本发明涉及传感器，具体地，涉及一种三明治结构分子反应传感器的制备方法及应用。
背景技术：
1、对生物体的基因组进行深入解读，揭示基因的序列信息，是生命科学的重要课题。随着新兴技术的涌现，如单分子测序和数据科学和人工智能的整合，我们有望以更全面更精准的方式探索基因组的奥秘，推动科学研究和医学应用的进一步发展。纳米孔传感技术作为第三代测序技术，通过单分子测序和实时监测克服了第一、二代测序技术的短读长和扩增偏差等问题，其优点在于高分辨率、长读长、无需扩增，提高了测序速度和准确性。
2、纳米孔传感器的原理最初可以追溯到19世纪50年代库尔特计数器的发明和19世纪70年代的单通道电流记录技术，薄膜中纳米级尺度的通孔可用于检测单个分子，通过分子易位过孔产生的脉冲阻塞电流的幅值、持续时间得以分析单个分子的大小、形状、体积、数量、表面电荷密度和介电泳迁移率等信息。纳米孔已被证明可以探测dna和其他分子之间的化学相互作用，这些相互作用往往会极大地改变dna分子的结构。例如，寡核苷酸杂交探针与特定的dna靶序列结合，并产生凸起，当它们通过纳米孔时很容易检测到。应用这一原理，singer等研究人员绘制了长双链dna分子上靶序列的位置，wanunu等研究人员鉴定了不同的microrna。然而，要正确推断dna分子的结构是否发生改变，关键是要知道在化学相互作用发生之前该分子的结构是什么，而现有的纳米孔传感器只能实现单分子单次检测，无法有效检测分子间相互化学反应前后的变化。
3、中国发明专利cn105866398a公开了一种纳米笼结构的纳米通道，含有两个大小不等的纳米孔和一个中空腔体。然而，该纳米通道检测方法实际上只有通过小纳米孔时产生电流信号，这与常规的单纳米孔没有差别，根本没有办法进行分子相互化学反应前后独立检测。进一步，该纳米笼结构底部sin薄膜层的膜厚为200nm，该厚度完全不能用于检测小分子。除此之外，该纳米笼结构中间sio2夹层的厚度为500nm，厚度较大，如果将其作为分子反应传感器，其带来的后果是第一纳米孔检测的电流信号属于待测分子a，当待测分子b的速度快于待测分子a时，则待测分子b会首先到达第二纳米孔，导致双孔特征信号失真，该情况会在空腔厚度越大时越明显，而如果要控制空腔的厚度，则还需要考虑毛细力粘附效应，厚度越低，结构越不稳定，两层sin薄膜层的粘附概率也越大。
4、因此，需要构建一种能够发生至少两次检测以及允许分子间相互化学作用的分子反应传感器，即检测未发生化学相互作用的分子—分子间发生化学相互作用—检测已发生化学相互作用的分子，实现单分子检测三步走和单分子自校准检测。此外，对分子反应器的输入、输出进行可控筛选也十分重要。
技术实现思路
1、为克服现有技术中存在的上述缺陷与不足，本发明提供一种三明治结构分子反应传感器的制备方法及应用。
2、本发明的第一个目的是提供一种用于检测分子之间相互作用的三明治结构分子反应传感器。
3、本发明的第二个目的是提供一种用于检测分子之间相互作用的三明治结构分子反应传感器的制备方法。
4、本发明的第三个目的是提供一种检测分子之间相互作用的方法。
5、因此，本发明要求保护以下内容：
6、一种用于检测分子之间相互作用的三明治结构分子反应传感器，包括依次层叠的第一si3n4薄膜层、sio2薄膜层和第二si3n4薄膜层；
7、所述第一si3n4薄膜层、sio2薄膜层和第二si3n4薄膜层的厚度均为18～22nm；
8、所述第一si3n4薄膜层和第二si3n4薄膜层上分别设有第一通孔和第二通孔，所述第一通孔和第二通孔表面沉积有碳氢化合物层；
9、所述sio2薄膜层设有空腔，所述空腔的直径为所述第一通孔和所述第二通孔的直径的5～20倍；
10、所述第一通孔、空腔和第二通孔相连通，形成使待检测分子通过所述三明治结构分子反应传感器的通道。
11、优选地，所述第一si3n4薄膜层、sio2薄膜层和第二si3n4薄膜层的厚度均为20nm。
12、优选地，所述空腔的径向方向的直径为si3n4薄膜层上通孔的径向方向的直径的5～20倍。
13、优选地，所述第一通孔和第二通孔的孔径相同。
14、优选地，所述第一通孔、空腔和第二通孔的轴线位于同一直线。
15、一种用于检测分子之间相互作用的三明治结构分子反应传感器的制备方法，包括以下步骤：
16、s11.使用聚焦氦离子束轰击si3n4/sio2/si3n4薄膜芯片，形成纳米通孔，所述si3n4/sio2/si3n4薄膜芯片由第一si3n4薄膜层、sio2薄膜层和第二si3n4薄膜层依次层叠得到，所述第一si3n4薄膜层、sio2薄膜层和第二si3n4薄膜层的厚度均为18～22nm；
17、s12.将形成纳米通孔的si3n4/sio2/si3n4薄膜芯片置于刻蚀液中蚀刻sio2薄膜层，得到带空腔的器件；
18、s13.分别在第一si3n4薄膜层和第二si3n4薄膜层的纳米通孔处沉积碳氢化合物，形成第一通孔和第二通孔，即得；
19、所述空腔的直径为所述第一通孔和所述第二通孔的直径的5～20倍，所述第一通孔、空腔和第二通孔相连通，形成使待检测分子通过所述三明治结构分子反应传感器的通道。
20、优选地，步骤s11中，所述si3n4/sio2/si3n4薄膜芯片在进行聚焦氦离子束轰击前先进行预处理，所述预处理的方法为：将si3n4/sio2/si3n4薄膜芯片在食人鱼溶液中85～95℃加热25～35min。
21、更优选地，所述预处理的方法为：将si3n4/sio2/si3n4薄膜芯片在食人鱼溶液中90℃加热30min。
22、优选地，步骤s11中，所述第一si3n4薄膜层、sio2薄膜层和第二si3n4薄膜层的厚度均为20nm。
23、优选地，步骤s11中，所述聚焦氦离子束的剂量大于等于140nc/μm2。
24、最优选地，步骤s11中，所述聚焦氦离子束的剂量为140nc/μm2。
25、优选地，步骤s11中，所述聚焦氦离子束的加速电压为28～32kv，电流为7～9pa，氦气流量为1.8～2.2×10-6torr。
26、更优选地，步骤s11中，所述聚焦氦离子束的加速电压为30kv，电流为8pa，氦气流量为2×10-6torr。
27、优选地，步骤s12中，所属刻蚀液为缓冲氧化物蚀刻液。
28、优选地，步骤s12中，所述蚀刻时间小于等于100s。
29、优选地，步骤s13中，所述沉积碳氢化合物的方式为高能电子束诱导。
30、更优选地，所述高能电子束的辐照时间小于等于180s。
31、更优选地，步骤s13中，所述高能电子束的电压为1kv，电流为10μa，放大倍数为150000。
32、优选地，所述空腔的径向方向的直径为si3n4薄膜层上通孔的径向方向的直径的5～20倍。
33、优选地，所述第一通孔和第二通孔的孔径相同。
34、优选地，所述第一通孔、空腔和第二通孔的轴线位于同一直线。
35、上述的制备方法制备得到的三明治结构分子反应传感器。
36、一种检测分子之间相互作用的方法，包括以下步骤：
37、s21.将任一上述的三明治结构分子反应传感器置于液池腔室内，使所述液池腔室被所述三明治结构分子反应传感器分隔成靠近第一si3n4薄膜层的第一腔室和靠近第二si3n4薄膜层的第二腔室；
38、分别向第一腔室和第二腔室注入电解液，使所述第一腔室的电解液和所述第二腔室的电解液分别连接电源的正极和负极，形成trans池和cis池；
39、s22.在液池中加入待测分子a，在电压的作用下使待测分子a依次从所述第一通孔、空腔、第二通孔通过所述三明治结构分子反应传感器，采集待测分子a的过孔阻塞电流信号，换算待测分子a的分子体积；
40、s22.在液池中加入待测分子b，在电压的作用下使待测分子b依次从所述第一通孔、空腔、第二通孔通过所述三明治结构分子反应传感器，采集待测分子b的过孔阻塞电流信号，换算待测分子b的分子体积；
41、s24.在液池中同时加入待测分子a和待测分子b的混合物，在电压的作用下使混合物依次从所述第一通孔、空腔、第二通孔通过所述三明治结构分子反应传感器，采集混合物的过孔阻塞电流信号，通过混合物的阻塞电流信号幅值的变化分析待测分子a和待测分子b的相互作用情况；
42、所述待测分子a和/待测分子b分别为蛋白质分子或核酸分子中的一种或两种。
43、优选地，步骤s21和s22中，所述换算为利用公式①进行换算，其中△i为过孔阻塞电流，vexclude为待测分子的分子体积，h2eff为所述第一通孔和所述第二通孔的厚度，σ为电解液的电导率，为电压；
44、
45、作为一种可实施的方式，步骤s21中，所述电解液为由ph为7.4的1×pbs配制得到的0.1m kcl溶液。
46、作为一种可实施的方式，所述检测分子之间相互作用为检测hiv包膜糖蛋白gp120和抗gp120抗体的相互作用、检测β-人绒毛膜促性腺激素和igg的相互作用、检测前列腺特异性抗原psa和抗psa抗体的相互作用、检测肿瘤标志物甲胎蛋白afp和抗afp抗体的相互作用、检测蛋白质受体和ssdna配体的相互作用。
47、作为一种可实施的方式，所述检测分子之间相互作用为检测靶dna与探针dna的相互作用。
48、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
49、本发明公开了一种三明治结构分子反应传感器的制备方法及应用。本发明首先使用聚焦氦离子束铣削si3n4/sio2/si3n4薄膜芯片表面得到纳米通孔，然后用缓冲氧化物蚀刻剂蚀刻sio2薄膜层，最后用高能电子束在两层si3n4薄膜的纳米通孔处诱导沉积碳氢化合物，使得第一层和第三层si3n4薄膜的纳米通孔缩小至合适尺寸，并使用基于上述方法制备得到的分子反应传感器检测分子间的相互作用。通过本发明的制备方法可制备出适用于不同体积分子的孔-腔-孔三明治结构分子反应传感器，该分子反应传感器可实时记录不同体积分子间相互化学作用，为深入理解dna水平的生物学过程和疾病机制提供了有力工具。
1.一种用于检测分子之间相互作用的三明治结构分子反应传感器，其特征在于，包括依次层叠的第一si3n4薄膜层、sio2薄膜层和第二si3n4薄膜层；
2.一种用于检测分子之间相互作用的三明治结构分子反应传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s11中，所述si3n4/sio2/si3n4薄膜芯片在进行聚焦氦离子束轰击前先进行预处理，所述预处理的方法为：将si3n4/sio2/si3n4薄膜芯片在食人鱼溶液中85～95℃加热25～35min。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s11中，所述聚焦氦离子束的剂量大于等于140nc/μm2。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s12中，所属刻蚀液为缓冲氧化物蚀刻液。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s12中，所述蚀刻时间小于等于100s。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s13中，所述沉积碳氢化合物的方式为高能电子束诱导。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述高能电子束的辐照时间小于等于180s。
9.权利要求2～8任一所述的制备方法制备得到的三明治结构分子反应传感器。
10.一种检测分子之间相互作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
