本发明总体上涉及一种用于使用蛋白a色谱和电喷雾质谱仪表征至少一种蛋白质的方法和系统。
背景技术：
0、技术背景
1、基于蛋白质的生物制剂产品已作为用于治疗癌症、自身免疫性疾病、感染和心脏代谢病症的重要药物出现，并且它们代表医药工业中增长最快的产品类中的一种。
2、基于蛋白质的生物制剂产品必须满足非常高的纯度标准。存在几种生物制剂中发现的过程相关杂质和产品相关杂质。这些杂质不具有在活性、功效和安全性方面与所需产品相当的特性。一个实例是蛋白质的翻译后修饰(ptm)，其深刻影响与其治疗应用相关的蛋白质特性。与产品相比，这些杂质可表现出不同的作用模式和潜在的毒性或免疫原性。另外，它们可具有比产品更低的稳定性，这带来了更高的聚集和免疫原性风险。尽管最近取得进展，但仍然存在开发用于定量评估此类杂质的纯度测定方法的挑战。此外，用于双特异性抗体的分析方法开发中的关键挑战可在于，所述方法必须准确且可重现地检测相对于主要所需物质以2％或更低水平存在的杂质。因此，重要的是在药物开发和生产的不同阶段期间监测并表征此类杂质。尽管杂质对于生物学功能很重要，但是由于缺乏合适的方法，它们的大规模研究受到了阻碍。
3、用于纯度测定的分析方法必须显示出足够的准确性和分辨率，以检测和定量所需产品及其杂质。由于此类杂质与所需产品的结构和物理化学性质之间的相似性，因此很难评估杂质，例如抗体中的ptm和双特异性抗体中的同二聚体。直接分析此类杂质要求足够大量地分离所需产品以用于测定，这可能是不希望的，并且仅在所选定的情况下是可能的。
4、因此，本领域中长期迫切需要一种用于鉴别和定量基于蛋白质的生物制剂产品中的蛋白质杂质和/或所需产品的方法和/或系统。
技术实现思路
1、基于蛋白质的生物制剂产品的开发、制造和销售的增长导致对表征生物制剂产品中的活性药物成分和任何杂质存在的需求逐渐增加。
2、本文所公开的示例性实施方案通过提供用于使用蛋白a色谱和电喷雾质谱仪表征至少一种蛋白质的方法和系统来满足上述需求。
3、本公开至少部分地提供了一种用于鉴别样品中的蛋白质的方法。在一个示例性实施方案中，用于鉴别蛋白质的方法包括使包含所述蛋白质的样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述蛋白a色谱树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液，以及使用电喷雾电离质谱仪鉴别所述洗脱液中的所述蛋白质。
4、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法包括使样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述蛋白a色谱树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液，以及使用电喷雾电离质谱仪鉴别所述洗脱液中的所述蛋白质，其中所述色谱系统与电喷雾电离质谱仪耦接。
5、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法包括使样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述蛋白a色谱树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液，以及使用天然电喷雾电离质谱仪鉴别所述洗脱液中的所述蛋白质，其中所述色谱系统与天然电喷雾电离质谱仪耦接。
6、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使约10μg至约100μg的样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触。
7、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使用可与电喷雾电离质谱仪兼容的流动相洗涤蛋白a色谱树脂。
8、在一些特定的示例性实施方案中，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使用流动相洗涤蛋白a色谱树脂，其中流动相可选自乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合。
9、在一些特定的示例性实施方案中，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使用含有多至600mm总盐浓度的流动相洗涤蛋白a色谱树脂。
10、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使用流动相以0.2ml/min至0.4ml/min的流速洗涤蛋白a色谱树脂。
11、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使所述样品与具有带有另外的功能的蛋白a树脂的色谱系统接触，其中所述蛋白质可为抗体。
12、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使所述样品与具有蛋白a树脂的色谱系统接触，其中所述片段可为抗体的降解产物。
13、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使所述样品与具有蛋白a树脂的色谱系统接触，其中所述片段可为抗体的变体。
14、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使所述样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触，其中所述蛋白质为杂质。
15、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使所述样品与具有蛋白a树脂的色谱系统接触，其中所述蛋白质为双特异性抗体。
16、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使用质谱仪鉴别蛋白质，其中电喷雾电离质谱仪可以在天然条件下运行。
17、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使用质谱仪鉴别所述蛋白质，其中所述电喷雾电离质谱仪可为串联质谱仪。
18、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使用质谱仪鉴别所述蛋白质，其中所述电喷雾电离质谱仪可为串联质谱仪。
19、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使用质谱仪鉴别蛋白质，其中电喷雾电离质谱仪可为纳米电喷雾电离质谱仪。
20、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使用具有至少两个路径的分流器将色谱系统与电喷雾电离质谱仪流体连接，以将电喷雾电离质谱仪耦接至色谱系统。
21、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使用具有至少两个路径的分流器将色谱系统与紫外光检测器流体连接。
22、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括使用具有至少两个路径的分流器将色谱系统与紫外光检测器流体连接。
23、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法包括使样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述蛋白a色谱树脂以提供洗脱液，其中所述洗脱液可以引入在电喷雾电离质谱仪中，其中来自电喷雾电离的电喷雾的流速为约10nl/min至约50nl/min。
24、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法包括使样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述蛋白a色谱树脂以提供洗脱液，其中通过洗涤蛋白a色谱树脂来提供的洗脱液引入在电喷雾电离质谱仪中，其中电喷雾的喷雾电压为约0.8kv至约1.5kv。
25、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可以包括与样品接触，其中所述样品可包含至少两种蛋白质。
26、在此实施方案的一个方面，用于鉴别样品中的蛋白质的方法可包括与样品接触，其中所述样品可经历选自由以下组成的组的条件：过氧化氢、氧化、加热、紫外光、冷白光或其组合。
27、本公开至少部分地提供了一种用于定量样品中的蛋白质的方法。在一个示例性实施方案中，用于定量样品中的蛋白质的方法包括使包含所述蛋白质的样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述蛋白a色谱树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液，以及使用电喷雾电离质谱仪定量所述洗脱液中的所述蛋白质。
28、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法还可定量样品中的蛋白质的相对丰度。
29、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法包括使样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述蛋白a色谱树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液，以及使用电喷雾电离质谱仪定量所述洗脱液中的所述蛋白质，其中所述色谱系统与电喷雾电离质谱仪耦接。
30、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使约10μg至约100μg的样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触。
31、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使用可与电喷雾电离质谱仪兼容的流动相洗涤蛋白a色谱树脂。
32、在一些特定的示例性实施方案中，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使用流动相洗涤蛋白a色谱树脂，其中流动相可选自乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合。
33、在一些特定的示例性实施方案中，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使用含有多至600mm总盐浓度的流动相洗涤蛋白a色谱树脂。
34、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使用流动相以0.2ml/min至0.4ml/min的流速洗涤蛋白a色谱树脂。
35、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使所述样品与具有带有另外的功能的蛋白a树脂的色谱系统接触，其中所述蛋白质可为抗体。
36、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使所述样品与具有蛋白a树脂的色谱系统接触，其中所述片段可为抗体的降解产物。
37、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使所述样品与具有蛋白a树脂的色谱系统接触，其中所述片段可为抗体的变体。
38、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使所述样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触，其中所述蛋白质为杂质。
39、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使所述样品与具有蛋白a树脂的色谱系统接触，其中所述蛋白质可为双特异性抗体。
40、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使用质谱仪鉴别蛋白质，其中电喷雾电离质谱仪可以在天然条件下运行。
41、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使用质谱仪鉴别所述蛋白质，其中所述电喷雾电离质谱仪可为串联质谱仪。
42、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使用质谱仪鉴别所述蛋白质，其中所述电喷雾电离质谱仪可为串联质谱仪。
43、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使用质谱仪鉴别蛋白质，其中电喷雾电离质谱仪可为纳米电喷雾电离质谱仪。
44、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使用具有至少两个路径的分流器将色谱系统与电喷雾电离质谱仪流体连接，以将电喷雾电离质谱仪耦接至色谱系统。
45、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使用具有至少两个路径的分流器将色谱系统与紫外光检测器流体连接。
46、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括使用具有至少两个路径的分流器将色谱系统与紫外光检测器流体连接。
47、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法包括使样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述蛋白a色谱树脂以提供洗脱液，其中所述洗脱液可以引入在电喷雾电离质谱仪中，其中来自电喷雾电离的电喷雾的流速可为约10nl/min至约50nl/min。
48、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法包括使样品与具有蛋白a色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述蛋白a色谱树脂以提供洗脱液，其中通过洗涤蛋白a色谱树脂来提供的洗脱液引入在电喷雾电离质谱仪中，其中电喷雾的喷雾电压为约0.8kv至约1.5kv。
49、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可以包括与样品接触，其中所述样品可包含至少两种蛋白质。
50、在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的蛋白质的方法可包括与样品接触，其中所述样品可经历选自由以下组成的组的条件：去糖基化、氧化、加热、紫外光、冷白光或其组合。
51、本公开至少部分地提供了一种系统，其包括具有蛋白a色谱树脂的色谱柱和电喷雾电离质谱仪。
52、在一个示例性实施方案中，所述系统可包括能够在线耦接色谱柱的电喷雾电离质谱仪。
53、在此实施方案的一个方面，所述系统可包括具有蛋白a色谱树脂的色谱柱，其中所述色谱柱能够接收流动相和包含蛋白质的样品。
54、在此实施方案的一个方面，所述系统可包括能够使用分流器耦接至紫外光检测器的色谱柱。
55、在此实施方案的一个方面，所述系统可包括能够使用具有至少三个路径的分流器耦接至紫外光检测器的色谱柱。
56、在此实施方案的一个方面，所述系统可包括能够在天然条件下运行的电喷雾电离质谱仪。
57、在此实施方案的一个方面，所述系统可包括能够在天然条件下运行的纳米电喷雾电离质谱仪。
58、在此实施方案的一个方面，所述系统可包括具有蛋白a色谱树脂的色谱柱和电喷雾电离质谱仪，其中所述系统能够鉴别蛋白质。
59、在此实施方案的一个方面，所述系统可包括具有蛋白a色谱树脂的色谱柱和电喷雾电离质谱仪，其中所述系统可能够对单克隆抗体变体的蛋白a亲和力进行排序。
60、在此实施方案的一个方面，所述系统可包括具有蛋白a色谱树脂的色谱柱和电喷雾电离质谱仪，其中所述蛋白a色谱树脂和电喷雾电离质谱仪可以与选自乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合的流动相兼容。
61、在此实施方案的一个方面，所述系统可包括具有蛋白a色谱树脂的色谱柱，其中所述色谱柱可用流动相以0.2ml/min至0.4ml/min的流速进行洗涤。
62、在此实施方案的一个方面，所述系统能够对单克隆抗体变体的蛋白a亲和力进行排序。
1.一种用于鉴别至少一种蛋白质的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述电喷雾电离质谱仪在线耦接至具有所述蛋白a色谱树脂的色谱系统。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述电喷雾电离质谱仪为纳米电喷雾电离质谱仪。
4.如权利要求1所述的方法，其中使用具有至少两个路径的分流器将所述电喷雾电离质谱仪耦接至具有所述蛋白a色谱树脂的所述色谱系统。
5.如权利要求1所述的方法，其中使用具有至少两个路径的分流器将紫外光检测器耦接至具有所述蛋白a色谱树脂的所述色谱系统。
6.如权利要求1所述的方法，其中用于洗涤尺寸排阻色谱树脂的所述流动相包含乙酸铵。
7.如权利要求1所述的方法，其中用于洗涤尺寸排阻色谱树脂的所述流动相包含挥发性盐。
8.如权利要求1所述的方法，其中用于洗涤所述蛋白a色谱树脂的所述流动相具有约0.2ml/min至约0.4ml/min的流速。
9.如权利要求1所述的方法，其中与所述色谱系统接触的包含所述蛋白质的所述样品的量为约10μg至约100μg。
10.如权利要求1所述的方法，其中通过洗涤所述蛋白a色谱树脂提供的所述洗脱液引入到所述电喷雾电离质谱仪中，其中来自所述电喷雾电离的电喷雾的流速为约10nl/min至约50nl/min。
11.如权利要求1所述的方法，其中通过洗涤所述蛋白a色谱树脂提供的所述洗脱液引入到所述电喷雾电离质谱仪中，其中电喷雾的喷雾电压为约0.8kv至约1.5kv。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质为单克隆抗体。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质为产品相关杂质。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质为双特异性抗体。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质为杂质。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质为单克隆抗体变体。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含至少两种蛋白质。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质具有翻译后修饰。
19.如权利要求1所述的方法，其中使所述样品经受选自由以下组成的组的条件：去糖基化、氧化、加热、紫外光、冷白光或其组合。
20.一种系统，其包括：
21.如权利要求20所述的系统，其中所述色谱柱还能够使用具有至少三个路径的分流器耦接至紫外光检测器。
22.如权利要求20所述的系统，其中所述电喷雾电离质谱仪为纳米电喷雾电离质谱仪。
23.如权利要求20所述的系统，其中所述系统能够鉴别所述蛋白质。
24.如权利要求20所述的系统，其中所述系统能够对单克隆抗体变体的蛋白a亲和力进行排序。
25.一种用于表征至少一种蛋白质的方法，所述方法包括：
