本发明属于畜牧兽医，具体涉及一种绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna及其应用。
背景技术：
1、据了解，腹泻病是绵羊饲养生产过程中最为常见的问题，常发于初生羔羊，极大的影响了幼龄绵羊的存活率和生长速度效率，为绵羊养殖业带来了巨大的经济损失。f17大肠杆菌(e.coli f17)是导致绵羊羔羊腹泻病的主要病原菌之一，流行病学调查显示，f17大肠杆菌在世界各地的羔羊与犊牛中广泛传播，且呈现较高的检出率与死亡率特征。此外，f17大肠杆菌的耐药性情况也十分严重，因此从遗传基础上提高宿主自身对f17大肠杆菌的免疫力和抗病力，才是解决绵羊f17大肠杆菌感染问题的有效途径。
2、f17大肠杆菌引起的腹泻病是由病原菌、宿主、环境相互作用的结果，其发生和发展涉及大量非编码rna、基因、信号通路、代谢物等因子的调控。目前对于f17大肠杆菌腹泻病的遗传调控机制的研究，主要集中在宿主基因表达、免疫通路激活和宿主基因-f17大肠杆菌互作方面，然而对于非编码rna，尤其是长链非编码rna(long noncoding rna，lncrna)在f17大肠杆菌腹泻病发生和发展过程中的功能和相关分子调控机制仍不明确。
3、虽然在人、小鼠、猪、奶牛等物种中，目前已发现并鉴定了大量参与腹泻病发生和发展调控过程的lncrna，如fut3-as1、ialncr、xr_001779380等，但是绵羊腹泻病相关lncrnas的鉴定与功能解析仍鲜有报道。
技术实现思路
1、本发明针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna及其应用。
2、本发明的目的之一在于，提供一种绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna，所述绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3、绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna命名为lncrna drb1-as1，其在f17大肠杆菌拮抗型绵羊空肠中的表达显著高于f17大肠杆菌易感型绵羊，且在f17大肠杆菌攻毒绵羊原代小肠上皮细胞模型中显著上调表达，说明lncrnadrb1-as1在f17大肠杆菌感染绵羊小肠过程中被诱导表达，且在一定程度上提高了绵羊对f17大肠杆菌的抗性，参与绵羊腹泻病发生和发展过程中的宿主免疫保护机制。lncrnadrb1-as1的发现有助于理解绵羊对f17大肠杆菌的抗性和腹泻病发生发展的分子调控机理，为开发绵羊腹泻病分子治疗靶标和抗病育种位点奠定了理论基础，具有重要应用前景。
4、本发明的目的之二在于，提供一种绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna的制备方法，包括：以绵羊正常小肠组织total rna为模板，从中进行绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrnadrb1-as1的全长扩增。
5、本发明进一步优化的技术方案如下：
6、本发明提供的绵羊f17大肠杆菌腹泻病相关的lncrna，命名为drb1-as1，其全长序列如seq id no.1所示。其中，全长序列drb1-as1的扩增引物对为p1，其核苷酸序列如下：
7、上游引物p1-f:aagcttgaggagatgtctacacctgccg；
8、下游引物p1-r:ggatccgatctcagaggaacaggctgaca。
9、上述绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna的制备方法中，试剂检测的样本为绵羊正常小肠组织。
10、上述一种绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna的制备方法，具体为：绵羊小肠上皮组织经原代培养、纯化、传代培养后，得到绵羊原代小肠上皮细胞，转染绵羊f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna的sirna进绵羊原代小肠上皮细胞，提取细胞rna，得到敲低的绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna。
11、上述一种绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna的制备方法，所述sirna的核苷酸序列如下：
12、
13、本发明提供了lncrna drb1-as1的干扰sirna，其序列为p3，用于检测lncrnadrb1-as1在绵羊对f17大肠杆菌的抗性及在腹泻病发生和发展过程中的免疫保护功能。
14、本发明的目的之三在于，提供一种检测绵羊f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna表达水平的检测扩增引物，所述lncrna检测扩增引物的核苷酸序列如下：
15、上游引物p2-f:accccagcctccagagtccc；
16、下游引物p2-r:cacgaagcccccaacaccac。
17、本发明检测了lncrna drb1-as1的表达水平，实时荧光定量pcr扩增的引物对为p2。优选的是，试剂检测的样本为f17大肠杆菌拮抗型绵羊小肠组织和f17大肠杆菌易感型绵羊小肠组织。
18、本发明的目的之四在于，提供一种检测绵羊f17大肠杆菌相关致病因子表达水平的实时荧光定量引物对，所述绵羊f17大肠杆菌相关致病因子为黏附亚基f17g；所述黏附亚基f17g的实时荧光定量引物对，包括：
19、上游引物p4-f:cgtgggaaattatctatcaacg；
20、下游引物p4-r:tgttgatattccgttaaccgtac。
21、本发明检测了f17大肠杆菌相关致病因子：黏附亚基f17g的表达水平，实时荧光定量引物序列为p4。优选的是，试剂检测的样本为绵羊原代小肠上皮细胞，更优选的是，转染lncrna drb1-as1的sirna到绵羊原代小肠上皮细胞36小时。
22、本发明还提供一种所述绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna在预防或治疗绵羊f17大肠杆菌腹泻病中的应用。
23、本发明还提供一种所述绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna在绵羊腹泻的抗炎药物制备中的应用。
24、本发明还提供一种所述绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna在绵羊腹泻病抗病育种中的应用。
25、本发明的有益效果如下：
26、本发明利用高通量测序技术，分析比较f17大肠杆菌拮抗型绵羊空肠组织和f17大肠杆菌易感型绵羊空肠组织中基因表达谱的差异，鉴定筛选到一关键lncrna，其在f17大肠杆菌拮抗型绵羊空肠中显著上调表达，实时荧光定量pcr实验进一步验证该lncrna在f17大肠杆菌感染绵羊原代小肠上皮细胞模型中显著上调表达，扩增获得lncrna全长序列，并为此lncrna命名为drb1-as1(drb1 antisense rna 1)。
27、之后，本发明进一步合成lncrna drb1-as1 sirna片段，转染绵羊原代小肠上皮细胞后，进行f17大肠杆菌攻毒处理，并检测drb1-as1敲低对绵羊原代小肠上皮细胞对f17大肠杆菌抗性的影响，发现lncrna drb1-as1的表达下调能够降低绵羊原代小肠上皮细胞对f17大肠杆菌的黏附抗性。结果表明lncrna drb1-as1在f17大肠杆菌感染绵羊小肠过程中被诱导表达，且在一定程度上提高了绵羊对f17大肠杆菌的抗性，参与绵羊腹泻病发生和发展过程中的宿主免疫保护机制。
28、因此，本发明lncrna drb1-as1的发现有助于理解绵羊对f17大肠杆菌的抗性和腹泻病发生发展的分子调控机理，为开发绵羊腹泻病分子治疗靶标和抗病育种位点奠定了理论基础，具有重要应用前景。
1.一种绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna，其特征在于，所述绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.如权利要求1所述一种绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna的制备方法，其特征在于，以绵羊正常小肠组织total rna为模板，从中进行绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrnadrb1-as1的全长扩增。
3.根据权利要求2所述一种绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna的制备方法，其特征在于，用于扩增lncrna drb1-as1的引物对，其核苷酸序列如下：
4.根据权利要求2所述一种绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna的制备方法，其特征在于，绵羊小肠上皮组织经原代培养、纯化、传代培养后，得到绵羊原代小肠上皮细胞，转染绵羊f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna的sirna进绵羊原代小肠上皮细胞，提取细胞rna，得到敲低的绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna。
5.根据权利要求4所述一种绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna的制备方法，其特征在于，所述sirna的核苷酸序列如下：
6.一种检测绵羊f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna表达水平的检测扩增引物，其特征在于，所述lncrna检测扩增引物的核苷酸序列如下：
7.一种检测绵羊f17大肠杆菌相关致病因子表达水平的实时荧光定量引物对，其特征在于，所述绵羊f17大肠杆菌相关致病因子为黏附亚基f17g；所述黏附亚基f17g的实时荧光定量引物对，包括：
8.一种权利要求1所述绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna在预防或治疗绵羊f17大肠杆菌腹泻病中的应用。
9.一种权利要求1所述绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna在绵羊腹泻的抗炎药物制备中的应用。
10.一种权利要求1所述绵羊对f17大肠杆菌腹泻病抗性相关的lncrna在绵羊腹泻病抗病育种中的应用。
