本发明属于基因工程领域，涉及一种工程菌及应用，尤其涉及一种具有过表达尿素酶能力的工程菌及在发酵聚赖氨酸时的应用。
背景技术：
1、ε-聚赖氨酸（ε-poly-l-lysine，ε-pl）是25～35个l-赖氨酸单体通过α-cooh和ε-nh2缩合形成的多阳离子同型氨基酸聚合物，由于在主链上存在许多游离氨基，使其在酸性到弱碱性环境中表现出多阳离子特性。这一特性使它对大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌、酵母以及一些病毒具有很强的抗菌活性。因此，ε-pl与乳酸链球菌素和纳他霉素并称为三大生物来源天然食品防腐剂。
2、近年来，人们对食品健康地要求越来越高，国家对食品领域的关注度也与日俱增，天然防腐剂的市场前景十分广阔，因此，通过野生菌株筛选和育种提高其ε-pl发酵水平至关重要。目前，ε-pl产生菌育种策略主要分为三类：传统诱变育种、核糖体工程、基因组重排和基因工程育种。要开发育种策略，以提高育种水平，实现ε-pl产量大幅增加。王开方等研究 s. albulus m-z18存在尿素酶系统，并且能够通过分解尿素使环境ph升高进而促进菌体的生长。尿素酶可以催化尿素水解，产生氨和二氧化碳。此时，nh3的产生可以通过与细胞内的质子结合生成nh4+减轻酸性压力。因此，推测在小白链霉菌中，尿素酶可能参与氮代谢和氨基酸合成等过程。过表达尿素酶基因意味着在小白链霉菌中增加了尿素酶的合成量。这可能会导致细胞内氨和二氧化碳的浓度增加，从而影响细胞的代谢平衡。潘龙等通过构建不同耐酸系统敲除菌株，证明了尿素酶系统是 s. albulus m-z18中主要的耐酸系统，并证明尿素酶基因是ε-pl中的关键基因，可通过尿素酶基因过表达探究其调控作用。
技术实现思路
1、为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种为高效生产ε-pl提供了新的思路的具有过表达尿素酶能力的工程菌及在发酵聚赖氨酸时的应用。
2、为了实现上述目的，本发明采取下述技术方案：
3、一株具有过表达尿素酶能力的工程菌，其特征在于：所述具有过表达尿素酶能力的工程菌是以小白链霉菌ifo 14147为表达宿主，过表达了来源于小白链霉菌ifo 14147的尿素酶 ure。
4、优选地，本发明所采用的尿素酶 ure的基因序列如seq id no.1所示。
5、优选地，本发明所采用的具有过表达尿素酶能力的工程菌是采用pib139为表达载体。
6、具有过表达尿素酶能力的工程菌的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤：
7、1）获取小白链霉菌ifo 14147表达的尿素酶 ure的基因；所述尿素酶 ure的基因序列如seq id no.1所示；
8、2）基于步骤1）获取得到的尿素酶 ure的基因构建重组质粒；所述重组质粒的载体是pib139；
9、3）将步骤2）构建的重组质粒通过热激法导入大肠杆菌et12567中，得到含有重组质粒的大肠杆菌et12567；将含有重组质粒的大肠杆菌et12567在培养基中培养后，得到大肠杆菌菌液；
10、4）制备小白链霉菌ifo 14147孢子悬浮液；
11、5）基于步骤3）制备得到的大肠杆菌菌液以及步骤4）制备得到的孢子悬浮液制备形成结合子；
12、6）对结合子筛选后，得到具有过表达尿素酶能力的工程菌。
13、优选地，本发明所采用的步骤2）的具体实现方式是：
14、2.1）对步骤1）获取的小白链霉菌ifo 14147表达的尿素酶 ure的基因进行pcr扩增；
15、2.2）选取ecor i与nde i作为酶切位点，将质粒pib139双酶切后进行片段纯化得到线性质粒片段；
16、2.3）将线性质粒片段与步骤2.1）扩增得到的 ure基因连接；
17、2.4）将经过步骤2.3）连接后的产物转入dh5ɑ感受态中，过夜培养，对培养产物提取质粒后进行双酶切验证，将验证正确的产物作为重组质粒。
18、优选地，本发明所采用的步骤2.1）中扩增时所用的引物是：
19、oeure-f：ggttggtaggatccacatatgatgcaactgaccccgcatg；
20、oeure-r：ctatgacatgattacgaattctcagaagaggaagtaccgctgg。
21、优选地，本发明所采用的步骤4）的具体实现方式是：
22、4.1）用接种环刮取btn平板上的小白链霉菌ifo 14147孢子至装有30ml无菌水和玻璃珠的250ml三角瓶中；
23、4.2）置于30℃、在200rpm 摇中震荡培养20min，将刮取的孢子打散；
24、4.3）在注射器中用两层纱布包裹脱脂棉过滤孢子，除去菌丝；
25、4.4）在7500rpm的条件下离心5min，弃上清，得到链霉菌孢子沉淀；
26、4.5）将1ml 2yt培养基加入到步骤4.4）制备得到的链霉菌孢子沉淀中，使用漩涡振荡器使孢子打散，在50℃下热激10min；
27、4.6）在200 rpm的条件下震荡培养2 h，得到小白链霉菌ifo 14147孢子悬浮液。
28、优选地，本发明所采用的步骤5）的具体实现方式是：
29、5.1）将步骤3）制备得到的大肠杆菌菌液以及步骤4）制备得到的小白链霉菌ifo14147孢子悬浮液按5：1的比例混合，得到混合菌液；
30、5.2）将步骤5.1）得到的混合菌液涂布在含有10 mm mgcl2的ms培养基平板上，放于30℃培养箱中培养18-20h；
31、5.3）在步骤5.2）的培养基平板上涂布终浓度是50 μg/ml安普霉素以及终浓度是25 μg/ml的萘啶酮酸，在30℃继续培养3~5 d，得到结合子。
32、优选地，本发明所采用的步骤6）的具体实现方式是：
33、用牙签挑取单菌落涂布至含50 mg/l安普霉素的btn平板上传代培养，筛选并获得具有过表达尿素酶能力的工程菌。
34、基于前述的具有过表达尿素酶能力的工程菌在发酵时的应用，尤其是在发酵ε-聚赖氨酸时的应用。
35、本发明的优点是：
36、本发明提供了一种具有过表达尿素酶能力的工程菌及在发酵聚赖氨酸时的应用，其核心思想是将尿素酶基因在小白链霉菌ifo 14147中进行过表达，最终发酵并高产ε-pl。经检测，采用本发明所提供的工程菌发酵得到的ε-pl产量相比于对照菌株发酵提高18.6%。本发明为发酵法高效生产ε-pl提供了一种新思路，在ε-pl发酵中的应用提供了理论依据。
1.一株具有过表达尿素酶能力的工程菌，其特征在于：所述具有过表达尿素酶能力的工程菌是以小白链霉菌ifo 14147为表达宿主，过表达了来源于小白链霉菌ifo 14147的尿素酶ure。
2.根据权利要求1所述的具有过表达尿素酶能力的工程菌，其特征在于：所述尿素酶ure的基因序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求2所述的具有过表达尿素酶能力的工程菌，其特征在于：所述具有过表达尿素酶能力的工程菌是采用pib139为表达载体。
4.针对权利要求1或2或3所述的具有过表达尿素酶能力的工程菌的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2）的具体实现方式是：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2.1）中扩增时所用的引物分别如seq id no.2以及seq id no.3所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤4）的具体实现方式是：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤5）的具体实现方式是：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤6）的具体实现方式是：用牙签挑取单菌落涂布至含50 mg/l安普霉素的btn平板上传代培养，筛选并获得具有过表达尿素酶能力的工程菌。
10.基于权利要求1或2或3所述的具有过表达尿素酶能力的工程菌在发酵时的应用，尤其是在发酵ε-聚赖氨酸时的应用。
