背景技术：
1、癌症仍然是世界上主要的死亡原因之一。最近的研究已经表明，全世界估计有1270万癌症病例。预计到2030年，这一数字将增加到2100万(vinay和kwon 2014)。
2、cd137(4-1bb，tnfrs9)是属于tnf受体超家族的1型跨膜糖蛋白。它最初是由kwon等人(1989)从激活的鼠t细胞的cdna中克隆的。随后显示其具有在t细胞、b细胞、nk和nk t细胞、树突细胞(dc)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上发现的广泛的免疫细胞表达模式。还已经报道了在非造血细胞，例如上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞上以及在肿瘤细胞系上的表达。cd137表达主要是激活诱导的，尽管已经在一些细胞类型包括treg和dc’s上证明了低水平的组成型表达。。
3、255个氨基酸的人cd137蛋白(genbank登录号np_001552)由17个氨基酸的信号肽序列，含有四个富半胱氨酸结构域的细胞外区域，27个氨基酸的跨膜区域和短的42个氨基酸的细胞内结构域组成。它作为单体和二聚体同时存在于细胞表面。cd137的主要配体是cd137配体(cd137l，4-1bb-l，tnfs9)，尽管与促进受体聚集的半乳凝素-9(madireddi等，2014)和诸如纤连蛋白的基质蛋白(chalupny等，1992)具有相互作用也已经被报道。cd137配体主要在激活的抗原呈递细胞如树突状细胞、b细胞和巨噬细胞上表达。
4、三聚体cd137配体与cd137的相互作用导致受体簇集和信号传导分子(例如蛋白质的traf家族)的招募，导致激酶调节和nfkb途径的激活。因此，cd137的簇集对于下游信号传导的启动和调节至关重要。
5、使用激动剂抗cd137单克隆抗体进行的体外和体内研究已经表明，激活后cd137迅速内化到称为“信号小体”的内体区室中，并从中保持信号传导(在sanchez-paulete等2016中进行了综述)。
6、共刺激性tnfr家族成员(例如cd137、cd27、ox40(cd134)、hvem、cd30和gitr)参与维持初始t细胞激活后的t细胞应答。在cd4+和cd8+t细胞中，cd137充当调节t细胞受体(tcr)介导的信号传导的共刺激受体。cd137的连接以及tcr激活可通过诱导抗凋亡超大b细胞淋巴瘤(anti-apoptotic b-cell lymphoma-extra large)(bcl-xl)和b细胞淋巴瘤2(bcl-2)途径来促进增殖、细胞因子产生并抑制细胞凋亡。已显示nk细胞上cd137的交联可刺激ifn-γ的分泌和增殖。树突状细胞对cd137刺激的应答包括增强的成熟和抗原呈递以及细胞因子il-6、il12和il-27以及诸如吲哚胺-2,3-双加氧酶(ido)的酶的分泌，其能够调节t细胞功能。cd137还能够上调肿瘤血管内皮细胞上的细胞间粘附分子1(icam1)和血管细胞粘附分子1(vcam1)，从而诱导效应细胞迁移并在肿瘤微环境中保留激活的t细胞。
7、通过抗cd137抗体的cd137的交联已显示在许多模型(包括肉瘤、肥大细胞瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤、骨髓瘤和肝细胞癌)中具有有效的体内抗肿瘤作用。cd8+细胞耗竭研究已表明，这种作用主要涉及细胞溶解性t细胞的扩增和浸润，从而导致肿瘤细胞溶解。然而，在一些肿瘤模型中，已经报道了其他类型的细胞，如dc、nk细胞或cd4+t细胞的贡献。此外，已经显示抗cd137疗法触发免疫记忆应答并抑制自身免疫反应(综述于vinay等2012)。
8、已经显示，现有的激动疗法导致全身性cd137效应，从而导致不良副作用。cd137信号传导的激活与小鼠模型中的严重毒性有关。完全人igg4抗cd137激动性抗体(bms-663513)的临床试验报告了中性粒细胞减少症、升高的肝酶以及高剂量时的严重肝毒性，导致试验终止。对于完全人igg2(pf-05082566)尚未观察到这种严重的毒性，临床试验中无论是作为单一疗法还是联合疗法也是这样。
9、已经显示靶向共刺激性tnfr的激动性抗体需要fcγrs的接合(bulliard等)。因此，经由fcγrs的非靶向簇集可影响激动性抗体作用于这些靶标的机制。
10、鉴于现有疗法观察到的毒性概况，需要基于使用具有降低的毒性的备选的cd137结合分子的备选癌症疗法。特别地，临床上需要有效地与细胞表面上的cd137接合并具有降低的毒性(包括肝毒性)的靶向cd137激动剂。
11、前列腺癌是发达国家男性中最常见的非皮肤相关性恶性肿瘤。据估计，六分之一的男性将被诊断患有前列腺癌。
12、前列腺癌的当前治疗包括手术、放射线治疗和辅助激素疗法。虽然这些疗法在疾病的早期阶段相对有效，但最初诊断为局限性前列腺癌的大多数患者最终复发。虽然化疗是对抗晚期前列腺癌最广泛使用的方法之一，但由于缺乏特异性和相关毒性，其疗效通常不足。缺乏针对前列腺癌细胞的靶向递送是实现可行治疗效果的主要障碍之一。因此，对于增加抗前列腺癌剂的选择性的策略仍然存在迫切需求(barve等)。
13、在使用基于血清的标志物(例如前列腺特异性抗原(psa))之后，前列腺癌的诊断已经大大改善。此外，前列腺肿瘤相关抗原为肿瘤成像、诊断和靶向治疗提供了靶点。前列腺特异性膜抗原(psma)(是一种前列腺肿瘤相关标志物)就是这样一种靶标。
14、psma是一种高度限制于前列腺分泌上皮细胞膜的750个残基的ii型跨膜糖蛋白。它在前列腺癌细胞中和非前列腺实体瘤新血管系统中高度表达，并在其他组织(包括健康的前列腺、肾、肝、小肠和脑)中表达较低。psma表达随着前列腺疾病进展和转移而增加，并且其表达水平因此与肿瘤侵袭性相关。各种免疫组织学研究已经表明，与良性前列腺上皮细胞中的psma水平相比，在几乎所有前列腺癌病例中psma水平均增加。在疾病(包括前列腺上皮内瘤变，晚期雄激素非依赖性前列腺癌和局限于淋巴结、骨、软组织和肺的继发性前列腺肿瘤)的所有阶段均可发现强烈的psma染色。因此psma被广泛用作前列腺癌细胞的生物标志物。
15、psma具有3部分结构：19个氨基酸的内部部分、24个氨基酸的跨膜部分和707个氨基酸的外部部分。它基于其处理神经肽n-乙酰天冬氨酰谷氨酸盐和谷氨酸缀合的叶酸衍生物的能力而形成具有谷氨酸羧肽酶活性的非共价同二聚体。psma通过内吞途径快速有效地内化，并迅速再循环到膜上。
16、本发明满足了对用于治疗癌症的基于抗体的备选疗法的需求。
技术实现思路
0、发明概述
1、本发明涉及对cd137和psma都具有特异性的新型结合分子。发明人已经鉴定了结合至cd137并抑制cd137l与cd137结合的单可变重链结构域抗体。当以单特异性形式(即不与结合第二靶标的另一部分连接)与cd137结合时，它们不会引起cd137信号传导。然而，当与结合肿瘤特异性抗原的部分连接时，所述单可变重链结构域抗体引发cd137信号传导。因此，尽管结合cd137的单可变重链结构域抗体在没有靶向第二抗原的结合配偶体的情况下结合cd137时不诱导受体的簇集并且不具有激动活性，但双特异性分子中cd137和肿瘤特异性抗原的双重接合导致cd137激动。因此，结合至cd137的单可变重链结构域抗体能够用作同时接合cd137和psma的多特异性结合分子中的亚基。
2、本文所述的双特异性和多特异性分子与cd137和psma结合并同时与两个靶标接合。这种双重接合导致cd137激活，从而将作用位点限制在肿瘤微环境上，并可能最小化现有cd137治疗的不良作用。
3、在一个方面，提供分离的结合分子，其包含以下或由以下组成：
4、a)结合至cd137的单可变重链结构域抗体和
5、b)结合至psma的部分。
6、在一个实施方案中，所述结合至cd137的单可变重链结构域抗体包含含有seq idno.1或与其具有至少40％同源性的序列的cdr1、含有seq id no.2或与其具有至少40％同源性的序列的cdr2和含有seq id no.3或与其具有至少40％同源性的序列的cdr3，或含有seq id no.425或与其具有至少40％同源性的序列的cdr1、含有seq id no.426或与其具有40％同源性的序列的cdr2和含有seq id no.427或与其具有至少40％同源性的序列的cdr3。
7、在一个实施方案中，所述结合至cd137的单可变重链结构域抗体包含人构架区。
8、在一个实施方案中，所述结合至cd137的单可变重链结构域抗体包含如表2或3中列出的全长序列或与其具有至少75％同源性的序列。
9、在一个实施方案中，所述结合至cd137的单可变重链结构域抗体包含以下序列之一或由其组成：seq id no.4、312、428、852、856、860、864、868、872、876或880或与其具有至少50％同源性的序列。
10、在一个实施方案中，结合至psma的部分选自抗体、抗体片段、抗体模拟物、模拟cd137的天然配体的蛋白质或其他多肽。
11、在一个实施方案中，所述抗体片段选自fab、f(ab')2、fv、单链fv片段(scfv)、单结构域抗体或其片段。
12、在一个实施方案中，所述单结构域抗体是单vh结构域抗体。
13、在一个实施方案中，所述单vh结构域抗体包含含有seq id no.812或与其具有至少75％同源性的序列的cdr1、含有seq id no.813或与其具有至少75％同源性的序列的cdr2和含有seq id no.814或与其具有至少75％同源性的序列的cdr3，或其中所述vh单结构域抗体包含含有seq id no.837或与其具有至少75％同源性的序列的cdr1、含有seq idno.838或与其具有75％同源性的序列的cdr2和含有seq id no.839或与其具有至少75％同源性的序列的cdr3。
14、在一个实施方案中，所述结合至psma的单可变重链结构域抗体包含如表6或7中列出的全长序列或与其具有至少50％同源性的序列。
15、在一个实施方案中，所述结合至psma的单可变重链结构域抗体包含seq idno.815、816、817、818、819、820、821、822、823,824、825或840或与其具有至少50％同源性的序列。
16、在一个实施方案中，具有seq id no.4、312、852、856、860、864、868、872、876、880或428之一或变体t(例如具有1至10个或1至20个氨基酸置换的分子)的单结构域抗体1.1或2.1分别与具有seq id no.815、822或840的单结构域抗体3.1、3.8或4.1连接。
17、在一个实施方案中，分离的结合分子能够以约至少约10-6m，备选地至少约10-7m，备选地至少约10-8m，备选地至少约10-9m，备选地至少约10-10m，备选地至少约10-11m，备选地至少约10-12m的kd的亲和力，或者更大的亲和力结合cd137。
18、在一个实施方案中，分离的结合分子能够以约至少约10-6m，备选地至少约10-7m，备选地至少约10-8m，备选地至少约10-9m，备选地至少约10-10m，备选地至少约10-11m，备选地至少约10-12m的kd的亲和力，或者更大的亲和力结合psma。
19、在一个实施方案中，所述结合至cd137的单可变重链结构域抗体通过肽接头与所述结合至psma的部分连接。
20、在一个实施方案中，所述接头选自(g4s)n接头，其中n为1至10。
21、本发明的分离的结合分子可包含与结合至psma的部分连接的结合至cd137的单可变重链结构域抗体。在一个实施方案中，分离的结合分子与毒素、酶、放射性同位素、半衰期延长部分、标记物、治疗性分子或其他化学部分缀合。
22、在一个实施方案中，所述半衰期延长部分选自由以下各项组成的组：白蛋白结合部分、转铁蛋白结合部分、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白的片段，和结合至人血清白蛋白的白蛋白结合肽或单结构域抗体。
23、通常，当作为单特异性实体结合至cd137时，所述结合至人cd137单可变重链结构域抗体不引起cd137信号传导。
24、在一个实施方案中，所述结合至人cd137的单可变重链结构域抗体是从表达包含人v、d和j区的转基因的转基因啮齿动物获得或可获得的。
25、在一个实施方案中，所述啮齿动物(例如小鼠)不产生功能性内源性轻链和重链。
26、还提供药物组合物，其包含本文所述的结合分子，例如本文所述的单可变重链结构域抗体，和药物载体。
27、还提供本文所述的结合分子或药物组合物，其用于治疗疾病(例如癌症、前列腺癌或psma阳性肿瘤)。
28、还提供用于治疗癌症的方法，其包括施用治疗有效量的本文所述的结合分子或药物组合物。
29、在一个实施方案中，所述癌症是前列腺癌、肺癌、成胶质细胞瘤、肾癌、膀胱癌、睾丸癌、神经内分泌癌、结肠癌和乳腺癌。
30、还提供核酸分子，其包含编码如本文所述的结合分子的核酸序列。
31、还提供包含本文描述的核酸分子的载体。
32、还提供包含本文所述的核酸分子或载体的宿主细胞。
33、在一个实施方案中，所述宿主细胞是细菌、酵母、病毒、植物或哺乳动物细胞。
34、还提供用于产生本文所述的结合分子的方法，其包括在宿主细胞中表达编码所述结合分子的核酸，并从宿主细胞中分离所述结合分子。
35、还提供用于促进cd8+t细胞扩增、诱导细胞毒性t淋巴细胞(ctl)激活和/或细胞因子释放的方法，所述方法包括施用如本文所述的结合分子或药物组合物。
36、还提供用于降低人psma活性的体内或体外方法，其包括使人psma与如上所述的结合分子接触。
37、还提供试剂盒，其包含如本文所述的结合分子或如本文所述的药物组合物。
38、还提供如上所述的结合分子或药物组合物在激活(例如同时激活)cd137和psma的下游信号传导途径中的用途。
39、还提供用于激活(例如同时激活)cd137和psma的下游信号传导途径的方法，其包括施用本文所述的结合分子或药物组合物。
40、还提供用于cd137和psma双重接合的方法，其包括施用本文所述的结合分子或药物组合物。
41、还提供本文所述的结合分子或药物组合物在psma阳性肿瘤细胞或组织附近诱导局部t细胞应答中的用途。
42、还提供在psma阳性肿瘤细胞或组织附近诱导局部t细胞应答的方法，包括施用根据本文所述的结合分子或药物组合物。
1.分离的结合分子，其包含
2.根据权利要求1所述的分离的结合分子，其中所述结合至cd137的单可变重链结构域抗体包含含有seq id no.1或与其具有至少40％同源性的序列的cdr1、含有seq id no.2或与其具有至少40％同源性的序列的cdr2和含有seq id no.3或与其具有至少40％同源性的序列的cdr3，或含有seq id no.425或与其具有至少40％同源性的序列的cdr1、含有seq idno.426或与其具有40％同源性的序列的cdr2和含有seq id no.427或与其具有至少40％同源性的序列或与其具有至少40％同源性的序列的cdr3或含有seq id no.427或与其具有至少75％同源性的序列的cdr3。
3.根据权利要求2所述的分离的结合分子，其中所述结合至cd137的单可变重链结构域抗体包含人构架区。
4.根据前述权利要求所述的分离的结合分子，其中所述结合至cd137的单可变重链结构域抗体包含如表2或3中列出的全长序列或与其具有至少75％同源性的序列。
5.根据前述权利要求所述的分离的结合分子，其中所述结合至cd137的单可变重链结构域抗体包含seq id no.4、312、852、856、860、864、868、872、876、880或428或与其具有至少75％同源性的序列。
6.根据前述权利要求所述的分离的结合分子，其中所述结合至psma的部分选自抗体、抗体片段、抗体模拟物或其他多肽。
7.根据权利要求6所述的分离的结合分子，其中所述抗体片段选自fab、f(ab')2、fv、单链fv片段(scfv)、单结构域抗体或其片段。
8.根据权利要求7所述的分离的结合分子，其中所述单结构域抗体是vh单结构域抗体。
9.根据权利要求8所述的分离的结合分子，其中所述vh单结构域抗体包含含有seq idno.812或与其具有至少75％同源性的序列的cdr1、含有seq id no.813或与其具有至少75％同源性的序列的cdr2和含有seq id no.814或与其具有至少75％同源性的序列的cdr3，或其中所述vh单结构域抗体包含含有seq id no.837或与其具有至少75％同源性的序列的cdr1、含有seq id no.838或与其具有75％同源性的序列的cdr2和含有seq idno.839或与其具有至少75％同源性的序列的cdr3。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中所述结合至psma的单可变重链结构域抗体包含表6或7中列出的全长序列或与其具有至少75％同源性的序列。
11.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中所述结合至psma的单可变重链结构域抗体包含seq id no.815、816、817、818、819、820、821、822、823,824、825或840或与其具有至少75％同源性的序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中具有seq id no.4或428的单结构域抗体1.1或2.1，或具有seq id no 312、852、856、860、864、868、872或876或与其具有至少75％序列同源性的单结构域抗体，分别连接至具有seq id no.815、822或840的单结构域抗体3.1、3.8或4.1。
13.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其能够以至少约10-6m至约10-12m的kd的亲和力结合cd137。
14.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其能够以约10-6m至约10-12m的kd的亲和力结合psma。
15.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中所述结合至cd137的单可变重链结构域抗体通过肽接头与所述结合至psma的部分连接。
16.根据权利要求15所述的结合分子，其中所述接头选自(g4s)n接头，其中n是选自1至10的整数。
17.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其缀合至选自毒素、酶、放射性同位素、半衰期延长部分、标记物、治疗分子和其他化学部分中的一种或更多种的部分。
18.根据权利要求17所述的结合分子，其中所述半衰期延长部分选自由以下各项组成的组：白蛋白结合部分、转铁蛋白结合部分、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白的片段，和结合人血清白蛋白的白蛋白结合肽和单结构域抗体。
19.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中当作为单特异性实体结合至cd137时，结合至人cd137的单可变重链结构域抗体不引起cd137信号传导。
20.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子，其中结合至人cd137的单可变重链结构域抗体是从表达包含人v、d和j区的转基因的转基因啮齿动物获得或可获得的。
21.根据权利要求20所述的单可变重链结构域抗体，其中所述啮齿动物不产生功能性内源性轻链和重链。
22.药物组合物，其包含根据前述权利要求所述的结合分子和药物载体。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求23所述的药物组合物，用于治疗疾病。
24.根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述疾病是癌症。
25.治疗前列腺癌或前列腺病症的方法，其包括施用治疗有效量的根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物。
26.根据权利要求24所述的结合分子或根据权利要求25所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌、肺癌、成胶质细胞瘤、肾癌、膀胱癌、睾丸癌、神经内分泌癌、结肠癌和乳腺癌。
27.核酸分子，其包含编码根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子的核酸序列。
28.包含根据权利要求27所述的核酸分子的载体。
29.宿主细胞，其包含根据权利要求27所述的核酸分子或根据权利要求28所述的载体。
30.根据权利要求29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌、酵母、病毒或哺乳动物细胞。
31.产生根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子的方法，其包括在宿主细胞中表达编码所述结合分子的核酸，并从所述宿主细胞中分离所述结合分子。
32.用于促进cd8+t细胞扩增、诱导细胞毒性t淋巴细胞(ctl)激活和/或细胞因子释放的方法，所述方法包括施用根据权利要求1至21中任一项的所述结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物。
33.用于降低人psma活性的体内或体外方法，其包括使人psma与根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子接触。
34.试剂盒，其包含根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物。
35.根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物在同时激活cd137和psma的下游信号传导途径中的用途。
36.共刺激cd137和psma的下游信号传导途径的方法，其包括施用根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物。
37.根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物在psma阳性肿瘤细胞或组织附近诱导局部t细胞应答中的用途。
38.在psma阳性肿瘤细胞或组织附近诱导局部t细胞应答的方法，包括施用根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物。
