本发明在一方面涉及一种适于时间分辨荧光免疫分析检测的系统，该系统包括：容器，该容器具有适于在其中接收样品的样品容积；光源，该光源适于发射脉冲激发光；照射光学器件，该照射光学器件适于收集来自光源的脉冲激发光并将所述脉冲激发光传送到容器中的样品容积；检测装置，该检测装置适于对至少在检测光谱范围内的荧光辐射进行门控检测；检测光学器件，该检测光学器件适于收集来自容器的至少在检测光谱范围内的荧光辐射，并将所述荧光辐射传送到检测装置；以及光学滤光器装置，该光学滤光器装置被配置用于分离激发光和检测光。根据另一方面，本发明涉及一种用于时间分辨荧光免疫分析检测的方法，该方法包括：用基于镧系元素螯合物的荧光团对样品进行免疫染色；用激发脉冲对样品进行照射；等待激发脉冲终止之后的检测延迟；以及响应于检测期间激发光的脉冲，检测样品发射的荧光辐射。
背景技术：
1、荧光免疫分析是诊断分析中非常有用且可靠的工具。仅举例来说，检测并可靠地测量心脏标志物(诸如，肌钙蛋白)的浓度对于识别急性心脏病相当有用。因此，期望使得此类测量不仅可在高度专业化的先进实验室环境中采用，并且还可在定点护理处提供此类技术，以获得从采样到提供可用测量结果的短回报时间。此类定点护理设备通常需要易于操作且高度可靠的装置来提供无误的测量结果。此外，无论是在专业化实验室中还是在定点护理处，均期望用于此类测定的装置与标准化或至少常用的用于样品采集、处理和制备的实验室器具兼容。装置本身内部与工业标准的兼容性或至少与用于样品采集、样品处理和样品制备实验室器具的业界标准的兼容性也是非常重要的，以便适合在自动化装置内集成基于荧光免疫分析的测量。如果自动化装置适于测量多个参数，则情况更是如此。
2、就例如在相关(非常低)浓度下的生物样品中检测某些目标物质的存在所需的灵敏度而言，荧光免疫分析极具挑战性。时间分辨荧光是已经用于免疫分析检测中以抑制短暂的背景荧光并允许高灵敏度的一项强大工具。它依赖于采用具有长荧光寿命的高荧光荧光团以及发射显著短于这些荧光团的荧光寿命的激发脉冲的光源。与稳定测量相比，相对于短激发脉冲延迟了数微秒的时间门控荧光检测表现出改善的信噪比(snr)，因为它降低了在纳秒范围内的典型荧光寿命的背景。荧光寿命长的许多荧光团属于镧系元素。铕是一种镧系元素离子，由于铕具有大斯托克斯位移以及在微秒-(μs)到毫秒-(ms)范围内的长荧光寿命，它已经被用作时间分辨荧光仪器中的标记物。用于时间分辨检测技术的基于镧系元素的荧光团的激发需要脉冲uv光源。例如，铕在uv-a区域中被激发并发射在616nm处具有发射峰的荧光。
3、然而，如上所述，就检测相关浓度下某些目标物质的存在所需的灵敏度以便提供有用的诊断工具而言，荧光免疫分析极具挑战性。因此，需要在与待检测的光学信号的光谱范围内的噪声和背景辐射水平均相竞争的水平下检测极低光学信号，并且需要有效地激发目标荧光团。因此，氙闪光灯通常用作用于时间分辨荧光免疫分析检测的激发源，因为它们在纳秒范围内的短脉冲中具有强大的发射能力，并且还因为它们具有光谱通用性，这是由相对宽带发射造成的，该相对宽带发射被定制用于特定荧光团，例如，使用光学带通滤光器。然而，使用闪光灯时的主要问题是其数百微秒的长拖尾剩余脉冲余辉，这会促使背景发射并降低snr。已经将氮激光器用作另选的激发光源，但它们体积大、价格昂贵并且需在低重复频率下操作。最近，uv led已经成为用于荧光标记物的时间分辨激发的光源。然而，此类uv-led具有额定功率低等缺点，并且迄今仅成功应用于存在相对较高浓度的荧光团标记物且因此可获得充足信号的应用中，例如，应用于荧光团的荧光寿命的显微成像或直接测量中。
4、因此，需要与在自动化分析装置中的实施兼容的改进式时间分辨荧光免疫分析检测。
5、因此，本发明的目的是提供一种可克服上述缺点中的至少一些的用于时间分辨荧光免疫分析检测的改进或至少另选的系统和方法。
技术实现思路
1、本发明的一方面涉及一种适于时间分辨荧光免疫分析检测的系统，所述系统包括：
2、-容器(110)，所述容器具有适于在其中接收样品的样品容积；
3、-光源(120)，所述光源适于发射脉冲激发光；
4、-照射光学器件(130)，所述照射光学器件适于收集来自所述光源的所述脉冲激发光并将所述脉冲激发光传送到所述容器中的所述样品容积；
5、-检测装置(140)，所述检测装置适于对至少在检测光谱范围内的荧光辐射进行门控检测；
6、-检测光学器件(150)，所述检测光学器件适于收集来自所述容器的至少在所述检测光谱范围内的荧光辐射，并将所述荧光辐射传送到所述检测装置；以及
7、-光学滤光器装置(160)，所述光学滤光器装置被配置用于分离激发光和检测光；
8、其特征在于
9、-所述光源(120)为发光二极管，所述发光二极管在低于355nm的波长处具有峰值强度发射；
10、-其中，所述系统还包括控制单元(101)，所述控制单元被配置为至少控制检测周期的时序，所述检测周期包括由所述发光二极管发射的激发脉冲、随后用于通过所述检测装置来检测荧光辐射的检测时间段，其中所述检测时间段通过检测延迟与所述激发脉冲分离；以及
11、-其中所述激发脉冲的脉冲持续时间为至少50μs，且最多至500μs。
12、本发明的一方面涉及一种用于时间分辨荧光免疫分析检测的方法，所述方法包括：
13、-用基于镧系元素螯合物的荧光团对样品(99)进行免疫染色；
14、-用激发脉冲(1010)对所述样品进行照射；
15、-等待所述激发脉冲终止之后的检测延迟(1020)；
16、-响应于检测期间激发光的所述脉冲，检测所述样品发射的荧光辐射(1030)；
17、其特征在于
18、-所述激发脉冲由在低于355nm的波长处具有峰值强度发射的发光二极管(120)提供，
19、-其中所述激发脉冲具有至少50μs且最多至500μs的脉冲持续时间。
20、本发明的一方面涉及适于时间分辨荧光免疫分析检测的系统，该系统包括：
21、-容器，该容器具有适于在其中接收样品的样品容积；
22、-光源，该光源适于发射脉冲激发光；
23、-照射光学器件，该照射光学器件适于收集来自光源的脉冲激发光并将所述脉冲激发光传送到容器中的样品容积；
24、-检测装置，该检测装置适于对至少在检测光谱范围内的荧光辐射进行门控检测；
25、-检测光学器件，该检测光学器件适于收集来自容器的至少在检测光谱范围内的荧光辐射，并将所述荧光辐射传送到检测装置；以及
26、-光学滤光器装置，该光学滤光器装置被配置用于分离激发光和检测光；其中
27、-光源为发光二极管，该发光二极管在低于355nm的波长处具有峰值强度发射；
28、-其中系统还包括控制单元，该控制单元被配置为至少控制检测周期的时序，该检测周期包括由发光二极管发射的激发脉冲、随后用于通过检测装置来检测荧光辐射的检测时间段，其中检测时间段通过检测延迟与激发脉冲分离；以及
29、-其中激发脉冲的脉冲持续时间为至少50μs。
30、到目前为止，据本发明人所知，尚未报道过成功将uv-led用作脉冲激发源的时间分辨荧光免疫分析检测的具体实施。这是由于，与例如闪光灯相比，用于uv发射带的发光二极管具有众所周知的低峰功率输出。此类低功率输出需要非常长的脉冲以便获得足够的总脉冲能量，即至少与闪光灯所提供的总脉冲能量相当的总脉冲能量。另一方面，非常长的激发脉冲极大地影响激发效率。本发明令人惊奇的见解是，尽管led发射的峰值功率超低，但总激发脉冲能量与激发效率之间的此类平衡实际上可使用具有低于355nm的峰值强度发射波长的此类led来实现。在另外的步骤中，发明人惊奇地发现，微秒方案中与荧光团的荧光寿命相当的脉冲持续时间可在时间分辨荧光免疫分析检测系统中实现可靠的激发，甚至可实现相比于基于闪光灯的时间分辨荧光免疫分析检测系统得到改善的信噪比。更令人惊奇的是，发明人发现，当使用基于镧系元素的荧光团特别是基于铕(eu-iii)的荧光团时，通过使用在低于355nm的波长处具有峰值强度发射并且具有至少10μs优选至少50μs且优选低于500μs的脉冲持续时间的led，时间分辨荧光免疫分析检测可实现非常好的结果。这一点特别令人惊奇，因为如前所述，众所周知，在该波长范围内的uv-led具有低功率输出。脉冲持续时间的下限由实现足够的总脉冲能量的相关因素决定，而脉冲持续时间的上限则由实现足够的激发效率的相关因素来决定。更优选地，在低于355nm的波长处具有峰值强度发射的uv-led的脉冲持续时间选自介于100μs与400μs之间，从而进一步优化总脉冲能量与激发效率之间的平衡。
31、最优选地，led激发脉冲中的每一者均具有传送到容器的最小脉冲能量，其中最小脉冲能量为至少2μj、至少5μj或甚至至少10μj。及时传送到样品的此类最小脉冲能量是实现充分激发以便得到荧光免疫分析检测的非常低信号电平的可用信噪比的必要条件。
32、如上所述，根据一些实施方案的时间分辨荧光免疫分析检测系统包括容器、光源、照射光学器件、检测装置、检测光学器件、光学滤光器装置和控制单元。容器用于在其中接收经免疫染色的样品，其中使用基于镧系元素螯合物作为荧光团来执行免疫染色。优选地，荧光团是基于铕的。在操作中，光源生成脉冲激发光，激发光由照射光学器件收集并传送到已经制备并放置在内部容积或腔体中或容器底部处的样品容积中的已染色样品。响应于激发光脉冲的脉冲激发，免疫染色样品中的荧光标记物分子发射荧光辐射，该荧光辐射在比激发波长(斯托克斯位移)更长的波长处具有特征光谱发射特征，从而允许在光谱上区分激发光和荧光辐射。因此，使用光学滤光器装置诸如二向色性滤光片组使激发光和荧光辐射彼此分离。检测光学器件收集至少在检测光谱范围内的由容器中的样品发射的荧光辐射，并将所述荧光辐射传送到检测装置，该检测装置适于检测至少在检测光谱范围内的荧光辐射。
33、脉冲激发之后，荧光辐射的发射以特征寿命衰减。大部分背景辐射的特征寿命以比基于镧系元素的螯合物荧光团特别是基于铕的螯合物荧光团的辐射快得多的速率衰减。这允许通过门控检测及时分离背景荧光和源自经免疫染色样品的期望信号荧光辐射。因此，检测的时序由控制单元根据检测周期来控制。控制单元被配置为控制检测周期的时序，该检测周期包括激发阶段、随后通过检测延迟与激发阶段分离的检测时间段。当激发光源(本文是指led)开始发射激发光(即，处于激发脉冲的上升侧)且在由控制单元控制的脉冲持续时间之后终止发射激发光时，激发阶段开始。检测延迟在激发阶段终止时开始，并且在门控检测荧光辐射开始时终止。门控检测荧光辐射开始标志着测量窗口的打开，该测量窗口在通过门控检测的终止所确定的检测时间段已经结束之后关闭。因此，从激发脉冲的脉冲序列中以循环方式获得测量值，并且通常以预先确定的重复频率提供测量值。检测后延迟可指定终止检测时间段(即，关闭测量窗口)与开始新的后续激发脉冲之间的时间跨度。因此，完整检测周期的长度可由后续检测周期中的对应点之间的时间距离来定义。例如，从第一激发脉冲的上升沿到第二后续脉冲的上升沿的时间长度。通常，激发脉冲以周期性方式传送，即以由脉冲持续时间、检测延迟、检测时间段和检测后延迟之和确定的给定频率传送。
34、有利地，检测周期为约几毫秒，诸如至少1ms、优选至少2ms、或至少3ms、或至少4ms、或至少6ms、或甚至至少8ms。因此，激发脉冲可处于在10hz和1khz之间的范围内、或处于在50hz和500hz之间的范围内、或处于在100hz和400hz之间的范围内的给定频率下被激发。对于给定的检测延迟和检测时间段，较长的检测周期意味着较长的检测后延迟。较长的检测后延迟具有以下优点：在后续激发脉冲被激发之前允许长寿命背景荧光完全衰减，从而进一步改善信噪比。为了实现正确的时序，控制单元根据选择用于检测周期的延迟来相对于激发脉冲触发/同步门控检测。
35、可以注意到，检测周期的长度的上限以及检测后延迟的长度的上限是为了在给定时间内累积尽可能多的可靠测量值，即，为了在给定时间内执行尽可能多的可行检测周期。例如，此类给定时间可由在系统提供可靠结果之前指定的总测量时间来确定。
36、尽管涉及荧光免疫分析检测的绝大多数测量均是在由信噪比确定的可检测限度下进行的，但由于高浓度的生物标记物(例如，在来自特定病理状态下的患者的样品中)，可出现非常高信号电平的罕见情况。由于检测装置具有非常高的灵敏度，为了能够收集接近可检测限度的极小荧光辐射信号，此类高浓度标记物可能导致使得检测装置饱和或至少导致检测输出的非线性行为的信号电平。用基于led的激发系统替换基于闪光灯的激发系统的本系统在此具有一个特别的优点，即该系统允许以容易的方式调整激发脉冲能量。因此，在样品中荧光标记物浓度特别高的罕见情况下，可容易地降低led激发脉冲的脉冲能量，以便将检测装置保持在线性状态下。因此，与基于闪光灯的系统相比，使用基于led的激发的系统实现了信号电平的改善动态范围，所述信号电平可由给定系统处理。
37、有利地，该系统还可包括数据处理器，该数据处理器适于收集并处理从检测单元接收到的表示由检测单元检测的荧光辐射的输出信号。
38、有利地，根据一些实施方案，该发光二极管具有介于320nm与355nm之间，更有利地介于330nm与350nm之间的峰值发射强度。更有利的是，根据一些实施方案，该发光二极管具有半峰全宽(fwhm)介于10nm与20nm之间的光谱发射。因此，实现了与基于镧系元素的螯合物荧光团特别是与基于铕的螯合物荧光团的良好光谱重叠。
39、另外根据本系统的一个实施方案，激发脉冲的脉冲持续时间最多至500μs。有利地，根据一些实施方案，激发脉冲的脉冲持续时间最多至400μs。更有利的是，根据一些实施方案，激发脉冲的脉冲持续时间为至少100μs并且最多至300μs。通过如此选择脉冲持续时间，实现了出奇好的信噪比，从而实现上述基于镧系元素螯合物的荧光团的荧光寿命与激发脉冲持续时间之间的平衡，以优化激发效率。如上所述，最优选地，led激发脉冲中的每一者均具有传送到容器的最小脉冲能量，其中最小脉冲能量为至少3μj、至少5μj或甚至至少10μj。及时传送到样品的此类最小脉冲能量是实现充分激发以便得到荧光免疫分析检测的超低信号电平的可用信噪比的必要条件。
40、另外根据本系统的一个实施方案，检测延迟介于200μs与600μs之间，或者优选地介于300μs与500μs之间。通过如此选择检测延迟，特别是结合上下文中指定的用于检测时间段长度的特定范围，实现了出奇好的snr。从这些范围中选择的检测延迟优化了短寿命背景荧光、根据免疫染色荧光团的寿命考虑衰减而导致的信号电平以及长期背景荧光之间的snr。因此，选择足够长的延迟，使得短寿命背景衰减但不超过荧光团寿命允许的范围以便维持适当的信号电平。
41、另外根据本系统的一个实施方案，检测时间段介于100μs与500μs之间。如此选择检测时间段的长度允许累积信号，但不会太长以便避免长寿命背景荧光影响snr，因为相比于长寿命背景荧光，基于镧系元素的荧光团出现信号衰减。
42、另外根据本系统的一个实施方案，容器为孔。该孔类似于微板中已知的孔类型。
43、有利地，容器是所谓的微板中的孔。更有利的是，微板满足标准ansi/slas1-2004至ansi/slas 4-2004，如下所示：ansi/slas1-2004：微板-占有面积尺寸；ansi/slas2-2004：微板-高度尺寸；ansi/slas 3-2004：微板-底部外缘尺寸；和/或ansi/slas 4-2004：微板-孔位置。更有利的是，微板符合标准ansi/slas 6-2012：微板-孔底高度。
44、如本文所用的术语“微板”是指具有用作小试管的多个“孔”的平板。将微板孔作为用于荧光免疫分析检测的容器的优点是，微板(也称为“微量滴定板”、“微孔平板”或“多孔板”)是分析研究和临床诊断测试中广泛使用的工具，例如用于样品采集、处理和制备。因此，被配置用于使用微板孔作为容器的荧光免疫分析检测系统与用于实验室设备的通用自动化设计兼容，从而有利于在自动化分析装置中的集成/实施。
45、然而，使荧光免疫分析检测此类适应微板孔对光学构造构成了另外的挑战，例如，由光学通路受孔本身的几何形状限制这一事实带来的挑战，其中所述事实可能由标准或类似的兼容性约束来决定。也可能造成其他的挑战，例如，由进入容器的装置的其他部件的空间要求带来的挑战。
46、另外根据本系统的一个实施方案，照射光学器件为将发光二极管的图像投射在样品容积中的图像平面上的成像光学器件。因此，照射光学器件被布置成将照射源的图像投射到与样品重叠的图像平面。因此，实现了应对上述对光学构造构成的挑战，并有利于荧光免疫分析检测系统与现有分析装置特别是自动化分析装置的集成和/或兼容。
47、另外根据本系统的一个实施方案，图像平面与容器/孔中的底平面重合。该构造在干燥的荧光免疫染色样品位于容器/孔底部处的情况下特别有用。干燥的免疫荧光染色样品例如被制备以便避免液体样品中可能发生的荧光团的非荧光衰减途径，从而提高荧光团的量子效率。
48、有利地，根据本系统的一个实施方案，激发成像光学器件具有大于50mm的像侧焦距以及小于0.4的像侧数值孔径，另选地具有大于60mm的像侧焦距以及小于0.3的像侧数值孔径。从而实现光学设计，允许在激发光学器件和给定样品平面之间的最小距离的机械约束下远程激发样品容积中的样品。
49、更有利的是，通过在预先确定的像侧数值孔径的机械约束下平衡放大率与收集效率来优化照射光学器件，以便使从发光二极管传送到容器并因此传送到样品的总能量最大化。基于这些考虑以及可将发光二极管描述为平面朗伯发射器的假设，可使用商业射线跟踪软件以便执行优化。
50、本发明的第二方面涉及用于时间分辨荧光免疫分析检测的方法，该方法包括：
51、-用基于镧系元素螯合物的荧光团对样品进行免疫染色；
52、-用激发脉冲对样品进行照射；
53、-等待激发脉冲终止之后的检测延迟；
54、-响应于检测期间激发光的脉冲，检测样品发射的荧光辐射；
55、其中激发脉冲由在低于355nm的波长处具有峰值强度发射的发光二极管提供，其中激发脉冲具有至少50μs的脉冲持续时间。
56、另外根据本方法的一个实施方案，荧光团为基于铕的螯合物。基于铕的螯合物荧光团的寿命特别适用于具有上文指定的激发脉冲、检测延迟、检测时间段、检测后延迟和/或检测周期特定范围的时间分辨荧光免疫分析检测。此外，基于铕的螯合物荧光团为在uv-a带且特别是在从320nm最多至355nm的uv-a带范围内的激发提供令人满意的荧光响应。
57、另外根据本方法的一个实施方案，对样品进行照射包括在样品平面中提供干燥状态的经免疫染色样品，并且借助于照射光学器件在样品平面中生成发光二极管的图像。
58、有利地，根据一些实施方案，激发脉冲具有至少100μs并且/或者最多至400μs或者甚至最多至500μs的持续时间；
59、有利地，根据一些实施方案，发光二极管在低于350nm优选低于345nm的波长处具有峰值强度发射。
60、有利地，根据一些实施方案，发光二极管在至少320nm或至少330nm的波长处具有峰值强度发射；
61、有利地，根据一个实施方案，检测荧光辐射包括：借助于检测光学器件，响应于激发光的脉冲收集样品发射的荧光辐射，以及将收集的荧光辐射传送到检测装置；
62、如上文相对于用于时间分辨荧光免疫分析检测的系统所讨论的实施方案，通过用于时间分辨荧光免疫分析检测的方法的上述实施方案，实现了相同或类似的优点。
1.一种适于时间分辨荧光免疫分析检测的系统，所述系统包括：
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述检测延迟介于200μs与600μs之间。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述检测延迟介于300μs与500μs之间。
4.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述发光二极管在低于350nm或低于345nm的波长处具有峰值强度发射。
5.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述发光二极管在至少320nm或至少330nm的波长处具有峰值强度发射。
6.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述容器(110)为微板上的孔。
7.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述照射光学器件(130)为将所述发光二极管(120)的图像投射在所述样品容积中的图像平面(111)上的成像光学器件。
8.根据权利要求7所述的系统，其中所述图像平面(111)与所述容器/孔(110)中的底平面重合。
9.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述光源(120)的激发脉冲中的每一者均具有传送到所述容器(110)的最小脉冲能量，其中所述最小脉冲能量为至少2μj、至少5μj或至少10μj。
10.一种用于时间分辨荧光免疫分析检测的方法，所述方法包括：
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述发光二极管(120)的激发脉冲中的每一者均具有传送到所述容器(110)的最小脉冲能量，其中所述最小脉冲能量为至少2μj、至少5μj或至少10μj。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述检测延迟介于200μs与600μs之间，或者介于300μs与500μs之间。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述检测延迟介于300μs与500μs之间。
14.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述荧光团为基于铕的螯合物。
15.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中对所述样品进行照射包括：在样品平面中提供干燥状态的经免疫染色样品(99)，以及借助于照射光学器件(130)，生成所述发光二极管在所述样品平面中的图像(111)。
16.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述发光二极管在低于350nm或低于345nm的波长处具有峰值强度发射。
17.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述发光二极管在至少320nm或至少330nm的波长处具有峰值强度发射。
