本发明属于植物基因工程，尤其涉及大豆内源基因启动子、表达载体及外源基因表达中的应用。
背景技术：
1、大豆以种子为主要生产应用的对象，是不可替代的植物蛋白和油料来源。种子是农业发展的核心。目大豆的单产有待提升，为满足急剧增长的油脂和饲料需求，利用以转基因技术为核心的生物育种通过遗传改良和基因工程，能够提高作物产量、降低农业生产的风险。
2、转基因技术是作物功能基因组研究和遗传改良的一种有价值的方法，农业上利用转基因技术在增产、减少病虫草害损失、减少化学杀虫剂使用、节省人工成本等方面发挥了不可替代的作用。目前，转基因大豆研究是现有技术大豆育种研究的热点，现有技术已成功将转基因大豆作为推动大豆产业化生产和发展的动力，由于转基因带来的巨大经济效益，以耐除草剂和抗虫为主的转基因大豆的种植规模逐年增加。
3、随着大豆生物育种产业化逐步扩大，转基因品种越来越多，而转基因产品的安全性是转基因产业化的基础和前提。目前，现有技术转基因大豆品种利用来源于病毒的35s启动子来驱动基因的表达，在制备转基因材料中容易出现转基因安全问题。另外，在同一个转基因事件中使用同一启动子可能会造成转基因的沉默现象，影响基因的表达效果。因此，挖掘替代来源于病毒的35s启动子的高效表达的内源启动子对于大豆转基因品种的培育和产业化是十分必要的。
4、持家基因是所有细胞中均稳定表达的一类基因，受环境因素影响较小，在个体的各个生长阶段或几乎全部组织中持续表达。根据大豆品种williams82的rna测序数据筛选到了20个大豆中表达较高的持家候选基因，开发大豆持家基因表达的启动子对大豆转基因工程的应用非常重要。
技术实现思路
1、为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种大豆内源基因启动子、表达载体及外源基因表达中的应用。
2、所述技术方案如下：一种大豆内源基因启动子在外源基因表达中的应用，所述大豆内源基因启动子为pgmtom7-1，其核苷酸序列如seq id no：2所示，作为大豆内源启动子，用于驱动外源基因表达。
3、进一步，所述大豆内源启动子来源于大豆线粒体外膜转位酶的一个亚基tom7编码基因。
4、进一步，所述外源基因为抗除草剂草甘膦基因cp4-epsps。
5、本发明的另一目的在于提供一种大豆内源基因启动子，用于所述应用中的外源基因表达；所述大豆内源基因启动子为pgmtom7-1，其核苷酸序列如seq id no：2所示。
6、本发明的另一目的在于提供一种利用所述大豆内源基因启动子在大豆发根中驱动外源基因表达的应用。
7、本发明的另一目的在于提供一种利用所述大豆内源基因启动子在烟草叶片中驱动外源基因表达的应用。
8、本发明的另一目的在于提供一种含有所述应用中所述大豆内源基因启动子序列的过表达载体pcambia3301-pgmtom7-1:epsps-35s:bar。
9、进一步，所述过表达载体pcambia3301-pgmtom7-1:epsps-35s:bar的构建方法包括：
10、s1，获取pgmtom7-1的pcr扩增产物；
11、s2，将pgmtom7-1的pcr扩增产物通过无缝连接法克隆到双酶酶切的双元表达载体pcambia3301-35s:bar-35s:epsps中；
12、s3，将p35s:epsps中启动子替换成pgmtom7-1。
13、进一步，在步骤s1中，获取pgmtom7-1的pcr扩增产物前需进行35s:epsps双元表达载体的构建，包括：
14、选取pcambia3301载体，该载体为35s启动子驱动表达的双元表达载体。
15、用引物35s-epsps-f，seq id no：4和pcambia3301-epsps-afl ii-r，seq id no：5扩增cp4-epsps的cdna序列，用引物pcambia3301-35s-ecor i-f:，seq id no：6和35s-epsps-r，seq id no：7扩增出启动子35s序列，dna序列如seq id no：3所示。
16、通过soeing pcr将35s片段与epsps片段进行连接回收后，利用同源重组酶将片段连接到ecor i和afl ii双酶切后的pcambia3301载体上，得到35s驱动epsps表达的双元表达载体pcambia3301-35s:bar-35s:epsps。
17、其中，pcambia3301-35s:bar-35s:epsps的基因序列为seq id no：8；
18、进一步，在步骤s1中，获取pgmtom7-1的pcr扩增产物包括：
19、选取pcambia3301-35s:bar-35s:epsps载体，用引物pgmtom7-1-ecor i-f，seq idno：9和引物pgmtom7-1-bamh i-r，seq id no：10扩增出pgmtom7-1核苷酸序列；
20、在步骤s2-步骤s3中，包括:
21、选取扩增出的pgmtom7-1核苷酸序列，利用同源重组酶将片段连接到ecor i和bamh i双酶切后的pcambia3301-35s:bar-35s:epsps载体上，得到pgmtom7-1驱动epsps表达的双元表达载体pcambia3301-35s:bar-pgmtom7-1:epsps。
22、结合上述的所有技术方案，本发明所具备的有益效果为：本发明从大豆中克隆了基因tom7-1，通过tps法提取大豆基因组，pcr扩增获取启动子pgmtom7-1，构建大豆表达转化载体，实现pgmtom7-1驱动的抗除草剂草甘膦基因cp4-epsps在烟草和大豆体内的表达。通过rt-qpcr实验和western blot实验分别从转录水平和翻译水平上检测epsps表达情况。所述启动子为pgmtom7-1，其核苷酸序列如seq id no：2所示。
23、本发明提供的大豆内源启动子来源于线粒体外膜转运酶亚基tom7，该启动子驱动外源基因cp4-epsps的表达效果可替代来源于花椰菜病毒的35s启动子。该启动子属于大豆内源性启动子，表达效果与35s启动子相当，可通过减少35s启动子在烟草和大豆体内表达的应用，降低转基因安全风险。
24、本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：可利用该启动子替代花椰菜病毒的35s启动子，进行转基因转化体构建，用于后续转基因大豆品种的培育与商业化生产。本发明筛选出高表达的大豆启动子序列，为内源启动子驱动大豆基因表达提供了新的材料。
1.一种大豆内源基因启动子在外源基因表达中的应用，其特征在于，所述大豆内源基因启动子为pgmtom7-1，其核苷酸序列为seq id no：2，作为大豆内源启动子，用于驱动外源基因表达。
2.根据权利要求1所述的大豆内源基因启动子在外源基因表达中的应用，其特征在于，所述大豆内源启动子来源于大豆线粒体外膜转位酶的一个亚基tom7编码基因。
3.根据权利要求1所述的大豆内源基因启动子在外源基因表达中的应用，其特征在于，所述外源基因为抗除草剂草甘膦基因cp4-epsps。
4.一种大豆内源基因启动子，其特征在于，用于权利要求1～3任意一项所述应用中的外源基因表达；所述大豆内源基因启动子为pgmtom7-1，其核苷酸序列如seq id no：2所示。
5.一种利用权利要求4所述大豆内源基因启动子在大豆发根中驱动外源基因表达的应用。
6.一种利用权利要求4所述大豆内源基因启动子在烟草叶片中驱动外源基因表达的应用。
7.一种含有权利要求1～3任意一项所述应用中所述大豆内源基因启动子序列的过表达载体pcambia3301-pgmtom7-1:epsps-35s:bar。
8.根据权利要求7所述的过表达载体pcambia3301-pgmtom7-1:epsps-35s:bar，其特征在于，所述过表达载体pcambia3301-pgmtom7-1:epsps-35s:bar的构建方法包括：
9.根据权利要求8所述的过表达载体pcambia3301-pgmtom7-1:epsps-35s:bar，其特征在于，在步骤s1中，获取pgmtom7-1的pcr扩增产物前需进行35s:epsps双元表达载体的构建，包括：
10.根据权利要求8所述的过表达载体pcambia3301-pgmtom7-1:epsps-35s:bar，其特征在于，在步骤s1中，获取pgmtom7-1的pcr扩增产物包括：
