本发明属分子生物学，涉及一种罂粟源性实时荧光定量pcr检测方法。
背景技术：
1、罂粟(papaver somniferum l.)为罂粟科(papaveraceae)罂粟属(papaver)一年或二年生的草本植物，其果实内含罂粟碱、吗啡、海洛因等30种生物碱，是提炼毒品海洛因及其衍生品的重要原材料。罂粟属全世界约有100个物种，其中我国有七个种、三个变种和三个变型，主要分布于我国的东北部和西北部，与大麻(cannabis sativa l.)、古柯(erythroxylum novogranatense(morris)hier.)并称世界三大毒品原植物。
2、我国对于非法种植罂粟等毒品原植物犯罪，一直都是高强度打击，坚决禁止，并且先后发布了一系列关于严禁种植毒品原植物的法规、法令。但是非法种植案件屡禁不止，在侦破阶段常遇到对涉案植物难以鉴别的情况。目前主要依据形态学鉴定、化学成分检测、分子生物学等方法实现对罂粟植物的鉴别。形态学鉴定主要根据涉案植物茎、叶、花、果实等常规的表型特征进行鉴别，但由于一些幼苗期罂粟属植物与罂粟形态相似，很难进行准确区分，容易造成误判；化学成分检测主要采用示波极谱法、高效液相色谱法、分光光度法、层析法等方法对植物中生物碱成分进行检测，但是由于罂粟幼苗中不含吗啡、罂粟碱等成分无法对其进行准确鉴定，且化学检测周期较长，操作复杂，对仪器设备要求较高，不适用于基层人员快速鉴定；分子技术鉴别主要从分子学角度利用dna条形码、aflp和ssr分子标记等方法进行种属差异鉴别，实现对罂粟及其相似植物的鉴别，但由于罂粟属间植物亲缘关系相近，个别植物无法区分，且该方法操作流程相对复杂，对于前期植物样本dna提取要求较高，操作人员专业性强，对于基层鉴别有一定的局限性。
3、目前实时荧光定量pcr检测方法已广泛应用于植物的鉴别中。cn105648108a公开了一种实时荧光定量pcr对川贝母的鉴别方法，建立了用来鉴别川贝母的实时荧光定量pcr体系，该方法对于鉴别川贝母专属性强，可行性高。cn116716431a公开了一种利用实时荧光定量pcr鉴别威灵仙的引物探针组及其鉴别方法，利用实时荧光pcr鉴别方法，基于snp位点差异，设计特异引物及探针，对威灵仙和其他常见混伪品进行鉴别，该方法专属性强，结果准确，耐用性好。cn105368942a公开了一种罂粟成分的实时荧光pcr检测方法，为检测食品添加剂或调味品中是否非法添加罂粟成分提供了一种很好的方法，其仅适用于检测调味品或食品添加剂中的罂粟成分，不适用于不同时期罂粟植株的鉴别中，尤其是罂粟幼苗期的鉴别。cn104673930a公开了一种罂粟的pcr检测方法，以真核生物rdna-its通用引物对待测样品进行pcr扩增，再对pcr阳性产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪再进行观察，回收片段进行克隆、测序，将测序结果进行blast分析，最终完成对检测样品的鉴定，pcr检测所需仪器较多，操作复杂耗时耗力，且检测环境开放，人为因素干扰较多，易导致污染出现假阳性影响结果的判断。综上将实时荧光定量pcr检测方法应用于不同时期罂粟植株鉴别中的研究尚未发现，为了能够快速准确的判定涉案植物是否为罂粟植株，有效打击非法种植罂粟的不法分子，有必要开发一种适用于基层实验室，且高效准确鉴别罂粟植株的实时荧光定量pcr检测方法。
技术实现思路
1、本发明提供了一种罂粟源性实时荧光定量pcr检测方法，本发明建立的罂粟实时荧光定量pcr检测方法具有特异性强、灵敏度高、耗时短、操作简便且结果易判定等优势，可以适用于基层实验室快速鉴别不同时期的罂粟植株及其相似植物，对实现罂粟植株的快速鉴别，有力打击非法种植罂粟等毒品原植物犯罪具有重要意义。
2、为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一种罂粟源性实时荧光定量pcr检测体系，它包括罂粟特异引物和特异探针，其中，
3、罂粟特异上游引物(ysf)：5'-ccttctggcgacattggc-3'(seq id no.1)；
4、罂粟特异下游引物(ysr)：5'-tgggttccttatggtccttca-3'(seq id no.2)；
5、罂粟特异探针(ysp)：5'-x-tgtcgaccaccacgaatcgtga-y-3'(seq id no.3)。
6、罂粟特异探针，探针序列的5'端修饰有报告基团x，3'端修饰有淬灭基团y，所述报告基团x可以为fam、hex、tamra、rox、cy5中的任一种，所述淬灭基团y可以为dabcyl、bhq1，bhq2中的任一种。
7、优选的，罂粟特异探针(ysp)：5'-fam-tgtcgaccaccacgaatcgtga-bhq1-3'。
8、进一步的，本发明实时荧光定量pcr检测体系，其中各引物终浓度为0.05～0.5μmol/l，探针终浓度为0.05～0.25μmol/l。
9、进一步的，本发明实时荧光定量pcr检测体系，还包括：2×taqman mix、dna模板和双蒸水。
10、进一步优选的，上述的实时荧光定量pcr检测体系，其20μιpcr扩增体系为：2×taqman mix，各引物终浓度为0.05～0.5μmol/l，探针终浓度为0.05～0.25μmol/l，50～200ng/μl dna模板2.0μl，双蒸水补至20μl，其配制方法如表1所示。
11、表1pcr反应扩增体系
12、
13、
14、进一步的，上述的实时荧光定量pcr检测体系还包括罂粟阳性对照品、阴性对照品、空白对照品。
15、本发明还提供了一种罂粟源性实时荧光定量pcr检测方法，其特征是，具体步骤如下：
16、1)提取待测样本的模板dna；
17、2)pcr扩增
18、使用上述的实时荧光定量pcr扩增条件进行pcr扩增，需要在4通道或4通道以上的任何型号的荧光定量pcr仪上进行，扩增程序：95℃，3min；95℃，10s；62℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环；
19、3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值δrn与扩增曲线ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线ct值来判定检测植株是否为罂粟植株。
20、进一步的，如果fam荧光修饰探针有扩增曲线，且满足ct≤35说明待检样本为罂粟植株，如果fam荧光修饰探针没有扩增曲线时，则不是罂粟植株。
21、本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明以罂粟的一对特异性引物对待测样本dna提取物进行pcr扩增，以罂粟的特异荧光探针对罂粟植株加以鉴别。本发明以特异荧光探针与模板配对，具有高度的特异性与专一性，检测18份罂粟样品均检出罂粟源性成分，且所用阳性样本与sanger测序检测结果完全一致，灵敏度高，检出限达到0.4ng/μl，耗时短、操作简便结果易判定，且能实时监测dna扩增反应，具有很高的可行性与应用前景，对实现罂粟的快速鉴别具有重要意义，可广泛适用于基层实验室快速鉴别罂粟及其相似植物，对快速打击非法种植罂粟等毒品原植物犯罪具有重要作用。
1.一种罂粟源性实时荧光定量pcr检测体系，它包括罂粟特异引物和特异探针，其中，
2.根据权利要求1所述的罂粟源性实时荧光定量pcr检测体系，其特征是，各引物终浓度为0.05～0.5μmol/l，探针终浓度为0.05～0.25μmol/l。
3.根据权利要求1所述的罂粟源性实时荧光定量pcr检测体系，其特征是，所述荧光pcr检测体系还包括：2×taqman mix、dna模板和双蒸水。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的罂粟源性实时荧光定量pcr检测体系，其特征是，其20μl pcr扩增体系为：2×taqman mix，各引物终浓度为0.05～0.5μmol/l，探针终浓度为0.05～0.25μmol/l，50～200ng/μl的dna模板2μι，双蒸水补足20μι。
5.根据权利要求4所述的罂粟源性实时荧光定量pcr检测体系，其特征是，所述的实时荧光定量pcr检测体系，还包括罂粟阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
6.一种罂粟源性实时荧光定量pcr检测方法，其特征是，具体步骤如下：
7.根据权利要求6所述的罂粟源性实时荧光定量pcr检测方法，其特征是，判定是否为罂粟植株的方法为：如果fam荧光修饰探针有扩增曲线，且满足ct≤35说明待检样本为罂粟植株；如果fam荧光修饰探针没有扩增曲线时，则不是罂粟植株。
