本发明属于抗冻蛋白领域，具体涉及一种低免疫原性抗冻蛋白及制备方法、基因、工程菌和应用。
背景技术：
1、抗冻蛋白是一种能够通过与冰晶表面特异性结合而抑制冰晶重结晶、改变形貌和产生热滞后效应的蛋白分子，广泛应用于食品、医学、农业等领域。但是抗冻蛋白具有较高的免疫原性，在生物医学如细胞/组织冻存上的应用收到了很大程度的限制，因此，亟需开发抗冻效果好、免疫原性低的低免疫原性抗冻蛋白。
2、天然抗冻蛋白是使耐寒生物能够在低温下生存的主要成分，在不同的生物中可以发挥不同的作用。抗冻蛋白通过与冰晶表面特异性地结合，能够实现其热滞后能力、抑制冰晶重结晶能力以及改变冰晶形貌的能力。热滞后效应(thermal hysteresis，th)：指在存在抗冻蛋白时，溶液的凝固点降低，而熔化点不变，从而形成一个温度差异。冰晶重结晶抑制效应(ice recrystallization inhibition effect，iri)：指在存在抗冻蛋白时，会抑制小冰晶融化从而形成又尖又大的大冰晶，冰晶重结晶抑制效应对于生物体的细胞保护非常重要，因为大冰晶会造成细胞膜和细胞器的损伤，而小冰晶则相对温和。修饰冰晶的生长形态：抗冻蛋白对冰晶的生长修饰具有独特作用，它可以在冰晶的表面与其结合改变冰晶的形态并抑制其生长。
3、蛋白类药物的免疫原性与生物分子大小或生化结构等因素有关。特别是由于较低的水动力半径，紧凑的结构和/或蛋白质聚集可诱导免疫原性。但是，目前尚未有合理的设计将将亲水性聚合物与目的抗冻蛋白融合。
技术实现思路
1、本发明的目的在于，提供一种抗冻蛋白及制备方法、基因、工程菌和应用。
2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
3、一种抗冻蛋白，含有抗冻功能片段以及降免疫功能片段；抗冻功能片段的氨基酸序列和降免疫功能片段序列的氨基酸数量比例为10:1-1:10；优选为1：1。
4、所述的抗冻功能片段的氨基酸序列为来源于天然抗冻蛋白的氨基酸序列，或来源于黄粉虫、南极细菌、黑麦草、鱼类的氨基酸序列；
5、优选的，抗冻功能片段的氨基酸序列为具有冰结合位点为txt或者tct的天然抗冻蛋白或人工设计的抗冻多肽；
6、优选的，抗冻功能片段的氨基酸序列为小胸鳖甲抗冻蛋白mpafp5的氨基酸序列；
7、优选的，抗冻功能片段的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8、所述的降免疫功能片段为asn(n)、gln(q)、pro(p)、ser(s)、gly(g)无序组成的五肽基元的重复单元；优选的，五肽基元的重复度为1-50；优选为19，氨基酸序列如seq idno.3示出。
9、氨基酸序列的c端以及n端连接6×his标签；含有seq id no.1所示的氨基酸序列。
10、本发明还包括一种抗冻蛋白基因，编码所述的抗冻蛋白；优选的，含有seq idno.5、seq id no.6、或者seq id no.4所示的核苷酸序列。
11、本发明还包括一种重组表达载体，含有编码所述抗冻蛋白的基因,优选的重组表达载体是将抗冻蛋白基因克隆到大肠杆菌表达载体pet-28a(+)中得到重组表达载体，所述的重组表达载体含有ndei和hindiii限制性酶切位点，t7强启动子、lac乳糖操纵子以及卡那霉素的抗性筛选基因；所述的大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)。
12、本发明还包括一种表达所述的抗冻蛋白的工程菌。
13、本发明还包括一种所述的抗冻蛋白的制备方法,其包括如下步骤:
14、(1)合成编码所述抗冻蛋白的核苷酸序列；
15、(2)将基因与载体/质粒连接,转化细菌,构建重组基因工程菌:
16、(3)培养构建的重组基因工程菌,并诱导表达,收集菌体沉淀,破碎得上清液纯化获得抗冻蛋白；
17、本发明还包括一种所述的抗冻蛋白、所述的抗冻蛋白基因、所述的工程菌或者其发酵产物的应用，应用于冷冻保护剂；优选的，应用于细胞冷冻保护剂。
18、所述的细胞冷冻保护剂，包括下列组份：45份dmem、5份fbs(胎牛血清)、0.5份青链霉素、0.05-0.5％(w/v)所述的抗冻蛋白、4％(w/v)甜菜碱；
19、所述的细胞冷冻保护剂进行细胞冷冻方法，包括下述步骤：将1×103-1×108个细胞与细胞冷冻保护剂混合均匀后立即放入-196℃的液氮中急速冷冻。
20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21、本申请的抗冻蛋白为融合蛋白，其将亲水性聚合物与目的抗冻蛋白在基因水平上进行融合，构建了低免疫原性抗冻蛋白。利用大肠杆菌发酵表达融合蛋白；亲水性聚合物能够在目的蛋白表面形成层状结构，从而减少免疫识别反应，起到降免疫的作用。同时，在基因片段的n端和c端连接6×his标签，通过镍亲和纯化对目的蛋白进行纯化，将这种抗冻蛋白作为冷冻保护剂，尤其是添加到细胞冻存保护剂中，可提高细胞存活率。蛋白制备过程温和高效且成本低廉，易于后期扩大生产。
1.一种低免疫原性抗冻蛋白，其特征在于，含有抗冻功能片段以及降免疫功能片段；抗冻功能片段的氨基酸序列和降免疫功能片段序列的氨基酸数量比例为10:1-1:10；优选为1：1。
2.根据权利要求1所述的低免疫原性抗冻蛋白，其特征在于，所述的抗冻功能片段的氨基酸序列为来源于天然抗冻蛋白的氨基酸序列，或来源于黄粉虫、南极细菌、黑麦草、鱼类的氨基酸序列；
3.根据权利要求1所述的抗冻蛋白，其特征在于，所述的降免疫功能片段为asn(n)、gln(q)、pro(p)、ser(s)、gly(g)无序组成的五肽基元的重复单元；优选的，五肽基元的重复度为1-50；优选为19；优选的，氨基酸序列如seq id no.3示出。
4.根据权利要求1所述的抗冻蛋白，其特征在于，c端以及n端连接6×his标签；优选的，含有seq id no.1所示的氨基酸序列。
5.一种抗冻蛋白基因，其特征在于，编码权利要求1-4任一项所述的抗冻蛋白；优选的，含有seq id no.5、seq id no.6、或者seq id no.4所示的核苷酸序列。
6.一种重组表达载体,其特征在于,含有编码权利要求1-4任一项所述抗冻蛋白的基因,优选的重组表达载体是将抗冻蛋白基因克隆到大肠杆菌表达载体pet-28a(+)中得到重组表达载体，所述的重组表达载体含有ndei和hindi i i限制性酶切位点，t7强启动子、lac乳糖操纵子以及卡那霉素的抗性筛选基因；所述的大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)。
7.一种表达权利要求1-4任一项的抗冻蛋白的工程菌。
8.一种权利要求1所述的抗冻蛋白的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
9.一种所述的抗冻蛋白、所述的抗冻蛋白基因、所述的工程菌或者其发酵产物的应用，其特征在于，应用于冷冻保护剂；优选的，应用于细胞冷冻保护剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的细胞冷冻保护剂，包括下列组份：45份dmem、5份fbs(胎牛血清)、0.5份青链霉素、0.05-0.5％(w/v)权利要求1-4任一项所述的抗冻蛋白、4％(w/v)甜菜碱；
