原菌分泌的效应蛋白，从而激活更复杂的免疫反应。为了逃避或抑制免疫反应，病原菌则进化出更多样性的效应蛋白实现成功侵染植物。
4、效应蛋白在病原菌侵染寄主过程中发挥着重要的作用，大多数效应蛋白n端或c端具有保守基序，如rxlr、crn、cfem、rgd、deld、rywt或y/f/wxc等。大丽轮枝菌可分泌大量效应蛋白进入宿主细胞。寻找大丽轮枝菌的致病基因病干扰它的治病过程可以有效防治黄萎病的发生。
技术实现思路
1、本发明的目的在于：提供棉花黄萎病菌的致病相关基因及其在降低棉花黄萎病菌的致病性中的应用。
2、第一方面，本发明提供了核苷酸序列如seq id no.1所示的vdgh7a基因作为抗黄萎病菌靶标基因中的应用。
3、以及，核苷酸序列如seq id no.1所示的vdgh7a基因在降低棉花黄萎病菌致病性中的应用。
4、seq id no.1：atgaagaccaacttctctgccctcctggcccttttggccgccaaccgagctcttgcgcagcaggcctgtagcgttaccgaagagtgctcggcaggcggcagctgtgccgctcagaccggtagcctcgtcattgacgccaactggcgatggactcacaccgttgagggttacgacaactgttatgaaggcaactcctgggacagcaccctctgccccgatggcgacacttgcgcgcagaactgctgcgttgacggcgcggactacgagggaacctacggcgtcacctcgacggctgactcagtcactatcaagctggtcaccgagaacgagcatggtcgcaacgttggcgctcgcttgtatcttacagatggtggctctaagtaccagctcttcaacctcctcgggaacgagttcacctttgacgtggactcctccaacgtggactgtggtctcaacggtgcgctttacttcatctccatggatgcagatggtggccaaggcaagttccctggtaaccaggccggcgctaagtatggcactggatactgtgacgcccagtgtgcccgcgatctgaagtggattgacggtaccggtaatgttgagggctggcagccagtcggcgaatacgccccagatgtcggcactggtgacatgggcgcttgctgtgctgagatggatatgtgggaggccaacaaggcggccacgtcctatactcctcacccttgcgtcaacaacgcctaccattcctgctccggcgatagctgcggtggtaccttttctgcggatcggtatggcggcacttgcgacgctgatggctgcgacttcaaccctttccgccagggcaaccgagagttctacggagagggctctggcttcaccattgactccaccagcaaaatcaccgtcgtgacacagttcatcaatgagggacctggtggcgatctctcccagatccgccgcctctatgtccagaatggcgaggttatcggcaactccgagtcaactgcccctaacaacccgggcaacgccatcaccgacgaattctgcgctgcccaaaaggcggctttcggcgaggagcaggatcaattcaccgaattcggtggcttgtctcacatgggccaggctcttgatgccgggatggttctggccgtcagtctctggaccgacgcccacgccaacatgctctggctcgactcaacctaccccatcggagaaagcggctggggagccgagcggggaccctgcccgtccgagaaccgcacgcctcccgagatcgaggcccgtgttcccgatgcctcggtcactttctccaacatcaagttcggccccatcgggtccacgttcaccgagggtgaggttactcctcccggccccggtaaccctcctgttgccacgaccacaccttcgacacccgctcccacccaagctcccggcggccctattgctccccaatggggccagtgtggtggacaaggctggtccggcgccaccacttgcgtctctggtaccacctgcactgtcgtcaacgactggtaccaccagtgtctctag。
5、具体地，本发明通过构建vdgh7a敲除载体，利用农杆菌介导的转化将载体转入野生型菌株，得到基因缺失突变体δgh7a；在敲除突变体δgh7a中重新导入vdgh7a基因，获得回补突变体c-gh7a。
6、本发明对敲除突变体δgh7a和回补突变体c-gh7a的菌落形态、生长速率、应激反应以及致病力进行测定，并和野生型的各项指标进行比较分析。结果表明：敲除突变体δgh7a对渗透胁迫和细胞壁胁迫更加敏感。敲除突变体δgh7a在细胞壁胁迫cr干扰下生长明显受到抑制。敲除突变体δgh7a与野生型相比正常的营养生长受到严重干扰。在不同碳源(蔗糖、果胶、淀粉和纤维素)的培养基上生长速率也发生了变化，致病力测定结果表明，敲除突变体δgh7a的致病力也显著降低，棉株的病情指数仅为野生型的53％。因此，确定vdgh7a基因是棉花黄萎病菌致病相关基因，关联正常的营养生长，应激反应和致病性。而回补vdgh7a基因的回补突变体的上述性状得到恢复，再次证实上述功能。
7、在本发明所提供的应用中，vdgh7a基因编码的蛋白序列如seq id no.2所示。
8、seq id no.2：mktnfsallallaanralaqqacsvteecsaggscaaqtgslvidanwrwthtvegydncyegnswdstlcpdgdtcaqnccvdgadyegtygvtstadsvtiklvtenehgrnvgarlyltdggskyqlfnllgneftfdvdssnvdcglngalyfismdadggqgkfpgnqagakygtgycdaqcardlkwidgtgnvegwqpvgeyapdvgtgdmgaccaemdmweankaatsytphpcvnnayhscsgdscggtfsadryggtcdadgcdfnpfrqgnrefygegsgftidstskitvvtqfinegpggdlsqirrlyvqngevignsestapnnpgnaitdefcaaqkaafgeeqdqftefgglshmgqaldagmvlavslwtdahanmlwldstypigesgwgaergpcpsenrtppeiearvpdasvtfsnikfgpigstftegevtppgpgnppvatttpstpaptqapggpiapqwgqcggqgwsgattcvsgttctvvndwyhqcl。
9、在本发明所提供的应用中，敲除或弱化所述vdgh7a基因，使得棉花黄萎病菌中的vdgh7a基因表达水平降低。
10、第二方面，本发明提供一种大丽轮枝菌突变株，所述突变株通过敲除或弱化大丽轮枝菌中的vdgh7a基因获得，所述vdgh7a基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
11、在本发明所提供的大丽轮枝菌突变株的构建方法中，构建vdgh7a基因敲除载体，将vdgh7a基因敲除载体转入大丽轮枝菌中，得到vdgh7a基因的缺失突变体菌株。
12、在本发明所提供的大丽轮枝菌突变株的构建方法中，构建vdgh7a基因敲除载体所用的引物对如seq id no.7-8所示。
13、本发明提供了上述的大丽轮枝菌突变株在抗棉花黄萎病菌中的应用。
14、第三方面，本发明提供一种棉花黄萎病致病菌灭活的方法，包括：使棉花黄萎病菌的致病相关基因vdgh7a失活的步骤，所述棉花黄萎病菌的致病相关基因vdgh7a的核苷酸序列如seq id no.1所示。
15、本发明的有益效果在于：
16、本发明在大丽轮枝菌中鉴定了一个糖苷水解酶7家族(gh7)纤维素水解酶vdgh7a，它可以水解1,4-β-葡聚糖。利用atmt转化的方法获得敲除突变体δgh7a和回补突变体c-gh7a。结果发现vdgh7在大丽轮枝菌侵染棉花的过程中，增加了对渗透胁迫和细胞壁胁迫的敏感性，从而最终导致大丽轮枝菌对棉花的致病性下降。因此，本发明的vdgh7a基因是棉花黄萎病菌致病相关基因。
1.核苷酸序列如seq id no.1所示的vdgh7a基因作为抗黄萎病菌靶标基因中的应用。
2.核苷酸序列如seq id no.1所示的vdgh7a基因在降低棉花黄萎病菌致病性中的应用。
3.根据权利要求1-2任一项所述的应用，其特征在于，vdgh7a基因编码的蛋白序列如seq id no.2所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，敲除或弱化所述vdgh7a基因，使得棉花黄萎病菌中的vdgh7a基因表达水平降低。
5.一种大丽轮枝菌突变株，其特征在于，所述突变株通过敲除或弱化大丽轮枝菌中的vdgh7a基因获得，所述vdgh7a基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.权利要求5所述的大丽轮枝菌突变株的构建方法，其特征在于，构建vdgh7a基因敲除载体；将vdgh7a基因敲除载体转入大丽轮枝菌中，得到vdgh7a基因的缺失突变体菌株。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，构建vdgh7a基因敲除载体所用的引物对如seq id no.7-8所示。
8.权利要求5所述的大丽轮枝菌突变株在抗棉花黄萎病菌中的应用。
9.一种棉花黄萎病致病菌灭活的方法，其特征在于，包括：使棉花黄萎病菌的致病相关基因vdgh7a失活的步骤，所述棉花黄萎病菌的致病相关基因vdgh7a的核苷酸序列如seq idno.1所示。
