本发明属于医药，具体涉及一种用于生产人骨形态发生蛋白的细胞培养方法。
背景技术：
1、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，bmp)是转化生长因子-β(transforming growth factor-β，tgf-β)超家族的成员。其通过与间充质干细胞(mesenchymal stem cells，msc)表面的受体结合，促进其分化为软骨细胞和成骨细胞。近年来的研究表明，bmp在骨骼和软组织再生中起着重要作用。局部给予bmp可以支持新骨、软骨和韧带的形成。其中，含有bmp家族成员bmp2的产品在美国、欧盟、中国获批上市应用于在退行性椎间盘疾病中促进脊柱融合，如(2002年于欧盟获批)、infusetm bonegraft/lt-cagetm(2002年于美国以器械获批)和infuse bone graft(2023年于中国获批)，含有bmp7的产品在美国和欧盟获批上市，如op-1tm putty(2004年于美国以器械获批)、(2009年于欧盟获批)、但已因商业原因于2015年退市。bmp6也是bmp家族的成员之一，具有促进骨形成和加速骨愈合的效果，含有重组人骨形态发生蛋白6(rhbmp6)的用于促进脊柱融合的候选药物已处于三期临床试验阶段。
2、为支持开展三期临床试验及该候选药物获批上市后的商业化生产，采取具有高生产效率、具有工艺稳定性、满足药品监管要求、且满足大规模生产的培养方式尤为重要。近年来，重组蛋白工业化生产领域的主流细胞培养方法包括分批培养、补料分批培养、半连续培养、连续培养和灌流培养等。分批培养是指在密闭反应器中将细胞放入一定量的培养基中，在没有补充新鲜培养基或移除代谢废物的情况下，进行一段时间的培养。分批培养的过程中，细胞和培养基的成分会随着时间的推移而变化。在培养过程中，细胞所处的环境变化显著，无法始终保持最佳状态。在后期，代谢副产物的积累会影响细胞生长，导致细胞产量降低。补料分批培养从固定量的培养基开始，随着细胞生长和产物形成，不断向系统中添加营养物质，使细胞继续生长和代谢，直到培养结束。半连续培养基于分批培养原则，定期移除部分培养液并补充等量的新鲜培养基。连续培养在非封闭系统中持续添加新鲜营养液，移除抑制因子，优化生长环境，并收集培养产物。灌流培养则是在细胞大部分留在反应器中的情况下，持续移除部分条件培养基并灌入新鲜培养基。
3、使用哺乳动物细胞表达重组蛋白的过程中，实现批间稳定性面临诸多挑战。细胞培养过程中的温度、ph值、溶氧水平等条件的变化会导致批次之间存在的差异，对细胞的代谢和重组蛋白的表达有显著影响。在长时间的细胞培养过程中，代谢物的累积可能会影响细胞的健康状况和蛋白质的表达水平，对产品质量带来无法预期的影响。此外，从实验室规模放大至工业化生产时，还面临着规模放大效应的问题，在实验室中可行的工艺在大规模生产时可能会变得复杂，例如，反应条件的控制、热量的管理、混合效率等问题在规模扩大时变得更加显著；实验室设备和工业设备存在差异，选择适合的工业设备将实验室的工艺转移到工业生产是一个挑战；此外，实验室小规模生产和工业大规模生产之间的差异会影响细胞生长和蛋白表达的稳定性，在大规模生产中，确保每一批产品的质量和特性稳定是一个难题。
4、半连续、连续培养和灌流培养由于能稳定提供新鲜营养并移除废物，不仅可以补充养分，而且可以起到缓解产物抑制和减少代谢副产物积累的作用，从而可以改善培养环境，有助于保持细胞活力的稳定，有利于产物的继续合成，因此受到青睐。例如，连续培养方法被证明能够优化生长条件并增强分泌型重组治疗药物的生产(cn114127260a)。灌流培养通过持续注入新鲜培养基并移除废旧培养基，解决了蛋白质量不稳定和低表达的问题，提高了生产效率(cn112592948b)。半连续、连续培养和灌流培养在提高重组蛋白产量、为细胞提供较为稳定的培养环境、减少批次间的变异、提高产品的一致性和质量等方面具有优势，是目前重组蛋白类药物和抗体类药物的主要的规模化生产工艺。
5、尽管半连续和灌流培养方法被公认为更高效，并且被优先考虑应用，但在实际培养过程中，这两种方法用于生产rhbmp6时却存在批间不稳定和蛋白表达量低的问题。因此，仍然缺乏批间稳定性以及蛋白表达量和表达效率满足工业生产要求的rhbmp6工业生产培养方法。
技术实现思路
1、由于半连续和灌流培养生产rhbmp6存在上述缺陷，无法满足工业化生产的需求，故需要探索更优的培养方法。在此过程中，本技术发明人意外地发现，分批培养反而是适宜于rhbmp6工业化生产的有效方法。具体而言，在密闭反应器中分批培养工程细胞株，通过合理的培养条件，可维持高细胞活率，获得高蛋白产量，并且即使放大至2000升，依然能够保持良好的批间稳定性。使得分批培养在rhbmp6的工业化生产中具有特别的优势，提供了一种高效且可扩展的生产方法。
2、因此，本发明提供了一种综合方法，用于在受控的细胞培养系统中通过分批培养生产重组人骨形态发生蛋白6(rhbmp6)。该方法涵盖细胞培养的各个阶段，包括细胞复苏、种子培养、生产培养、收获和蛋白纯化。
3、其中，所述rhbmp6包含seq id no:1:sassrrrqqsrnrstqsqdvarvssasdynsselktacrkhelyvsfqdlgwqdwiiapkg yaanycdgecsfplnahmnatnhaivqtlvhlmnpeyvpkpccaptklnaisvlyfddns nvilkkyrnmvvracgch。
4、本发明提供了一种生产重组人骨形态发生蛋白6(rhbmp6)的方法，所述方法为分批培养的方法。
5、在一些实施方案中，本发明所述的生产重组人骨形态发生蛋白6(rhbmp6)方法为分批培养的方法；所述方法在培养过程中rhbmp6的蛋白的产量不少于7.6mg/l，优选不少于7.7mg/l，更优选不少于8.3mg/l，更优选不少于8.5mg/l，更优选不少于8.8mg/l，更优选不少于9.1mg/l。
6、在一些实施方案中，所述方法包括种子培养：在细胞培养基中接种表达重组人骨形态发生蛋白6的细胞，获得种子培养液。
7、在一些实施方案中，所述方法包括生产培养：在细胞培养基中接种种子培养液，培养5-15天或细胞活率下降，收获细胞培养液。
8、在一些实施方案中，所述种子培养为一级或多级种子培养。
9、在一些实施方案中，所述生产培养中，包括降温步骤；所述降温步骤包括培养1-4天后进行降温处理。
10、在一些实施方案中，所述降温步骤包括：培养1-4天后降温3-7℃。
11、在一些实施方案中，所述降温步骤包括：设置初始温度为36-38℃、培养1-4天后进行降温处理，设置降温后的温度为31-33℃。
12、在一些实施方案中，所述生产培养中，ph为6至8。
13、在一些实施方案中，所述生产培养中，溶解氧do(％)为10-100。
14、在一些实施方案中，所述表达重组人骨形态发生蛋白6的细胞为中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
15、在一些实施方案中，所述种子培养的培养体积选自250ml、500ml、1l、2l、15l、50l、200l、500l中的一种或多种。
16、在一些实施方案中，所述种子培养的时间为24-96h，更优选地，所述种子培养的时间为24-72h。
17、在一些实施方案中，所述生产培养的培养体积选自50l、200l、500l、2000l中的一种或多种。
18、在一些实施方案中，所述重组人骨形态发生蛋白6的产量不少于7.6mg/l，7.7mg/l，更优选不少于8.3mg/l，更优选不少于8.5mg/l，更优选不少于8.8mg/l，更优选不少于9.1mg/l。
19、在一些实施方案中，生产培养的接种密度为0.50×106-0.90×106个细胞/ml；优选0.70×106个细胞/ml。
20、在一些实施方案中，培养3-4天后进行降温处理，更优选地，培养3天后进行降温处理。
21、在一些实施方案中，所述初始温度和降温后的温度的温差为3.5-6.0℃，更优选为3.8-5.8℃。
22、在一些实施方案中，所述初始温度为36.3-37.3℃，更优选地，所述降温温度为36.8℃。
23、在一些实施方案中，所述降温后的温度为31.5-32.5℃，更优选地，所述降温温度为32℃。
24、在一些实施方案中，所述ph为6.65-7.15，更优选为6.90。
25、在一些实施方案中，所述溶解氧do(％)为20-80，更优选为20-70，更优选为20-60，更优选为40。
26、在初步研究和实验室规模生产中，通过一系列优化措施和工艺改进，建立了一种稳定且高效的生产体系。在这些基础上，本发明进一步将这些优化的工艺条件成功应用于更大规模的生产中。通过精确控制生物反应器中的温度、co2水平、溶解氧和搅拌速度等关键参数，实现了从实验室规模向工业规模生产的无缝过渡。
27、在一些实施方案中，所述一级或多级种子培养分别在逐级放大的摇瓶或生物反应器中培养细胞。
28、在一些实施方案中，通过调整种子培养阶段的参数进行放大培养。
29、在一些实施方案中，根据所述生物反应器或摇瓶体积调整搅拌速度以保持相似的剪切条件。
30、在一些实施方案中，当所述培养体积为2l时，搅拌速度在240-260rpm范围内，更优选为250rpm。
31、在一些实施方案中，当所述培养体积为500l时，搅拌速度在65-75rpm范围内，更优选为70rpm。
32、在一些实施方案中，当所述培养体积为2000l时，搅拌速度在40-60rpm范围内，更优选为50rpm。
33、在一些实施方案中，co2分压保持在20-80mmhg范围内，更优选为30-60mmhg范围内。
34、在一些实施方案中，所述种子培养和/或生产培养使用的细胞培养基中含有硫酸葡聚糖钠盐。
35、在一些实施方案中，所述硫酸葡聚糖钠盐(dss)的浓度为2mg/l-2g/l。
36、在一些实施方案中，所述硫酸葡聚糖钠盐(dss)的浓度为2mg/l-20mg/l。
37、在一些实施方案中，所述硫酸葡聚糖钠盐的浓度为2mg/l-2g/l，优选2mg/l-20mg/l。
38、在一些实施方案中，所述种子培养和/或生产培养过程中使用的细胞培养基包含选自以下的一种或多种基础培养基：dmem、rpmi-1640，或其他专门为cho细胞培养设计的细胞培养基。
39、在一些实施方案中，所述专门为cho细胞培养设计的细胞培养基选自以下的一种或多种prochotm-5agt、cho、acticho p、balancd cho、cd opticho或ex-cell cdcho中的一种或多种。
40、在一些实施方案中，所述专门为cho细胞培养设计的细胞培养基为prochotm-5agt。
41、在一些实施方案中，所述种子培养和/或生产培养过程中使用的细胞培养基进一步包含以下一种或多种成分：生长因子、缓冲剂、ph调节剂、dna合成促进剂或表面活性剂；
42、在一些实施方案中，所述生长因子选自类胰岛素生长因子，更优选地，所述生长因子为重组人胰岛素。
43、在一些实施方案中，所述缓冲剂选自缓冲盐、hepes或mops，更优选地，所述缓冲剂选自碳酸氢钠或hepes。
44、在一些实施方案中，所述ph调节剂选自氢氧化钠或氢氧化钾，更优选地，所述ph调节剂为氢氧化钠。
45、在一些实施方案中，所述dna合成促进剂选自嘌呤化合物或核苷酸，更优选地，所述dna合成促进剂选自次黄嘌呤或胸苷。
46、在一些实施方案中，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂，更优选地，所述表面活性剂为泊洛沙姆188。
47、本发明另一方面提供了一种用于培养表达重组人骨形态发生蛋白6(rhbmp6)细胞的细胞培养基。
48、在一些实施方案中，所述细胞培养基用于培养表达重组人骨形态发生蛋白6的细胞，所述细胞培养基用于实施上述方法。
49、其中，所述重组人骨形态发生蛋白6包含seq id no:1所示的氨基酸序列。
50、在一些实施方案中，所述细胞培养基的ph范围为ph为6至8，优选为6.65至7.15，更优选为6.90。
51、在一些实施方案中，所述培养基包含从dmem、rpmi-1640或其他专门为cho细胞培养设计的商业细胞培养基中选择的基础培养基。
52、在一些实施方案中，所述专门为cho细胞培养设计的商业细胞培养基选自prochotm-5agt(lonza)、cho(merck)、acticho p(ge healthcare lifesciences)、balancd cho(irvine scientific)、cd opticho或ex-cell cd cho。
53、在一些实施方案中，所述专门为cho细胞培养设计的商业细胞培养基为prochotm-5agt。
54、在一些实施方案中，所述细胞培养基具有用于生产rhbmp6的优化用量。
55、在一些实施方案中，所述基础培养基的浓度为10-50g/l，更优选为20g/l。
56、在一些实施方案中，所述生长因子的浓度为2-20mg/l，更优选为10mg/l。
57、在一些实施方案中，所述缓冲剂的浓度为1-5g/l，更优选为2g/l。
58、在一些实施方案中，所述ph调节剂的浓度为1-10g/l，更优选为2g/l。
59、在一些实施方案中，所述dna合成促进剂的浓度为0.05-0.2mm，更优选为0.1mm。
60、在一些实施方案中，所述核苷酸的浓度为0.01-0.05mm，更优选为0.02mm。
61、在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为0.1-2g/l，更优选为1g/l。
62、在一些实施方案中，所述细胞培养基的ph范围为6.8至7.0，更优选为6.9。
63、在细胞培养过程中，ph值的控制对于细胞的生长和蛋白的表达至关重要。不同的ph值会显著影响细胞的代谢活动、营养物质的吸收以及最终产物的质量和产量。为了确保最佳的培养环境，本发明特别针对ph值进行了系统的优化研究。
64、研究表明，细胞培养基的ph范围为6.65至7.15时，可以提供一个稳定且有利于细胞生长的环境。过低或过高的ph值都会对细胞的代谢活动产生不利影响，从而降低蛋白产量和质量。通过实验数据和实际生产经验，本发明确定了ph值范围在6.65至7.15之间为最适合的条件。实验结果显示，在ph值为6.65至7.15的范围内，细胞的生长曲线和蛋白表达量均表现出最佳状态。在6.8至7.0范围内，特别是6.9，细胞密度和活率在整个培养周期中保持稳定，代谢产物(如乳酸)的积累也被有效控制。这一优化措施显著提高了生产过程的效率和产品的一致性，为工业化规模生产提供了坚实的基础。
65、在一些实施方案中，所述细胞培养基进一步包含用于增强蛋白表达的添加剂，所述添加剂选自肝素、硫酸软骨素、透明质酸、聚乙二醇(peg)、ficoll、琼脂或硫酸葡聚糖钠盐(dss)。
66、在一些实施方案中，所述的方法中的细胞复苏步骤包括：
67、在36.5-37.5℃的水浴中解冻工程细胞株；
68、将解冻后的细胞悬液加入预热的基础培养基中；
69、离心去除上清后，将细胞重悬于在摇床上预热的培养基中；
70、将悬液转移至含有培养基的摇瓶中，在36.5-37.5℃下培养24-72小时。
71、在一些实施方案中，所述的方法中的种子培养步骤包括：
72、以0.50×106-0.90×106个细胞/ml的密度将细胞接种至摇瓶或细胞培养袋中；
73、在36.3-37.3℃、5％ co2、80％湿度、120rpm下培养24-72小时；
74、当细胞活率低于90％时，进行离心扩种。
75、在细胞培养过程中，溶解氧do(％)的控制至关重要。为了确保最佳的细胞生长环境，本发明对溶解氧do(％)参数进行了精确控制和优化。通过实验数据分析，确定了溶解氧在10-100范围内的最佳控制区间，优选为20-80，更优选为20-70，更优选为20-60，更优选为40，尤其是将do(％)保持在20-60之间，最优值为40时，达到最佳的细胞生长和蛋白表达效果。
76、在一些实施方案中，所述的方法中的生产培养包括如下步骤：
77、i.初始温度为36.3-37.3℃，优选为36.5-37.0℃，更优选为36.8℃；培养3天；
78、ii.3天后将温度调整至31.5-32.5℃，优选为32℃，并继续培养至第7-8天或细胞活率下降到75％以下。
79、rhbmp6本发明的方法在实现rhbmp6在工业化及规模化生产中的批间稳定性以及蛋白表达量和表达效率方面取得了显著进展，特别是通过采用合适的分批培养技术提高了rhbmp6规模化生产的重现性和可扩展性。这种方法解决了以rhbmp6为主要活性成分的一类创新药物在研发、生产中面临的关键挑战，特别是在生物制药领域，工艺稳定性和高效放大操作的能力对于获得监管机构批准及新药研发成功至关重要。以下是本技术解决方案所取得的各种进步的详细说明。
80、本发明的方法在以下几个方面表现出以下创新和改进：
81、本发明成功建立了适宜于rhbmp6工业化生产的有效方法，解决了rhbmp6规模化放大生产中的批间稳定性差、表达量相对较低的问题，填补了该蛋白难以进行工业化生产的技术空缺，取得了预料不到的技术效果。进一步地，本发明通过逐级扩大生产规模，采用合理的分批培养培养条件(如溶氧、温度和ph)，优化细胞的代谢活动和生产效率，确保细胞在规模化生产过程中，在关键阶段达到最优的生长和蛋白表达条件，提高了蛋白表达的批间稳定性，确保了稳定的产品质量，实现了从实验室规模到工业规模中均能保持细胞代谢和重组蛋白表达的稳定性，满足了药品监管审批的需求。目前采用分批培养生产rhbmp6已完成临床二期研究，正处于临床三期研究阶段。
82、进一步地，通过在培养体系中添加适量的硫酸葡聚糖钠盐(dss)，显著提高了蛋白产量并维持了培养后期细胞的高活率，确保了细胞在放大过程中始终处于最佳生长条件，实现了在不复杂化培养过程的情况下提高蛋白产量。通过改变温度条件，在蛋白表达过程中降低温度，减少了乳酸等代谢副产物的产生，实现了细胞活率和的有效提升。
83、同时，本发明提高了分批培养操作的成本效率，通过提高每批次的稳健性和产量，总体生产成本得以降低。在提高分批培养的重现性和可扩展性方面取得了显著进展。这一方法不仅满足了生物制药生产的严格标准，还为行业优化其生物加工操作提供了实用且高效的解决方案。重现性确保了每批次都达到相同的高质量和高效能标准，而改进的可扩展性允许从研究到商业规模生产的无缝过渡。
1.一种生产重组人骨形态发生蛋白6的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生产培养中，包括降温步骤；所述降温步骤包括培养1-4天后进行降温处理；
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达重组人骨形态发生蛋白6的细胞为中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述种子培养的培养体积选自250ml、500ml、1l、2l、15l、50l、200l、500l中的一种或多种；
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，培养3-4天后进行降温处理，更优选地，培养3天后进行降温处理；
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中，通过调整生产培养阶段的参数对生物反应器体积进行放大；
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中，所述种子培养和/或生产培养使用的细胞培养基中含有硫酸葡聚糖钠盐；
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述种子培养和/或生产培养使用的细胞培养基包含选自以下的一种或多种基础培养基：dmem、rpmi-1640，或其他专门为cho细胞培养设计的细胞培养基；
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述种子培养和/或生产培养使用的细胞培养基进一步包含以下一种或多种成分：生长因子、缓冲剂、ph调节剂、dna合成促进剂或表面活性剂；
10.一种细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基用于培养表达重组人骨形态发生蛋白6的细胞，所述细胞培养基为如权利要求7至9中任一项所述的细胞培养基；优选地，所述培养基用于权利要求1-9任一项所述的方法。
