本发明属于生物，具体涉及高活性cry1ac突变体及其应用。
背景技术：
1、小菜蛾(plutellaxylostella)是一种极具破坏力的鳞翅目害虫，被认为是世界上最重要的农业害虫之一。小菜蛾主要危害十字花科植物，但它的食性非常广泛，可取食40多种不同的寄主植物，包括许多重要的经济作物，如白菜、甘蓝、花椰菜等。这些植物是全球许多地区的主要蔬菜作物，小菜蛾的侵害对这些作物的生长和收成构成了严重威胁。由于长期、大量使用化学杀虫剂，小菜蛾对超过50种常用的化学合成杀虫剂具有高抗性[1]。这种抗药性大大增加了防治小菜蛾的难度和全球范围内的重大经济损失。仅在我国，小菜蛾每年对蔬菜生产造成的经济损失达数十亿元[2]。
2、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis,bt)是一种革兰氏阳性、产芽孢的土壤细菌，广泛应用于生物防治和转基因作物中。bt菌在芽孢形成过程中产生晶体毒素(cry蛋白)，这种蛋白对多种昆虫具有高效的杀虫作用[3,4]。cry晶体由三个结构域组成，即domain i、domain ii和domain iii[5]。其中domain i与昆虫取食蛋白后中肠上皮细胞膜上的孔洞形成有关，domain ii与昆虫中肠的特异性受体识别和结合有关，domain iii可能与维持蛋白分子完整性及和受体特异性结合相关[6-8]。bt cry毒素被昆虫摄取后首先在碱性肠道中溶解，然后被中肠蛋白酶活化成为具有杀虫作用的活性蛋白。昆虫中肠刷缘膜囊泡上的特异性受体依次在膜上结合和积累活化后的cry毒素，这些受体包括abc转运蛋白[9,10]，钙粘蛋白(cad)[11]，碱性磷酸酶(alp)[12]和氨肽酶(apn)[13]，与这些特定受体结合后，cry毒蛋白形成孔洞，破坏肠道细胞，最终导致害虫死亡[14]。bt毒素是转基因作物中使用的关键杀虫蛋白，具有巨大的农业、经济和环境优势。然而，昆虫对bt毒素产生的抗药性威胁了它们的持久有效性[15]。1985年，世界上首次报道了实验室种群印度谷螟(plodiainterpunctella)对bt产生抗性[16]，而小菜蛾是首个被报道在田间发现的对bt制剂产生抗性的昆虫，已成为研究bt抗性的模式昆虫。
3、bt毒素通过一系列复杂多步骤过程对目标害虫产生毒性作用，这些过程的任何变化都可能导致害虫产生耐药性。由此可见，特定毒素受体相互作用的改变可导致昆虫对bt毒素产生高水平的抗性。通过在抗性昆虫体内的定位克隆实验，首次发现abc转运蛋白可作为bt毒素的靶标[10]。cry1ac是bt毒素家族中研究最为广泛的，对多种鳞翅目害虫(如小菜蛾、棉铃虫、玉米螟、烟草天蛾等)具有高效的杀虫作用。近几年的生理生化研究发现，昆虫abc转运蛋白可作为bt毒素cry1ac的功能受体而发挥作用。其中abc转运蛋白abcc2被认为是cry1ac的最重要受体，abcc2基因的不同突变会导致对cry1ac产生高水平的抗性[10,17,18]，推测abcc2可能参与了促进cry1ac寡聚物插入膜的过程[19]。为应对其抗性问题，通过点突变来获得具有高杀虫活性的cry1ac蛋白是一种应对抗性的有效性策略[20,21]。由于cry1ac domainⅱ在受体结合中发挥作用，domainⅱ已成为改造的关键焦点。
4、参考文献：
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技术实现思路
1、为此,需要提供一种利用定点突变技术来构建具有高活性的cry1ac突变体,以提高杀虫效果。进一步的,所述的cry1ac蛋白突变体在防治害虫中的应用。
2、本发明提供一种高活性cry1ac突变体，其是在野生型cry1ac的氨基酸序列基础上存在f371q、n372e、i373q和i375q中的一种或多种突变而得到，所述野生型cry1ac的氨基酸序列参考ncbi登录号为aau87037.1。
3、优选地，其是在野生型cry1ac的氨基酸序列基础上存在f371q、n372e、i373q或i375q的突变而得到。
4、本发明提供编码所述的高活性cry1ac突变体的核酸，任选地其由ncbi登录号ay730621.1所示核苷酸序列为基础突变得到。
5、本发明进一步提供含有所述的核酸的表达载体。
6、本发明还提供含有所述核酸或所述的表达载体的重组宿主菌。
7、本发明进一步提供所述的高活性cry1ac突变体在制备防治昆虫的药物中的应用。
8、优选地，所述昆虫是鳞翅目害虫，具体地，所述昆虫是小菜蛾。
9、本发明还提供所述的高活性cry1ac突变体在防治昆虫中的应用。优选地，所述昆虫是鳞翅目害虫，具体地，其是小菜蛾。
10、本发明的有益效果是:本发明利用定点突变技术对关键氨基酸进行定点突变,构建了系列cry1ac突变体。将cry1ac蛋白氨基酸序列上371位点的苯丙氨酸(phe)突变成谷氨酰胺(gln),获得的突变体蛋白f371q相较干野生型对小菜蛾的毒力提高了4.5倍；将372位的天冬酰胺(asn)突变成谷氨酸(glu),获得的突变体蛋白n372e相较于野生型对小菜蛾的毒力提高了2.7倍；将373位的异亮氨酸(ile)突变成谷氨酰胺(gln),获得的突变体蛋白i373q相较于野生型对小菜蛾的毒力提高了6.3倍；以及将375位的异亮氨酸(ile)突变成谷氨酰胺(gln),获得的突变体蛋白i375q相较于野生型对小菜蛾的毒力也提高了3.4倍。本发明为cry毒素的改造提供理论指导,为昆虫的抗性治理提供新思路。
1.一种高活性cry1ac突变体，其特征在于，其是在野生型cry1ac的氨基酸序列基础上存在f371q、n372e、i373q和i375q中的一种或多种突变而得到，所述野生型cry1ac的氨基酸序列参考ncbi登录号为aau87037.1。
2.如权利要求1所述的高活性cry1ac突变体，其特征在于，其是在野生型cry1ac的氨基酸序列基础上存在f371q、n372e、i373q或i375q的突变而得到。
3.编码如权利要求1或2所述的高活性cry1ac突变体的核酸，任选地其由ncbi登录号ay730621.1所示核苷酸序列为基础突变得到。
4.含有权利要求3所述的核酸的表达载体。
5.含有如权利要求3所述核酸或如权利要求4所述的表达载体的重组宿主菌。
6.如权利要求1或2所述的高活性cry1ac突变体在制备防治昆虫的药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述昆虫是鳞翅目害虫。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述昆虫是小菜蛾。
9.如权利要求1或2所述的高活性cry1ac突变体在防治昆虫中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述昆虫是鳞翅目害虫，具体地，其是小菜蛾。
