本发明涉及光学成像，具体涉及基于倾斜光片微流扫描的单分子快速检测装置和方法。
背景技术：
1、单分子检测技术实现了单分子层面上核酸和蛋白的成像、定位与分析，从而实现了高灵敏度、高准确率、高精度的快速目标物检测，克服了传统方法无法兼顾检测灵敏度与检测速度的技术困难。目前报道的几乎所有单分子检测技术仍旧依赖于样品芯片对目标物(或目标物复合物)的捕获(固定)。该方案优势是可以结合全内反射荧光显微系统实现单分子荧光信号高信噪比高对比度成像，以避免背景光降低成像信噪比导致单分子荧光信号的错检和漏检。但是该方案同样具有明显的缺陷：单分子检测速度仍旧受限。由于目标物固定于样品芯片基底，因此只能对固定视场成像检测，为了提高测量精度只能通过样品芯片机械扫描以扩大视场增加被测样品量，但是其不仅扫描速度较慢，而且受限于样品芯片的制备质量和机械扫描的精度，视场扫描后样品芯片基底难以保证位于全内反射荧光显微系统的成像焦面上，导致成像信噪比和对比度锐减。即使通过自动聚焦仍可获得高信噪比和高对比度的单分子荧光成像，却进一步限制了单分子检测的速度。根据现有的单分子检测方案，需要将目标物反应体系导入样品芯片后进行孵育使得经修饰的样品芯片基底捕获目标物。虽然经优化的样品芯片已明显降低非特异性吸附和样品积聚，但是现有方法仍旧无法保证样品芯片基底能够捕获所有目标物，漂浮于样品芯片中的目标物无法检出，这是目前绝大多数单分子检测方法仍旧无法保证单分子荧光信号数与被检目标物1:1测量关系的根本原因。
2、虽然单分子检测技术simoa结合零模式波导样品芯片和微球检测系统可以降低单分子信号错检和漏检，但是其仍旧检测视场受限依赖视场扫描，更为重要的是该零模式波导样品芯片成本极高，限制了该技术的广泛应用。为了进一步提升检测速度，单分子目标物非捕获(固定)式检测已有少量报道。这些方法使用内径只能通过单个单分子目标物的毛细微流通道，并结合光学探测或成像的方式实现单分子检测。相较于上述捕获(固定)式检测方案，该方案能够在保证检测灵敏度的基础上有效提升检测速度，但是仍旧存在如下问题：毛细微流通道内径过小导致检测效率仍旧受限，且被测样品容易阻塞毛细微流通道。毛细微流通道加工和表面修饰皆非常困难。虽然扩大微流通道的尺寸能够有效提升检测效率并且降低微流通道加工和表面修饰成本，但是在空间荧光激发的条件下流动的单分子样品容易造成拖尾效应，被测单分子样品空间位置上的重叠(如在微流通道同一平面位置但是不同轴向位置)会导致漏检和错检，且在测量过程中过度的光照不可避免导致荧光漂白和淬灭，从而使得测量精度受限。
3、因此，仍旧缺乏可以实现准确、快速、灵敏的单分子检测技术。
技术实现思路
1、为解决现有技术的不足，本发明提供了基于倾斜光片微流扫描的单分子快速检测装置和方法，为单分子检测提供新的技术手段：
2、一种基于倾斜光片微流扫描的单分子快速检测装置，包括：
3、激光光源、激光扩束系统、可调光阑、精密平移台、荧光滤光块、显微物镜、微流通道、蠕动泵、棱镜、空间光调制器、镜筒透镜、emccd相机和电脑；
4、其中，荧光滤光块包括：长通滤光片和荧光发射滤光片；
5、电脑与精密平移台、空间光调制器和emccd相机相连用于装置自动控制；
6、激光光源用于激发该单分子荧光信号标志物；
7、激光扩束系统用于激光光源扩束；
8、精密平移台用于结合可调光阑和显微物镜生成并调节倾斜的光片；
9、微流通道内表面修饰有聚乙二醇，用于有效抑制非特异性吸附；
10、蠕动泵用于驱动微流通道内被测样品溶液流动；
11、显微物镜和镜筒透镜通过匹配用于高质量成像；
12、荧光滤光块中长通滤光片用于透射荧光发射光并反射荧光激发光，荧光发射滤光片用于进一步滤除荧光激发光；
13、空间光调制器和棱镜组成系统用于校正倾斜波前，从而实现倾斜像面成像。
14、进一步地，激光光源的波长与荧光滤光块中长通滤光片和荧光发射滤光片根据荧光标记物的荧光激发和发射特性进行调整。
15、进一步地，荧光激发光源经扩束系统扩束后，经可调光阑后被荧光激发块折转后进入显微物镜生成倾斜光片；通过调节可调光阑的尺寸和位置，精确调节倾斜光片的厚度和倾斜角度；放置于样品台上且经内表面聚乙二醇修饰后的微流通道内由蠕动泵驱动被测样品溶液，从而实现样品在显微物镜视场内的快速扫描；倾斜荧光激发光片对微流通道内一倾斜截面进行荧光激发，若有单分子样品经过该倾斜荧光激发光片区域，发射荧光信号；荧光信号经过显微物镜收集后，经荧光激发块滤除背景光和环境光；为了补偿成像中的倾斜像面误差，使用空间光调制器用于倾斜波前补偿，从而实现高质量单分子成像；emccd相机以高信噪比和高对比度实现对于单分子信号的采集，并结合图像处理算法，根据信号阈值识别并计数单分子样品，确定单位检测体积内待测样品的数量，并换算成待测样品的浓度，实现单分子快速高灵敏度准确检测。
16、一种基于倾斜光片微流扫描的单分子快速检测方法，包括以下步骤：
17、对二氧化硅内部进行直写并进行处理，制备得到微流通道；
18、对待测样品进行预处理；
19、基于单分子快速检测装置对待测样品进行单分子检测。
20、进一步地，制备得到微流通道，具体包括以下步骤：
21、s01、使用飞秒激光器直接在二氧化硅内部进行直写构建微流通道，微流通道厚度和宽度通过直写飞秒激光精确控制，保证倾斜光片完整覆盖微流通道截面；
22、s02、对飞秒激光直写完成的微流通道在500到600摄氏度之间进行1小时热处理；
23、s03、对经热处理的微流通道使用10％氢氟酸溶液进行超声清洗；
24、s04、对经氢氟酸超声清洗的微流通道使用超纯水溶液进行超声清洗5次以上，每次3分钟；
25、s05、对经超纯水超声清洗的微流通道使用聚乙二醇对微流通道内表面进行修饰；
26、s06、对经聚乙二醇修饰的微流通道进行风干，在4摄氏度冰箱密封避光保存待用。
27、进一步地，对待测样品进行预处理，具体包括以下步骤：
28、s11、磁珠与捕获抗体在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的工作浓度下进行稳定的酰胺反应从而制备出捕获探针；
29、s12、荧光微球与信号抗体在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的工作浓度下进行稳定的酰胺反应从而制备出信号探针；
30、s13、捕获探针与待测靶标以15-30rpm/min转速轻柔旋转孵育30min，经过磁力架磁力吸附洗涤三次，每次1min；
31、s14、信号探针与步骤s13洗涤完后的产物以15-30rpm/min转速轻柔旋转孵育30min，经过磁力架磁力吸附洗涤三次，每次1min；
32、s15、将步骤s14得到的磁珠-捕获抗体-靶标-信号抗体-荧光微球的复合物均匀加入样品槽微流通道中；
33、s16、置于单分子快速检测装置中进行荧光信号的激发、收集和统计，从而分析得到待测物的浓度。
34、进一步地，基于单分子快速检测装置对待测样品进行单分子检测，具体包括以下步骤：
35、s21、选择合适的激光作为激发光源，使用激光扩束系统对出射激光进行扩束，使用剪切干涉仪检测扩束光束，实现高质量的准直激光；
36、s22、调节可变光阑的尺寸、通过精密平移台调节可变光阑位置，使得经过可变光阑的激光在经过荧光滤光块折转后经显微物镜形成倾斜光片，其中倾斜光片的厚度和倾斜角度通过可变光阑的尺寸和位置调节；
37、s23、将荧光微球溶液导入微流通道中，并放置于样品台上，保证倾斜光片能够完全覆盖微流通道的截面，并通过空间光调制器编码有效补偿倾斜像面导致的影响；
38、s24、将待测样品溶液导入经聚乙二醇修饰的微流通道，并使用蠕动泵驱动待测样品溶液流动，且速度稳定，并将该样品微流通道置换标准样品微流通道；
39、s25、根据待测样品溶液流动速度确定emccd图像传感器曝光和采集时间，拍摄一系列荧光图像；
40、s26、根据拍摄的一系列荧光图像，根据荧光点判断被测样品数量，确定单位检测体积内待测样品的数量，并换算成待测样品的浓度，实现单分子高灵敏度检测。
41、根据本发明的一个方面，提供一种存储介质，所述存储介质中存储有指令，当计算机读取所述指令时，使所述计算机执行上述任一项所述的基于倾斜光片微流扫描的单分子快速检测方法。
42、根据本发明的另一个方面，提供一种电子设备，包括处理器和上述的存储介质，所述处理器执行所述存储介质中的指令。
43、相比于现有技术，本发明的有益效果如下：
44、1、本发明针对现有单分子检测方案检测速度和精度受限的缺点，提出一种基于单显微物镜式倾斜光片微流扫描的单分子快速检测装置及方法，用单个显微物镜实现倾斜光片激发和单分子荧光信号采集，确保紧凑的系统。
45、2、本发明此外倾斜光片激发模式避免了拖尾效应、空间位置重叠错漏检并降低了荧光漂白和淬灭概率；最后大口径的微流通道检测显著提升了检测效率；整体装置可由软件直接控制。
46、3、本发明根据不同的单分子目标物检测需求，可以通过更换光源和滤光片组合从而用于不同的场合，可以实现准确、快速、灵敏的单分子检测，从而为单分子检测提供新的技术手段。
1.一种基于倾斜光片微流扫描的单分子快速检测装置，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，激光光源的波长与荧光滤光块中长通滤光片和荧光发射滤光片根据荧光标记物的荧光激发和发射特性进行调整。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，荧光激发光源经扩束系统扩束后，经可调光阑后被荧光激发块折转后进入显微物镜生成倾斜光片；通过调节可调光阑的尺寸和位置，精确调节倾斜光片的厚度和倾斜角度；放置于样品台上且经内表面聚乙二醇修饰后的微流通道内由蠕动泵驱动被测样品溶液，从而实现样品在显微物镜视场内的快速扫描；倾斜荧光激发光片对微流通道内一倾斜截面进行荧光激发，若有单分子样品经过该倾斜荧光激发光片区域，发射荧光信号；荧光信号经过显微物镜收集后，经荧光激发块滤除背景光和环境光；为了补偿成像中的倾斜像面误差，使用空间光调制器用于倾斜波前补偿，从而实现高质量单分子成像；emccd相机以高信噪比和高对比度实现对于单分子信号的采集，并结合图像处理算法，根据信号阈值识别并计数单分子样品，确定单位检测体积内待测样品的数量，并换算成待测样品的浓度，实现单分子快速高灵敏度准确检测。
4.一种基于倾斜光片微流扫描的单分子快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，制备得到微流通道，具体包括以下步骤：
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，对待测样品进行预处理，具体包括以下步骤：
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，基于单分子快速检测装置对待测样品进行单分子检测，具体包括以下步骤：
8.一种存储介质，其特征在于，所述存储介质中存储有指令，当计算机读取所述指令时，使所述计算机执行如权利要求4-7中任一项所述的基于倾斜光片微流扫描的单分子快速检测方法。
9.一种电子设备，其特征在于，包括处理器和权利要求8所述的存储介质，所述处理器执行所述存储介质中的指令。
