本发明属于植物基因工程育种，具体涉及一种用于巴戟天建立毛状根遗传的转化体系及转化方法。
背景技术：
1、巴戟天(morinda officinalis how.)为茜草科巴戟天属的藤本植物，是我国四大南药之一，产于广东、福建、广西、海南和四川等南方地区。巴戟天以肉质根入药，其主要成分有：糖类、蒽醌类、环烯醚萜苷类、有机酸类、微量元素、氨基酸和甾醇类等。巴戟天在传统中医中已经使用了数千年，由于其具有补肾壮阳、强筋健骨、祛风湿、固精髓等功效，故被用于治疗肾脏疾病、阳痿、风湿、疼痛、抑郁和炎症等疾病。
2、但巴戟天易感染枯萎病，自然繁殖能力低且存在生长年限长、品种良莠不齐等问题，其遗传转化体系也尚未建立，严重阻碍了巴戟天的生物学价值开发。以植物组织培养技术为基础，建立巴戟天的遗传转化体系，可以精准地针对重要生物活性成分，定向改良巴戟天的遗传性状，对深入其功能基因组学的研究和提高药用价值具有重要的意义。
3、然而，在巴戟天遗传转化体系建立方面，目前有关发根农杆菌建立巴戟天毛状根遗传转化体系，培育出转基因发根系的研究还鲜有报道。因此通过建立发根农杆菌转化农杆菌的遗传转化体系，培育出具有优良性状的巴戟天发根系，在推进药用巴戟天的遗传育种进程方面具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明就是开发了一种用于巴戟天建立毛状根遗传的转化体系及转化方法，基于该转化体系的转化方法可以快速诱导巴戟天产生转基因毛状根，方法简单便捷。
2、为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：
3、本发明一方面提供了一种用于巴戟天建立毛状根遗传的转化体系，包括：
4、预培养培养基，用于巴戟天外植体预培养；
5、农杆菌侵染液，用于辅助农杆菌浸染巴戟天外植体；
6、共培养培养基，用于农杆菌浸染后的巴戟天外植体共培养；
7、抑菌培养基，用于巴戟天外植体共培养后的无菌培养；
8、抗性筛选培养基，用于巴戟天转基因毛状根抗性筛选。
9、需要说明的是，本发明中结合发根农杆菌操作简单、成本低的优点，以gfp基因作为报告基因以及普通pcr的手段快速验证转基因植株，发现本发明中的转化体系有效提高巴戟天的毛状根诱导效率。
10、优选地，上述转化体系可以包括：
11、预培养培养基包括：ms培养基基盐、蔗糖和琼脂粉；和/或
12、农杆菌侵染液包括：ms培养基基盐、蔗糖和乙酰丁香酮；和/或
13、共培养培养基包括：ms培养基基盐、蔗糖、琼脂粉和乙酰丁香酮；和/或
14、抑菌培养基包括：ms培养基基盐、蔗糖、琼脂粉和特美汀；和/或
15、抗性筛选培养基包括：ms培养基基盐、蔗糖、琼脂粉、特美汀和潮霉素。
16、优选地，上述转化体系可以包括：
17、预培养培养基包括：2g/l-2.4g/l ms培养基基盐、28g/l-32g/l蔗糖和4.8g/l-5.2g/l琼脂粉，ph＝5.6-6；和/或
18、农杆菌侵染液包括：4.2g/l-4.6g/lms培养基基盐、28g/l-32g/l蔗糖和18mg/l-22mg/l乙酰丁香酮，ph＝5.6-6；和/或
19、共培养培养基包括：2g/l-2.4g/l ms培养基基盐、28g/l-32g/l蔗糖、4.8g/l-5.2g/l琼脂粉、18mg/l-22mg/l乙酰丁香酮，ph＝5.6-6；和/或
20、抑菌培养基包括：2g/l-2.4g/l ms培养基基盐、28g/l-32g/l蔗糖、4.8g/l-5.2g/l琼脂粉、198mg/l-202mg/l特美汀，ph＝5.6-6；和/或
21、抗性筛选培养基包括：2g/l-2.4g/l ms培养基基盐、28g/l-32g/l蔗糖、4.8g/l-5.2g/l琼脂粉、198mg/l-202mg/l特美汀、5.8mg/l-6.2mg/l潮霉素，ph＝5.6-6。
22、更优选地，上述转化体系可以包括：
23、预培养培养基包括：2.2g/l ms培养基基盐、30g/l蔗糖和5.0g/l琼脂粉，ph＝5.8；和/或
24、农杆菌侵染液包括：4.4g/l ms培养基基盐、30g/l蔗糖和20mg/l乙酰丁香酮，ph＝5.8；和/或
25、共培养培养基包括：2.2g/l ms培养基基盐、30g/l蔗糖、5.0g/l琼脂粉、20mg/l乙酰丁香酮，ph＝5.8；和/或
26、抑菌培养基包括：2.2g/l ms培养基基盐、30g/l蔗糖、5.0g/l琼脂粉、200mg/l特美汀，ph＝5.8；和/或
27、抗性筛选培养基包括：2.2g/l ms培养基基盐、30g/l蔗糖、5.0g/l琼脂粉、200mg/l特美汀、6mg/l潮霉素，ph＝5.8。
28、本发明另一方面提供一种巴戟天建立毛状根遗传的转化方法，其包括使用本发明中的转化体系进行转化，包括：
29、(1)使用预培养培养基预培养巴戟天外植体；将含有目的基因的农杆菌使用农杆菌侵染液重悬得菌液；
30、(2)将菌液浸染预培养后的巴戟天外植体，而后使用共培养培养基进行共培养；
31、(3)将共培养后的巴戟天外植体使用抑菌培养基培养直至长出毛状根；
32、(4)将毛状根在抗性筛选培养基培养进一步筛选出毛状根发根系。
33、优选地，上述转化方法中可以将步骤(2)中使用共培养培养基进行共培养后的巴戟天外植体进行洗涤，并用含特美汀的无菌水中浸泡处理后再使用抑菌培养基进行培养。
34、优选地，上述含特美汀的无菌水中，特美汀的浓度可以为200mg/l；和/或浸泡处理包括浸泡10min-15min，比如11min、13min或14min等。
35、需要说明的是，进行浸泡处理的目的是洗涤农杆菌，在洗涤后尅使用无菌滤纸吸干水分。
36、需要说明的是，步骤(4)中，鉴定为阳性的毛状根从基部切取，再转接至抗性筛选培养基中。
37、优选地，上述转化方法包括以下条件中的一种或多种：(a)步骤(1)中，巴戟天外植体来自巴戟天茎段；(b)步骤(1)中，巴戟天外植体来自巴戟天茎段，巴戟天茎段长度为1cm-2cm；(c)步骤(1)中，预培养包括黑暗条件下培养2d-4d；(d)步骤(2)中，浸染时间为20min；(e)步骤(2)中，共培养包括黑暗条件下培养2d；(f)步骤(3)中，培养包括黑暗条件下培养7d；(g)步骤(3)中，每隔一周更换一次抑菌培养基，时间2-4周。
38、需要说明的是，步骤(3)中，2-4周是总培养时间，7d是一次培养时间。
39、优选地，上述转化方法的步骤(1)中，含有目的基因的农杆菌使用农杆菌侵染液重悬得菌液的方法包括：将含有目的基因的载体导入农杆菌中得到含有目的基因的农杆菌，得到的工程菌株继续培养，离心收集菌体后，用农杆菌侵染液进行重悬得菌液；其中，继续培养包括：置于含卡那霉素和链霉素的ty液体培养基，于28℃振荡培养1d-2d；将菌液转移至含卡那霉素和链霉素的ty液体培养基进行扩大培养，至od600值为0.5-0.8；离心包括：4000rpm-6000rpm，时间5min。
40、需要说明的是，上述的离心转速不能过高或过低，转速过高会损伤菌株，转速过低会导致离心不彻底，低转速则需要离心更长时间。另外，
41、本发明再一方面提供一种本发明中的转化体系或本发明中的转化方法在巴戟天遗传育种中的应用。
42、本发明有益效果至少包括：与现有技术相比，本发明公开提供的用于巴戟天建立毛状根遗传的转化体系及转化方法可以快速诱导巴戟天产生转基因毛状根，方法简单便捷，且本发明进行了抗性筛选与荧光鉴定，为巴戟天遗传转化与基因功能研究提供良好的技术支持。
1.用于巴戟天建立毛状根遗传的转化体系，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的用于巴戟天建立毛状根遗传的转化体系，其特征在于，包括：
3.根据权利要求2所述的用于巴戟天建立毛状根遗传的转化体系，其特征在于，包括：
4.根据权利要求2所述的所述的用于巴戟天建立毛状根遗传的转化体系，其特征在于，包括：
5.巴戟天建立毛状根遗传的转化方法，其特征在于，包括使用权利要求1至4中任一项权利要求所述的转化体系进行转化，包括：
6.根据权利要求5所述的转化方法，其特征在于，将步骤(2)中使用共培养培养基进行共培养后的巴戟天外植体进行洗涤，并用含特美汀的无菌水中浸泡处理后再使用抑菌培养基进行培养。
7.根据权利要求6所述的转化方法，其特征在于，含特美汀的无菌水中，特美汀的浓度为200mg/l；和/或浸泡处理包括浸泡10min-15min。
8.根据权利要求5至7中任一项权利要求所述的转化方法，其特征在于，转化方法包括以下条件中的一种或多种：(a)步骤(1)中，巴戟天外植体来自巴戟天茎段；(b)步骤(1)中，巴戟天外植体来自巴戟天茎段，巴戟天茎段长度为1cm-2cm；(c)步骤(1)中，预培养包括黑暗条件下培养2d-4d；(d)步骤(2)中，浸染时间为20min；(e)步骤(2)中，共培养包括黑暗条件下培养2d；(f)步骤(3)中，培养包括黑暗条件下培养7d；(g)步骤(3)中，每隔一周更换一次抑菌培养基，时间2-4周。
9.根据权利要求5至7中任一项权利要求所述的转化方法，其特征在于，步骤(1)中，含有目的基因的农杆菌使用农杆菌侵染液重悬得菌液的方法包括：将含有目的基因的载体导入农杆菌中得到含有目的基因的农杆菌，得到的工程菌株继续培养，离心收集菌体后，用农杆菌侵染液进行重悬得菌液；其中，继续培养包括：置于含卡那霉素和链霉素的ty液体培养基，于28℃振荡培养1d-2d；将菌液转移至含卡那霉素和链霉素的ty液体培养基进行扩大培养，至od600值为0.5～0.8；离心包括：4000rpm-6000rpm，时间5min。
10.权利要求1至4中任一项权利要求所述的转化体系或权利要求5至9中任一项权利要求所述的转化方法在巴戟天遗传育种中的应用。
