本发明涉及优化的靶向治疗化合物，其包含载体分子和活性治疗剂，由此向需要靶向治疗作用的各种疾病提供更有效的临床治疗。
背景技术：
1、当前的疾病治疗主要是非靶向的。药物被全身性地或经口投与，其暴露了许多其它组织以及患病的组织。举例来说，在癌症治疗中，化疗药物以对癌细胞(通常dna或细胞复制相关的)尤其显著的机制起作用。然而，其它非癌性细胞也可能吸收化疗药物并且受影响，例如快速分裂骨髓干细胞，导致免疫抑制和疾病(化疗治疗的常见副作用)。在传染病中，抗细菌药物被引入到血液(经口或通过注射)中并且典型地干扰特定细菌代谢路径。其它组织暴露于药物可能导致副作用以及药物抗性的重大问题。受病毒感染的细胞也难以治疗，因为其代谢通常几乎等同于未受感染的人类细胞。
2、广泛假设，未来的医学进展很可能在于针对疾病定制药物。这意味着，向正确的靶组织或生物体递送治疗剂，而非现今所用的大多数常规药物的非选择性命中与未命中方法。这将导致所投与的剂量降低，副作用和毒性降低，并且患者的临床反应总体更好。
3、现今临床上使用的许多药物在药物积聚于正确的组织中后非常好地治疗特定疾病。因此，问题在于药物的特定靶向而非其作用机制。使药物或其它效应子靶向到所要细胞是一个非常确实的领域。主要靶向方法之一是使用抗体或细胞特异性配体作为多官能分子的靶向元件(例如hudson pj.《调研药物专家评论(expert opin investig drugs)》2000,9:1231-42；borsi l等人《血液(blood)》2003,102:4384-92)。
4、抗体天然地进化以充当哺乳动物免疫系统中的第一道防线。其是具有精致特异性和极大多样性的复杂糖蛋白。此多样性因程序性基因改组和靶向诱变而产生，产生大数量的不同抗体序列。此多样性意味着，抗体可以结合到自然界中通常为蛋白质的几乎任何靶分子。现在有可能在体外模拟抗体选择和产生，选择针对几乎任何所要标靶的重组人类抗体(hoogenboom hr.《自然·生物技术(nature biotechnology)》2005,23:1105-16)。
5、抗体可以以高度特异性结合到表达适当受体的靶细胞。抗体的亲和力是抗体多好地结合到标靶(抗原)的量度。其通常由平衡解离常数(kd)描述。对于需要内化的抗体，缔合速率更重要，因为如果抗体被吸收到细胞中，那么解离速率不太关键。存在多种选择和操控具有所要结构和结合特性的抗体的技术(wu am和senter pd,《自然·生物技术》2005,23:1137-46)。
6、如同所有生物分子，抗体的大小影响其体内药物动力学(deonarain,mp等人1997,《蛋白质工程(protein eng)》.10,89-98；batra sk等人《生物技术近期述评(curr opinbiotechnol)》.2002,13:603-8。)。较大分子归因于缓慢清除而在循环中持续较久(大糖蛋白通过肝脏的特异性吸收被清除)。对于在实验小鼠模型系统中识别癌细胞抗原的全抗体(分子量150kda)，30-40％可以被肿瘤吸收，但因为其在循环中持续较久，所以其花费1-2天来达到大于一的肿瘤:血液比率。典型肿瘤:血液比率到约第3天是5-10(boxer gm等人《英国癌症杂志(br.j.cancer)》1994,69:307-14。)。根据全抗体的临床试验，实际上传递到肿瘤的量是小鼠模型中所见量的约1％，但具有类似的肿瘤与器官比率(epenetos aa等人《癌症研究(cancer res)》.1986,46:3183-91)。如果另一分子连接到抗体，那么新的大小和化学-物理特性决定了变更的药物动力学。另外，例如净电荷和亲水性的特性可以影响靶向动力学(gangopadhyay,a等人《核医学与生物学(nucl.med.biol)》1996,23:257-61)。
7、一些细胞表面抗原当由配体(例如抗体)结合时是静态的或非常缓慢地内化。存在一些具有需要内化的功能(例如细胞信号传导或吸收金属和脂质)的抗原。抗体可以用以通过此类抗原在细胞内递送药剂。
8、通过促进对可以特异性地靶向与疾病相关的生物标记的药物的开发，单克隆抗体(mab)在近来年已经改变了医学的面貌[carter pj.《自然·免疫学综述(nat revimmunol)》.2006,6:343-57]。这具有从抑制癌症中的疾病相关因子(例如vegf)或炎性疾病中的tnf到癌症中的肿瘤破坏的许多应用。在增殖性疾病中，受影响的细胞通常具有与所述细胞类型缔合或过度表达于所述细胞类型上的细胞表面受体(例如癌症中的突变正常细胞[scott am等人《自然·癌症综述(nat rev cancer)》.2012,12:278-87]或自身免疫疾病中的过度刺激的免疫细胞[chan ac与carter pj.《自然·免疫学综述》.2010,10:301-16])。许多肿瘤相关受体充当引起会导致肿瘤形成的不受控信号传导的生长因子。此类受体的实例包括表皮生长因子受体(egfr)家族的成员(egfr/erbb1、erbb2/her2、her3和her4)、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子-1受体和notch受体[fauvel b与yasri a.《mab(mabs)》.2014,6:838-51；ménard s等人《致癌基因(oncogene)》.2003,22,6570-8；ranganathan p等人《自然·癌症综述》.2011,11:338-51；parikh ra等人《肿瘤标靶与疗法(oncotargets ther)》.2014,7:969-83；weroha sj与haluska p.《北美内分泌学与代谢临床(endocrinol metab clin north am)》.2012,41:335-50]
9、mab可以结合到肿瘤相关受体并且抑制致癌信号传导，导致肿瘤消退或去除[scott am等人《自然·癌症综述》.2012,12:278-87,4；fauvel b与yasri a.《mab》.2014,6:838-51]。各种免疫球蛋白子类的全mab也可以引发导致肿瘤根除的免疫反应[vannemanm与dranoff g.《自然·癌症综述》2012,12:237-251]。
10、肿瘤可以进化克服mab干预的机制，例如增加受体表达[nahta r等人《自然·肿瘤学临床实践(nature clinical practice oncology)》,2006,3,269-280]、上调替代性致癌信号传导路径或信号传导路径蛋白的突变[nahta r等人《自然·肿瘤学临床实践》,2006,3,269-280，gallardo a等人《英国癌症杂志》.2012,106:1367-73]和下抑免疫反应[pardoll dm.《自然·癌症综述》.2012,12:252-64]。商业批准的mab(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(pannitumumab))可以延长存活数月但通常视为对于显著治愈并不够有力[scott am等人《自然·癌症综述》.2012,12:278-87，sliwkowski mx与mellman i.《科学(science)》.2013,341:1192-8]。另外，患者可能会变得对mab疗法具有抗性，导致复发、治疗选项变少和存活期缩短[nahta r等人《自然·肿瘤学临床实践》,2006,3,269-280；brandtm等人《癌症生物学与治疗(cancer biol ther)》.2011 11:777-92]。
11、药物递送领域中的一个理想目标是将细胞毒性部分特异性地递送到人体中受疾病影响的区域，以使得患病的细胞在不影响正常细胞或引发非想要或有害副作用的情况下被根除。使细胞毒性有效负载连接到完整mab可以增加其细胞杀伤效力并且使细胞毒性作用机制从免疫介导和信号传导介导的效应切换到更直接的肿瘤细胞破坏[flygare ja等人《化学生物学与药物设计(chem biol drug des)》.2013,81:113-21；sievers el与senterpd.《医学年评(annu rev med)》.2013；64:15-29；chari rv等人《应用化学国际英文版(angew chem int ed engl)》.2014,53,3796-827；teicher ba与chari rv.《临床癌症研究(clin cancer res)》.2011,17:6389-97]。这有可能克服对‘游离’抗体和防碍成功结果的任何免疫相关条件的药物抗性[barok m等人《乳癌研究(breast cancer res)》.2011,13:r46；baron jm等人《肿瘤学药学实践杂志(j oncol pharm pract)》.2014.[印刷前的电子版]。这些所谓的抗体-药物共轭物(adc)在本领域中是熟知的并且对于产生有力、特异性、安全并且稳定的adc经历了可观的研究[flygare ja等人《化学生物学与药物设计》.2013,81:113-21；sievers el与senter pd..《医学年评》.2013；64:15-29；chari rv等人《应用化学国际英文版》.2014,53,3796-827；teicher ba与chari rv.《临床癌症研究》.2011,17:6389-97；adair jr等人《生物疗法专家评论(expert opin biol ther)》.2012,12:1191-206；lorusso pm等人《临床癌症研究》.2011,17:6437-47]。
12、最近的研究潮流归因于以下原因而开始显示出前景：充分表征/验证的人类或人类化抗体与破坏微管功能的极有力药物(例如奥瑞他汀(auristatin)和类美登素(maytansinoid)[alley sc等人《药理学与实验治疗学杂志(jpharmacol exp ther)》.2009,330:932-8；erickson hk等人《癌症研究》.2006,66:4426-33])和dna损害剂(例如刺孢霉素(calicheamycin)和pbd[kung sutherland ms等人《血液》2013,122:1455-63；devries jf等人《白血病(leukemia)》.2012,26:255-64])稳定相关。adc(例如曲妥珠单抗-恩他新(emtansine))已经展现出优于相同非共轭抗体加游离化疗药物的临床功效(增长的存活期和降低的副作用)[amiri-kordestani l等人《临床癌症研究》.2014,20:4436-41]。效力较低的细胞毒性药物(例如阿霉素(doxorubicin))仍作为adc在开发但由于不充足的药物通过靶向mab递送而产生限制[govindan sv等人《分子癌症治疗学(molcancer ther)》2013,12:968-78]。对改进adc和药物与载体分子的共轭的研究已经聚焦于使用聚合物作为连接子以连接载体与药物[carlson b.《生物技术保健(biotechnologyhealthcare)》2012,9:28-31；us 8808679 b2]。此方法有效连接两个分子但增加了共轭物的大小和合成复杂性。增加adc的大分子大小引起药物动力学(例如增加的血液半衰期)[deonarain mp等人(2015)《药物开发专家评论(exp.opin.drug discov)》10；463-81；constantinou a等人(2010)《生物技术快报(biotechnol lett)》32:609-22]和药效动力学(例如减小的肿瘤穿透)[dennis ms等人(2007)《癌症研究》67:254-61])的变化。提高adc功效的直接方法是产生具有低(典型地为2-4)dar(药物抗体比率)的更均质共轭物的位点特异性共轭，意味着由于增加的来自较高有效负载暴露的毒性和对非优化的高dar物质的凝集物的不良反应，因此高dar不是有效方法[hamblett等人《临床癌症研究》2004,10:7063-7070]。
13、已经获得大量关于adc的临床经验[amiri-kordestani l等人《临床癌症研究》.2014,20:4436-41]，但仍存在显著限制[lu d等人《癌症化疗与药理学(cancer chemotherpharmacol)》.2014,74:399-410；monjanel h等人《英国血液学杂志(br j haematol)》.2014,166:306-8；robak t与robak e.《调研药物专家评论》.2014,23:911-24.]。使用本领域中所描述的共轭方法，抗体上的载药量未高到足以向靶组织递送充足浓度的药物，以导致长期治愈[teicher ba与chari rv.《临床癌症研究》.2011,17:6389-97]，或产生显著反应，其中标靶以低水平表达[wang x等人《分子癌症治疗学》.2011,10:1728-39]。当使用具有相对低毒性的药物(例如阿霉素、紫杉烷(taxane)和甲氨蝶呤(methotrexate))时，低载药量也是有害的，因为需要更多的这些药物来实现所需要的治疗效果。然而，试图使用载量较高的adc典型地向药物代谢和清除所涉及的组织(例如肝和肾系统)产生具有以下各者的adc：下降的结合功能[chari rv等人《应用化学国际英文版》.2014,53,3796-827；burke,pj等人《生物共轭化学(bioconjugate chem)》.2009,20,1242-1250]、降低的溶解度[charirv等人《应用化学国际英文版》.2014,53,3796-827；hollander,i等人《生物共轭化学》.2008,19,358-361；burke,pj等人《生物共轭化学》.2009,20,1242-1250；zhao ry等人《药物化学杂志(j med chem)》.2011,54:3606-23]和凝集趋势[chari rv等人《应用化学国际英文版》.2014,53,3796-827；hollander,i等人《生物共轭化学》.2008,19,358-361；burke,pj等人《生物共轭化学》.2009,20,1242-1250；zhao ry等人《药物化学杂志》.2011,54:3606-23；king,h等人《生物共轭化学》.1999,10,279-288](其三者均导致不良药物动力学特性)[hamblett,kj等人《临床癌症研究》.2004,10,7063-7070；shen bq.《自然·生物技术》.2012,30:184-9.]、减少的药物递送、较低的治疗功效、增加的副作用和非想要毒性[litvak-greenfeld d与benhar i.《先进药物递送综述(adv drug deliv rev)》.2012,64:1782-99]。
14、当前抗体和adc的另一限制是长血清半衰期(1-3周)的不合需要的副作用[litvak-greenfeld d与benhar i.《先进药物递送综述》.2012,64:1782-99；e.l.sievers等人《临床肿瘤学杂志(j.clin.oncol.)》2001,19,3244-3254]，其可能会导致胃肠道损害、周围神经病和免疫抑制[j.j.lee与s.m.swain.《临床肿瘤学杂志》2006,24:1633-1642；m.a.jordan与l.wilson,《自然·癌症综述》2004,4,253-265]。另外，当前基于全抗体的疗法和adc展现不良扩散特性和较低的组织灌注特性[teicher ba与chari rv.《临床癌症研究》.2011,17:6389-97；jain rk.《先进药物递送综述》.2012,64:353-365；dennis ms等人《癌症研究》.2007,67:254-61]，其导致较低浓度到达实体肿瘤的核心或最差血管化区域[teicher ba与chari rv.《临床癌症研究》.2011,17:6389-97；dennis ms等人《癌症研究》.2007,67:254-61.]。因此，当前adc针对较大实体肿瘤[teicher ba与chari rv.《临床癌症研究》.2011,17:6389-97]、不良血管化的肿瘤或具有致密基质的肿瘤不太有效。
15、hamblett等人《临床癌症研究》2004,10:7063-7070详细研究了单甲基奥瑞他汀e(mmae)向抗cd30单克隆抗体上的载药量。其发现，尽管共轭物的ic50效力测量值随偶合的药物分子的数目而增加，但当从4个药物/抗体增加到8个药物/抗体时，体内抗肿瘤活性不增加。此外，载有8药物的共轭物在体内不良地耐受，可以投与的共轭物的数目从载有4药物的共轭物到载有8药物的共轭物减半。另外，载有8药物的共轭物从身体清除得比载有4药物的共轭物快两倍。hamblett鉴别出，为了实现最佳临床效果(通过平衡肿瘤活性、耐受性和清除)，抗体载4药物是最讲得通的。此观察结果已经得到许多其它支持[例如chari rv等人《应用化学国际英文版》.2014,53,3796-827]。
16、此外，根据kim等人《分子癌症治疗学》2008,7:2486-2497已知，抗体片段在需要依靠替代性策略(例如将聚合物用于偶合)之前可以偶合到最多四个药物分子[us2013/0101546]。
17、wo 2014/068443 a1、wo 2014/134457 a2、wo 2013/082254 a1、wo 2012/104344a1和us2010/0136033 a1各自描述了药物共轭到抗体片段。然而，这些文献中无一者提出了克服抗体片段凝集的方法，所述方法将为小于全igg的蛋白质的高dar比率所需。
18、举例来说，wo 2014/068443(pfizer)描述了共轭到赖氨酸残基上和特定v-κ赖氨酸-188残基。其对于全igg(150kda)展现约2-4的平均dar，一些有效负载的最大dar为7.8。此研究表明，对于30kda(1/5大小)的scfv片段，熟练人员将合理地预期dar为不高于2。
19、wo 2014/134457(immunogen)描述了制备dar为约4-5的基于igg的adc的直接和间接赖氨酸共轭。尽管对于完整抗体提出dar可高达20，但对于1/5大小的scfv，这将等同于dar为约4。
20、wo 2012/104344(genmab)描述了一种抗cd74全抗体(humab-cd74)和使用直接和间接赖氨酸方法具有多种有效负载的共轭物。所公开的dar在3.7到4.1范围内，对于1/5大小的抗体片段，这最多等同于dar为1。
21、adc疗法领域的近期综述(chari等人《应用化学国际版(angew.chem.int.ed)》2014,53:3796-3827)强调了，当前adc对于常规地用于临床环境中不够有效。近期fda对两种adc分子的上市许可显示，adc的原理可以起作用，但此治疗领域中30多年的研究仅使得两种药物得到批准用于临床证实了，由于难以有效地进行adc研究，这些药物是例外情况而非规则。
22、因此，需要制备可减少或消除当前adc方法的显著限制的改进的adc。
技术实现思路
1、本发明现在提供了经优化以减少当前adc疗法的限制的此类改进的adc、以及其用途和其制造方法。
2、在本发明的第一方面，提供了一种化合物，其包含以5:1的最小偶合比偶合到载体分子的治疗剂；其中所述载体分子是(i)抗体片段或其衍生物或(ii)抗体模拟物或其衍生物；并且其中所述治疗剂偶合到赖氨酸氨基酸残基上；并且此外其中所述治疗剂不是光敏剂。
3、术语“载体分子”包括治疗剂所偶合的任何试剂的含义。载体分子包含氨基酸并且包括肽、多肽和蛋白质。具体来说，载体分子意图是抗体片段或抗体模拟物。
4、术语“偶合比”意指偶合到一个载体分子的治疗剂分子的数目。
5、术语“光敏剂(photosensitising agent)”(光敏剂(photosensitiser)、光敏药物可互换地使用)应视为指属于需要次级物理干预来激活其细胞毒性特性的一类药物的化合物。所述化合物以其单态吸收特定波长下的光的光子。这产生短时间存活的激发单态。其可以通过系统间过渡转化为较长时间存活的三重态。此三重态光敏剂可以由于自由基光氧化、单态氧和不涉及氧气的光反应而具有细胞毒性特性。当使用例如savellano md与hasant[《临床癌症研究》.2005.11:1658-58]所描述方法的方法用至少0.1焦耳的光源照射时，光敏剂的光依赖性效力必须是至少1μm。光敏剂还可以视为需要次级物理干预来激活其细胞毒性特性的一类药物，其所述特性是细胞杀伤的主要机制。
6、对于不为光敏剂的治疗剂，我们意指除了光敏剂以外的任何治疗剂。此类治疗剂不具有光敏剂的任何光物理特性，即其不会吸收光的光子以便进入激发态。当用至少0.1焦耳的光源照射时，非光敏剂的光依赖性效力必须不大于1μm，并且优选是0μm[kostron等人(2003)《光动力疗法：方法和方案(photodynamic therapy:methods and protocols)》(《光化学与光生物科学(photochemical&photobiological sciences)》中的综合系列,皇家化学学会出版社(royal society of chemistry publishers))
7、类似于其它治疗剂共轭物，包含偶合到载体分子的光敏剂的化合物先前已经进行了描述(例如wo 2007/042775和wo 2010/106341)，然而，此类共轭物与非光敏剂药物共轭物展现出显著差异。举例来说，存在对光敏剂进行空间隔离以便减少和/或避免骤冷的明显基本原理。当考虑治疗剂功能时，因为非光敏剂药物不能骤冷(这纯粹是一种光相关现象)或不具有任何在空间上相互作用的自身抑制特性，所以其空间隔离常规地被认为是无关的，并且因此现在极其出人意料地发现，通过最优地间隔非光敏剂，可以制备改进的adc分子。
8、光敏剂归因于其可导致血液蛋白质结合的平面疏水性结构而被熟知具有长血清半衰期，这促成了其皮肤光敏性[hopper c.《柳叶刀肿瘤学(lancet oncol)》.2000；1 212-9；korbelik m.《光化学与光生物学(photochem photobiol)》.1993；57:846-50]。使其共轭到亲水性抗体上加速了血液清除，减少这些副作用[bhatti m,p等人《国际癌症杂志(int jcancer)》.2008,122:1155-63；palumbo a等人《英国癌症杂志》.2011,104:1106-15]。相反地，使小分子非光敏剂药物共轭将减缓其清除，因为其天然地快速从循环清除[pimm mv等人《国际癌症杂志》.1988,41:886-91]
9、术语“核苷酸序列”或“核酸”或“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换地使用并且指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸的序列。这些短语还指基因组或合成来源的dna或rna，其可以是单链或双链的并且可以表示有义链或反义链；和肽核酸(pna)或任何dna样或rna样材料。在本文的序列中，a是腺嘌呤，c是胞嘧啶，t是胸嘧啶，g是鸟嘌呤，并且n是a、c、g或t(u)。预期在多核苷酸是rna时，本文所提供序列中的t(胸嘧啶)经u(尿嘧啶)取代。一般来说，本发明所提供的核酸区段可以由基因组的片段和短寡核苷酸连接子或由一系列寡核苷酸或由个别核苷酸组装，以提供能够表达于包含衍生自微生物或病毒操纵子或真核基因的调节元件的重组转录单元中的合成核酸。
10、术语“多肽”或“肽”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列或其片段和天然存在或合成的分子。多肽“片段”、“部分”或“区段”是至少约5个氨基酸、优选至少约7个氨基酸、更优选至少约9个氨基酸并且最优选至少约17个或更多个氨基酸的一段氨基酸残基。为了具活性，任何多肽必须具有充足长度以呈现生物和/或免疫活性。
11、如本文所用，术语“纯化的”或“大体上纯化的”表示指定核酸或多肽在大体上不存在其它生物大分子(例如多核苷酸、蛋白质等)下存在。在一个实施例中，多核苷酸或多肽经纯化以使得其构成所存在指定生物大分子的至少95重量％、更优选至少99重量％(但可能存在水、缓冲剂和其它小分子，尤其分子量小于1kda的分子)。
12、如本文所用，术语“分离的”是指与至少一种与核酸或多肽一起存在于其天然来源中的其它组分(例如，核酸或多肽)分离的核酸或多肽。在一个实施例中，核酸或多肽仅(如果有的话)在溶剂、缓冲剂、离子或通常存在于其溶液中的其它组分存在下可见。术语“分离的”和“纯化的”不涵盖存在于其天然来源中的核酸或多肽。
13、当在本文中用以指多肽或蛋白质时，术语“重组”意味着，多肽或蛋白质衍生自重组(例如，微生物、昆虫或哺乳动物)表达系统。“微生物”是指细菌或真菌(例如，酵母)表达系统中得到的重组多肽或蛋白质。作为产物，“重组微生物”定义了基本上不含天然内源物质并且未伴有相关天然糖基化的多肽或蛋白质。表达于大多数细菌培养物(例如大肠杆菌(e.coli))中的多肽或蛋白质将不含糖基化修饰；表达于酵母中的多肽或蛋白质将具有通常不同于表达于哺乳动物细胞中的多肽或蛋白质的糖基化模式。
14、术语“optilink”或“optilinked”在本文中用以指优化根据本发明的抗体片段以便最大化有效负载共轭负载量同时最小化体外或体内共轭物凝集同时保持抗体结合功能。
15、提供较高负载量的治疗剂到载体分子上的替代性最小偶合比包括至少6:1、至少7:1和至少8:1或更大。
16、使药物分子偶合到氨基酸残基可以在多个不同氨基酸处进行。表1列出了针对赖氨酸残基的共轭策略，其展示了可以用于此偶合方法的偶合化学物质。
17、表1.用于使药物偶合到赖氨酸氨基酸上的官能团
18、
19、
20、抗体片段和模拟物在氨基酸序列和使药物偶合到的官能团的数目和间隔方面不同。最常见的频繁用于共轭的官能团是n末端处和赖氨酸残基上可见的伯胺。特定治疗剂-抗体片段共轭物的有效性的主要决定因素是治疗剂分子所连接到的残基的空间隔离。这些残基在抗体表面上必须分开并且拓扑隔离以实现所得共轭物的有效偶合和最优药物动力学。
21、可共轭残基优选处于可以耐受化学修饰而不会变得不稳定或易于凝集的位置。
22、一般来说，蛋白质折叠以在具有亲水性表面的分子的中心处形成疏水性核心以能够实现于生理溶剂中的溶解度。例如赖氨酸和精氨酸的碱性残基、例如谷氨酸酯和天冬氨酸酯的酸性残基、例如丝氨酸(和有时酪氨酸)、半胱氨酸、谷酰胺和天冬酰胺的极性残基通常都见于蛋白质的表面上。在许多实例中，这些残基参与维持所述蛋白质的结构和功能。赖氨酸残基是最常存在的表面氨基酸[hermanson,gt,《生物共轭技术(bioconjugatetechniques)》,第1章,第30页,学术出版社(academic press)(2008)]并且在碱性ph下优先与nhs-酯反应。
23、在抗体片段(例如单链fv)的实例中，每个结构域由可变重(vh)和可变轻(vl)结构域组成。其可以是任何家族的vh和vl结构域之一。在抗原结合环(互补决定区，即cdr)的情况下，这些序列特异性针对于所述抗体识别其同源抗原的能力。其可以经操纵以改变抗体的特异性或亲和力但不用于其它原因。结构域序列的主要部分是构架区。图1(根据knappik等人《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》2000,296:57-86修改)指示了人类可变结构域中的哪些残基往往会存在于抗体的表面处和哪些区往往会是内部作为核心的一部分。考虑到抗体之间高度的结构和序列同源性，这些区通常可以适用于所有抗体序列。表面构架区往往会含有带电或极性残基。
24、如果所述治疗剂和所述载体分子在偶合形式下的功能和物理特性与非偶合形式下的特性相比定性地大体上不变，那么这是一种优势。
25、对于定性地大体上不变，我们意指，治疗剂保持其治疗功能但当共轭时此可以定量地不同(例如与非共轭药物相比，治疗功能可以增强)；并且载体分子在共轭时结合到与非共轭时相同的标靶但可以定量地不同(例如结合亲和力可以更高)。
26、术语“结合亲和力”包括载体分子与其标靶(例如(但不限于)抗体片段和抗原)之间的结合强度的含义。
27、本发明化合物应具有<100nm、优选<1nm、更优选<10pm并且甚至更优选<0.1pm的ic50。
28、如果化合物的ic50比非共轭时的治疗剂低出高达10倍(即效力大10倍)，那么这是优选的。ic50可以低至少10倍(其与初始ic50的10％相同)并且效力优选将变为非共轭ic50的高达100％。甚至更优选地，效力是更高的并且因此百分比优选是200％、500％、1000％(即效力大10倍)或更好。药物就其自身来说效力可能不良(例如无法穿过细胞膜)但以adc形式效力很大(因此1000％或更好)。
29、半数最大抑制浓度(ic50)是物质抑制特定生物或生物化学功能的有效性的量度。此量度指示了一半地抑制既定生物过程(或其组分)需要多少特定药物或其它物质(抑制剂)。既定化合物的ic50的测定是一种常规，并且典型地通过构筑剂量反应曲线和检验不同浓度拮抗剂对逆转激动剂活性的效果来测定。ic50值通过测定抑制激动剂的最大生物反应的一半所需要的浓度来计算。
30、化合物应具有至少2小时、优选4小时、或者8、16、32、64或128小时的鼠类血清半衰期。血清半衰期还可以在小鼠或人类中测量。化合物的血清半衰期优选比非共轭时的载体分子高出高达5倍、优选高出高达10倍。与非共轭形式相比，化合物可以具有缩短的半衰期。半衰期缩短50％(例如从4hr到2hr)如果与其它有利特征(例如低或减少的凝集)结合，那么是药理学上可接受的。凝集对于scfv或类似大小的片段将导致<1hr的快速清除，降低生物可用性以及可能诱导有害的免疫反应。如果载体分子的半衰期维持得接近非共轭载体分子的半衰期，那么这是优选的，小幅缩短是可耐受的。至多10倍增加的半衰期增加是理想的(例如在小鼠中4hr到20hr)。
31、血清半衰期是化合物的血清水平降低到其初始值的一半的所计算持续时间。既定化合物的血清半衰期的测定是一种常规，并且典型地通过测量在化合物投与到生物体之后血清中随时间推移的药物量来测定。血清半衰期临床上是重要的，因为其将决定为了一贯地实现在临床上有效范围内的血清药物水平所需的剂量方案。
32、本发明化合物在生理学上相容的缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水或生理盐水)中在室温(例如20℃)下应具有至少1mg/ml的溶解度。更优选是2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、15mg/ml或20mg/ml。在一个实施例中，本发明化合物在不存在添加剂或赋形剂下具有所述溶解度。在一替代性实施例中，本发明化合物在一种或多种添加剂或赋形剂(例如当以根据管理机构可接受的赋形剂的残余或不可去除量存在时)存在下具有所述溶解度。
33、产生本发明化合物的共轭反应还可以具有添加剂或赋形剂以促进反应和化合物溶解度。实例是聚山梨醇酯-20、吐温-80、甘氨酸、麦芽糖、组氨酸、普朗尼克f-68、辛酸、n-乙酰基色氨酸、苯甲醇、苯甲酸、丙二醇、(氯)丁醇、异丙醇和甘油[hollander i.等人《生物共轭化学》.2008,19:358-361；patapoff tw与esue o.《药物开发与技术(pharm devtechnol)》.2009,14:659-64]。其通常在加工期间去除但有时以根据管理机构可接受的赋形剂的残余或不可去除量存在[http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.cfm]。
34、本发明化合物优选在至多0.5％聚山梨醇酯、1％甘油、0.5％甘氨酸、0.1％组氨酸、0.5％氯丁醇、5％丙二醇、2％苯甲醇、0.05％辛酸和/或0.1％ n-乙酰基色氨酸存在下具有上文所述的溶解度。
35、本发明化合物在生理学上相容的缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水或生理盐水)中在室温(例如20℃)下应展现<5％、优选<1％的凝集水平。凝集可以通过分析尺寸排阻hplc测量与单体共轭物特有的滞留时间时洗脱的共轭物相比高分子量材料的百分比来测试。
36、本发明化合物的药物与抗体比率应高于类似集结的蛋白质所实现的比率，增加的益处是药物有利地可接近以经由酶、物理或化学机制在细胞内部或外部释放。
37、赖氨酸残基通常见于抗体结构域的表面处。在生殖系人类vh1家族的成员的情况下，存在5-6个赖氨酸残基，其中仅一者或两者彼此接近。一残基接近另一者的定义可以是一级序列相邻因此3维结构相邻者。或者，残基根据一级序列可以隔离，但由于抗体结构域的折叠的结构而空间相邻。直接相邻的氨基酸残基可以定义为空间相隔3-4埃。
38、使治疗剂偶合到直接相邻的赖氨酸残基上将导致较差的药物动力学和治疗效果(例如增加的凝集和较差的溶解度)。当赖氨酸残基进一步隔离、优选相隔两个氨基酸(3.5到7.5埃)、更优选相隔三个氨基酸(7到12埃)、更优选相隔四个氨基酸(10-15埃)、甚至更优选地相隔五个氨基酸(15-20埃)、又甚至更优选地相隔六个氨基酸(20-25埃)或更大时，偶合更有效。载体分子应经选取、选择或工程化以具有这些特性。载体分子具有的赖氨酸残基越多，隔离越优，载体分子将越好地形成有效并且有力的共轭物。
39、确定用于治疗剂偶合的氨基酸残基彼此接近还是相邻的方法在本领域中是众所周知的。clustal序列比对(使用网络资源，例如来自欧洲生物信息研究所(europeanbioinformatics institute)的http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/)是用于比较一级氨基酸序列的良好确立的工具。此外，在不存在载体分子的完整3维结构数据的情况下，有可能使用良好确立的技术(例如同源建模)使用已知结构(例如，鼠类scfv的结构)推导载体分子的可能结构，和由此鉴别用于偶合的残基在空间上是接近还是相邻。由例如抗体和抗体片段展现的高度同源性意指这些技术可以以高度置信度应用。同源建模的网络资源是可获得的，例如来自瑞士生物信息研究所(swiss institute of bioinformatics)的专家生物信息分析系统(expert bioinformatics analysis system)(http://expasy.org)，其还提供了免费桌面建模程序swisspdb viewer。此外，帝国理工学院(imperial college)的phyre服务器可以产生同源模型(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi？id＝index)[kelley la与sternberg mj.《自然·实验室指南(nat protoc)》.2009；4:363-71]。
40、如果赖氨酸残基的分布对于共轭和最优药物动力学并不有利，那么载体分子可以使用标准分子生物技术(例如定点诱变)来改变以去除不良间隔的残基(例如太接近地定位的)或引入充分间隔的残基。
41、治疗剂可以在氨基酸处直接偶合到载体分子。或者，治疗剂可以间接偶合到载体分子。
42、存在多种使细胞毒性药物共轭到抗体和抗体片段的方式[ducry,l,(编)(2013),《抗体-药物共轭物(antibody-drug conjugates)》书籍,《分子生物学方法(methods inmolecular biology)》第1045卷,第9-12章,胡马纳出版社(humana press)；hermanson,g(2013)《生物共轭技术》书籍,第2-6章,学术出版社]。此概述于表2中。赖氨酸残基对于共轭是有利的，因为其可以多重地存在于抗体的表面上而不导致有害效果(例如非想要的交联)。举例来说，共轭到赖氨酸上可以是直接的(表2)，使用具有n-羟基-琥珀酰胺酯或异硫氰酸酯反应性基团的药物或药物连接子。间接赖氨酸共轭方法包括用双官能连接子(例如可获自pierce chemicals(thermo)和quanta bioscience的那些)使氨基衍生化以产生次级反应性基团(例如2-亚氨基硫杂环戊烷)以产生反应性硫醇以便共轭到具有硫醇或马来酰亚胺反应性基团的药物或药物连接子。一些赖氨酸残基由于归因于所述残基周围的微环境的增强的亲核性而可能特别易于共轭[doppalapudi vr等人《美国国家科学院院刊(procnatl acad sci u s a)》.2010,107:22611-6.]。已知其它共轭方法，例如天然化学连接[hackenberger cp与schwarzer d.《应用化学国际英文版》.2008；47:10030-74.]、包括使用酶的位点特异性共轭[behrens cr与liu b.《mab》.2014,6:46-53]和二硫键桥接技术[l等人《化学通讯(chem comm)》,2013,49,8187-8189；badescu g等人《生物共轭化学》.2014,25:1124-36.]。近期的共轭方法包括使用甲磺酰基苯基噁二唑反应性连接子形成硫醚[barbas c f b等人《生物共轭化学》,2014,25,1402-1407]、经由使用酪氨酸点击反应的酪氨酸选择性标记[barbas c f b等人《生物共轭化学》2013,24,520-532]和四嗪与应变炔烃之间的逆电子需求狄尔斯-阿尔德(inverse-electron demand diels-alder，iedda)反应[fox,j m.2008,130,13518-13519]、[chin j w和lang k《化学评论(chemicalreviews)》,2014,114,4764-4806]。
43、
44、
45、
46、本发明的一个实施例是携有n-羟基-琥珀酰亚胺酯的药物与多个(n个)赖氨酸残基的直接共轭，其中n>4。本发明的另一实施例是与n个赖氨酸残基的间接共轭，其中交联剂smcc用以修饰表面赖氨酸残基，产生可还原硫醇以便共轭到携有硫醇或马来酰亚胺基团的药物或药物连接子。
47、具有相同反应性基团的药物的混合物可以在化学共轭反应中用以产生具有多于一种细胞毒性治疗药物类型或治疗药物与诊断剂(例如荧光染料)的组合的共轭物[fernandez-fernandez a等人《应用生物化学与生物技术(appl biochem biotechnol)》.201,165:1628-51.]。此类共轭物可能可用于克服药物抗性或允许联合成像与治疗(治疗诊断)。
48、对于“小分子”，我们意指具有相对低分子量的天然存在或人工产生(例如，经由化学合成)的分子。优选的小分子具生物活性，因为其在动物、优选哺乳动物、更优选人类中产生局部或全身性效应。在某些优选实例中，小分子是药物并且小分子被称为“药物分子”或“药物”或“治疗剂”。在某些实施例中，药物分子的分子量(mw)小于或等于约5kda。在其它实施例中，药物分子的mw小于或等于约1.5kda。在其它实施例中，药物分子选自长春花生物碱(vinca alkaloid)、海兔毒素(dolostatin)、奥瑞他汀、微管溶素(tubulysin)、倍癌霉素(duocarmycin)、激酶抑制剂、玫瑰树碱(ellipticine)、mek抑制剂、ksp抑制剂、dna烷基化剂、dna嵌入剂和拓扑异构酶抑制剂和其类似物[carmen和j.carlos menéndez(2008).《抗癌药物的医药化学(the medicinal chemistry of anti-cancer drugs)》,爱思唯尔出版社(elsevier press)；cragg gm等人(2012).《来自天然产品的抗癌剂(anti-cancer agents from natural products)》,第2版,crc出版社(crc press)]。优选地但未必，药物是已经被适当政府机构或主体(例如fda)视为使用起来安全并且有效的药物。举例来说，fda列出的供人类使用的药物都视为适用于此技术。
49、实践中可以使用的药物分子的类型包括(但不限于)抗癌物质、放射性核素、维生素、抗aids物质、抗生素、免疫抑制剂、抗病毒物质、酶抑制剂、神经毒素、阿片类药物、安眠药、抗组胺、润滑剂、镇静剂、抗惊厥剂、肌肉松弛剂和抗帕金森(anti-parkinson)物质、抗痉挛剂和肌肉收缩剂(包括通道阻滞剂、缩瞳药和抗胆碱能剂)、抗青光眼化合物、抗寄生虫和/或抗原虫化合物、细胞-胞外基质相互作用的调节剂(包括细胞生长抑制剂和抗粘附分子)、血管舒张剂、dna、rna或蛋白质合成的抑制剂、抗高血压药、止痛剂、退热剂、类固醇和非类固醇抗炎剂、抗血管生成因子、抗分泌因子、抗凝剂和/或抗血栓剂、局部麻醉剂、眼药、前列腺素、抗抑郁剂、抗精神病物质、止吐剂、成像剂。
50、优选地，载体分子选择性结合到标靶。标靶可以是靶细胞或胞外靶分子。靶细胞是治疗剂要递送到的或位于治疗剂要递送到的组织中的细胞。
51、术语“选择性结合”和“结合选择性”指示，本发明的抗体的可变区仅仅识别和结合本发明的多肽(即，能够将本发明的多肽与其它类似多肽区分，尽管多肽家族中可见序列一致性、同源性或类似性)，但还可以通过与抗体的可变区外部的并且具体来说分子的恒定区中的序列的相互作用而与其它蛋白质(例如，金黄色葡萄球菌(s.aureus)蛋白a或elisa技术中的其它抗体)相互作用。用以测定本发明的抗体的结合选择性的筛检分析在本领域中是熟知的并且常规地实践。关于此类分析的综合论述，参看harlow等人(编),《抗体：实验室手册(antibodies:a laboratory manual)》；冷泉港实验室(cold spring harborlaboratory)；纽约州冷泉港(cold spring harbor,n.y.)(1988),第6章。
52、载体分子在结合靶细胞时可以内化到细胞中以便将治疗剂引入到细胞内部的作用位点。或者，载体分子在结合标靶或靶细胞时不内化到细胞中，并且代替地，治疗剂在细胞外部起作用。另一替代方案是载体分子在结合标靶之后从治疗剂解偶合。换句话说，治疗剂从载体释放以变成游离分子。这些游离分子然后可以在细胞外部起作用，或通过非抗体依赖性途径吸收到细胞中。
53、在一个实施例中，载体分子可以是抗体片段。术语“抗体片段”应理解为指不包括全抗体的全部结构域的任何基于抗体的分子。其预期包括野生型抗体、合成抗体、重组抗体或抗体杂合体的片段。
54、如果抗体片段排除了全抗体的fc区，那么这是优选的。具体来说，如果抗体片段不包括全抗体的ch2和ch3区，那么这是优选的。
55、适用于本发明中的抗体片段选自scfv、fv、fab、f(ab')2、fab-sh、dsfv、bc-scfv、sdab、di-scfvs(也称为bi-scfvs)、fcabs、结构域抗体、纳米抗体、vhh结构域、双特异性形式例如双特异性t细胞啮合体、双功能抗体和tandabs。
56、抗体片段是全免疫球蛋白的具有优于完全抗体的有利特性的功能部分，所述有利特性例如向致密或实体肿瘤中的穿透更快、与正常组织的交叉反应性降低和从循环中的清除更快，因此总的来说减少正常组织暴露。本领域中众所周知，抗体片段展现更快药物动力学，更快分散到组织中和消除(adme吸附、分布、代谢和排泄特性)。其还更容易在更具成本效益的系统(例如微生物表达系统)中制备[de marco a.《微生物细胞工厂(microb cellfact)》.2009,8:26；spadiut o等人《生物技术趋势(trends biotechnol)》.2014,32:54-60]。
57、抗体片段可以通过化学或酶裂解制备，但更优选地，使用重组dna技术制备。后者引起不确定的于原核或真核细胞系中的蛋白质表达和基因修饰，产生具有增强的或额外的特性的片段。抗体片段通常具有至少一个可变(v-)结构域，因为v-结构域含有互补决定区(cdr)或用于抗原结合的环[carter pj.《自然·免疫学综述》.2006,6:343-57]。最近，cdr样环已经插入到非可变结构域(例如恒定-重-3，ch3结构域)中，使得这些结构域能够结合到可用或预定标靶[wozniak-knopp,g等人《蛋白质工程、设计与选择(proteineng.des.sel.)》2010,23,289-297]。
58、对于要有效地用作细胞毒性药物的载体媒剂的抗体片段，其必须具有经由化学共轭(或强并且特异性的非共价相互作用)允许高载药量而不会不利地影响蛋白质稳定性、抗体-抗原结合和药物有利的特性(例如溶解度、凝集和免疫原性)的生物物理学特性。这些特征极少为抗体片段所固有[a与plückthun a.《分子生物学杂志》.2001,305:989-1010]，因此这些额外益处必须工程化到抗体片段中以使其实际上可用[schaefer jv与plückthun a.《蛋白质工程、设计与选择》.2012,25:485-506]。这种特征的一个实例是将额外或更多最优分布的表面赖氨酸残基并入到抗体片段上，因此增加其使用胺定向化学过程进行药物共轭的能力。可以使用其它氨基酸，例如最优分布的半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸酯、天冬氨酸酯、精氨酸、天冬酰胺、组氨酸和丝氨酸，但赖氨酸由于良好确立并且成功的化学共轭方法和对不具有特定活化基团的共轭的相对惰性而更优选[ducry,l,(编)(2013),《抗体-药物共轭物》书籍,《分子生物学方法》第1045第,第10章,胡马纳出版社]。还可以使用非天然氨基酸，例如对乙酰基苯丙氨酸和甲酰基-甘氨酸[behrens cr与liu b.《mab》.2014,6:46-53]。用于抗体片段修饰的位置的鉴别可以是通过直接分析抗体片段(或亲代全抗体)的3维结构(如果可获得)或通过使用多种软件资源(例如phyre)同源建模[kelley la与sternberg mj.《自然·实验室指南》.2009；4:363-71]。选择位置的准则包括：(1)氨基酸的使用在所述位置处已经是有利或保守的(从例如imgt或kabat的数据库鉴别[patrickchames(编),《抗体工程化：方法和方案(antibody engineering:methods andprotocols)》,第二版,《分子生物学方法》,第907卷,第1章])或通过借助制备和测试抗体片段突变体的实际证实；(2)将残基分布得远离会干扰抗原结合的位置；和(3)隔离共轭残基，以使得其在化学反应或药物释放反应期间不会空间上阻碍(或预计会阻碍)彼此或形成高度疏水性片导致凝集
59、蛋白质表面赖氨酸残基的优化可以通过增加、减小或再间隔(例如，通过定点诱变)来实现，以使得其更可接近以生物共轭、允许更完全并且因此更均相的共轭反应，并且同时不会不利地影响抗原结合、蛋白质稳定性、溶解度或凝集特性。残基可以单独、逐步或多重地操纵。
60、编码待表达的抗体片段或优化抗体片段的核苷酸序列可以通过诱变现有基因序列或通过基因合成而制备，插入到克隆载体中用于序列/结构证实，并且再克隆到携有用于蛋白质表达的适当调节元件的载体中，使用确定的分子生物学方法，例如sambrook等人[《分子克隆(molecular cloning)》书籍(2000),第3版,冷泉港]或[patrick chames(编),《抗体工程化：方法和方案》,第二版,《分子生物学方法》,第907卷,第18-23章]描述的那些。这些元件包括启动子、增强子、终止子、翻译调节序列和用于克隆选择的标记基因(例如用于大肠杆菌的羧苄青霉素(carbenicillin)、用于哺乳动物细胞的新霉素(neomycin))。
61、可以使用可抑制型、组成型或诱导型的原核表达系统。适当大肠杆菌启动子包括lac、tac、t7、t4、sp6、t3、λpr/pl、trp、reca和热休克启动子。替代性原核宿主包括芽孢杆菌属(bacillus)和具有相应启动子的其它细菌。
62、大肠杆菌可以用作宿主[de marco a.《微生物细胞工厂》.2009,8:26；spadiut o等人《生物技术趋势》.2014,32:54-60]，并且适当菌株包括k12或b-衍生物，例如来自例如新英格兰生物实验室(new england biolabs)或默克公司(merck)的供应商的jm109、tg1、hb2151、xl1、bl21、bl21(de3)、大肠杆菌大肠杆菌等。
63、载体表达系统包括允许周质分泌(使用附接到抗体片段基因的pelb或ompa前导序列)以允许二硫键形成[de marco a.《微生物细胞工厂》.2009,8:26]或于氧化还原修饰的宿主中的胞溶质表达以允许二硫键形成[sonoda h等人《蛋白质表达与纯化(protein exprpurif)》.2010,70:248-53]的表达系统。可以附接额外融合蛋白以帮助折叠和纯化，例如硫氧还蛋白还原酶(trx)[sonoda h等人《蛋白质表达与纯化》.2010,70:248-53]，其随后通过蛋白水解通过可商购自例如普洛麦格(promega)的供应商的特定地引入的肽裂解标签(例如tev或因子-xa)而去除。本发明的特定实施例包括使用载体(例如pet20b)于大肠杆菌bl21(de3)中的周质表达和使用载体pet32xa/lic于大肠杆菌中的胞溶质表达[lobstein j等人《微生物细胞工厂》.2012,11:56]。不需要链内二硫化物的工程化抗体需要分泌到周质空间中。
64、核酸还可以表达于真核宿主(例如酵母、昆虫和哺乳动物细胞)中[patrickchames(编),《抗体工程化：方法和方案》,第二版,《分子生物学方法》,第907卷,第18-23章]]。酵母细胞包括巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，昆虫细胞包括果蝇(drosophila)，并且哺乳动物细胞包括啮齿动物(cho，atcc-ccl61，sp2/0)、非人类灵长类动物(cos-7，atcc crl1651)和人类细胞(hek atcc85257)。应使用适当启动子和调节元件，例如用于毕赤酵母属表达的ppic系列载体、用于昆虫细胞表达的pbluebac和用于哺乳动物细胞表达的pcdna1/2/3/4中所见的那些。哺乳动物细胞表达启动子的实例包括sv40、cmv、igh，与适当增强子，例如sv40增强子、igh或κ增强子等。对于真核表达，适当分泌信号必须附接到基因以便传代到分泌系统以允许蛋白质折叠、糖基化(如果需要)、二硫键形成和胞外易位。哺乳动物分泌信号序列的一个实例是免疫球蛋白信号序列。
65、表达于异源宿主中的蛋白质可以使用多种不同方法分离和纯化[scopes(1993)《蛋白质纯化：原理和实践(protein purification:principles and practice)》(施普林格化学高等教材(springer advanced texts in chemistry))]。可以通过离心收集培养物上清液，可以使细胞裂解(例如化学清洁剂)或物理破坏(例如，弗氏压碎器(frenchpress)，声处理)，并且可溶或不可溶部分保留。如果蛋白质是可溶的，那么可以在天然条件下使用离子交换色谱法、亲和色谱法(使用预工程化的标签，例如poly-his、flag、cmyc)和尺寸排阻色谱法。如果蛋白质是不可溶的，那么可以使用化学变性(例如通过脲)随后再折叠[deonarain mp与epenetos aa.《英国癌症杂志》.1998,77:537-46]或在变性条件下纯化(例如poly-his固定的金属亲和色谱法，imac)。最终蛋白质纯度使用分析工具例如sds-page、sec、氨基酸分析或质谱分析来评估，并且最终蛋白质功能使用elisa、流式细胞术、免疫组织化学或细胞生物分析[harlow与lane(1998)《使用抗体(using antibodies)》,冷泉港]或biacore-spr[van regenmortel mh等人《分子识别杂志(j.mol recognit)》.1998,11:163-7]来评估。
66、在一个实施例中，载体分子可以是抗体模拟物。术语“抗体模拟物”应理解为指可以如抗体一样特异性地结合抗原但结构上与抗体不相关的有机化合物。其通常是摩尔质量为约3到20kda的人工肽或蛋白质。核酸和小分子可以视为抗体模拟物，但抗体模拟物不包括由其组成的人工抗体、抗体片段和融合蛋白。一些类型的抗体模拟物具有抗体样肽构象，例如β-片层。
67、适用于本发明中的抗体模拟物[wurch t等人《生物技术趋势》.2012,30:575-82]是darpin、亲和抗体(affibody)、affitin、anticalin、avimer、kunitz结构域肽、adnectin、centyrin、fynomer、ignar和单抗体(monobody)。
68、载体分子可以是人类化或人类的。
69、人类化抗体适用于向人类投与而不会由人类引起针对所投与的免疫球蛋白的免疫反应。人类化形式的抗体是完整免疫球蛋白、主要由人类免疫球蛋白的序列组成并且含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白链或其片段(例如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。人类化可以根据winter和同事(jones等人,《自然(nature)》,321:522-525(1986)；riechmann等人,《自然》,332:323-327(1988)；verhoeyen等人,《科学》,239:1534-1536(1988))的方法执行。在一些情况下，人类免疫球蛋白的fv构架残基经相应非人类残基置换。人类化抗体还可以包含在受体抗体中和在所引进的cdr或构架序列中都不存在的残基。一般来说，人类化抗体将包含大体上所有的至少一个并且典型地两个可变区，其中所有或大体上所有的cdr区对应于非人类免疫球蛋白的cdr区并且所有或大体上所有的构架区是人类免疫球蛋白共有序列的构架区。人类化抗体最优地还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(fc)、典型地人类免疫球蛋白的恒定区(jones等人,1986；riechmann等人,1988；和presta,《结构生物学新见(curr.op.struct.biol.)》,2:593-596(1992))。
70、本发明化合物的载体分子的优选标靶是细胞表面或肿瘤标记，包括(但不限于)5t4、aoc3、c242、ca-125、ccl11、ccr 5、cd2、cd3、cd4、cd5、cd15、cd18、cd19、cd20、cd22、cd23、cd25、cd28、cd30、cd31、cd33、cd37、cd38、cd40、cd41、cd44、cd51、cd52、cd54、cd56、cd62e、cd62p、cd62l、cd70、cd74、cd80、cd125、cd138、cd141、cd147、cd152、cd 154、cd326、cea、ctla-4、egfr、erbb2、erbb3、epcam、叶酸受体、fap、纤维结合蛋白剪接变异体(eda、edb、csiii)、gd2、gd3、gpnmb、hgf、her2、icam、igf-1受体、vegfr1、epha2、trpv1、cftr、gpnmb、ca9、cripto、ace、app、肾上腺素受体-β2、claudine 3、间皮素、乳凝集素、il-2受体、il-4受体、il-13受体、整合素(包括α4、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α1β4、α4β1、α4β7、α5β1、α6β4、αiibβ3整合素)、ifn-α、ifn-γ、ige、ige、igf-1受体、il-1、il-12、il-23、il-13、il-22、il-4、il-5、il-6、干扰素受体、itgb2(cd18)、lfa-1(cd11a)、l-选择素(cd62l)、粘蛋白、muc1、肌肉抑制素、nca-90、ngf、pdgfrα、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、绿脓假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、狂犬病、rankl、呼吸道融合病毒、恒河猴因子、slamf7、鞘氨醇-1-磷酸酯、tag-72、t细胞受体、腱生蛋白c、tgf-1、tgf-β2、tgf-β、tnf-α、trail-r1、trail-r2、肿瘤抗原ctaa16.88、vegf-a、vegfr2、波形蛋白、基质受体和类似标靶、细胞凋亡标记(例如磷酸-胆碱)
71、具体来说，如果载体分子特异性结合到her2、egfr、her3、muc1、epcam、cea、纤维结合蛋白-edb、cd19、cd20、cd22、ley、cd30、cd33、cd79b、gpnmb、psma、cd56、cd37、叶酸受体、ca6、cd27l、muc16、cd66e、cd74、trop-2或鸟苷酸环化酶，那么这是优选的。
72、本发明的载体分子可以是衍生自以下全抗体中任一者或与以下全抗体中任一者具有等效结合特异性的抗体片段：3f8、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)(reopro)、阿达木单抗(adalimumab)(humira)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、阿夫妥珠单抗(afutuzumab)、阿珠单抗(alacizumab)、ald518、阿仑单抗(alemtuzumab)(campath)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿玛西单抗(amatuximab)、麻安莫单抗(anatumomab)、安鲁金单抗(anrukinzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单抗(arcitumomab)(cea-scan)、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿利珠单抗(atlizumab)(托珠单抗(tocilizumab)，actemra，roactemra)、阿托木单抗(atorolimumab)、贝频珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)(simulect)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)(lymphoscan)、贝利单抗(belimumab)(benlysta)、贝那利珠单抗(benralizumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝索单抗(besilesomab)(scinitimun)、贝伐单抗(贝伐单抗)(avastin)、比西单抗(biciromab)(fibriscint)、比伐珠单抗(bivatuzumab)、布林莫单抗(blinatumomab)、贝伦妥单抗(brentuximab)、贝伐珠单抗(briakinumab)、康纳单抗(canakinumab)(ilaris)、坎妥珠单抗(cantuzumab)、卡罗单抗(capromab)、卡托莫西单抗(catumaxomab)(removab)、cc49、西利珠单抗(cedelizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)(erbitux)、西他土珠单抗(citatuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、昔瓦土单抗(clivatuzumab)、康纳木单抗(conatumumab)、cr6261、达西珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)(zenapax)、达土木单抗(daratumumab)、地诺单抗(denosumab)(prolia)、地莫单抗(detumomab)、阿托度单抗(dorlimomab)、多立珠单抗(dorlixizumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、艾库组单抗(eculizumab)(soliris)、埃巴单抗(edobacomab)、依决洛单抗(edrecolomab)(panorex)、依法利珠单抗(efalizumab)(raptiva)、依芬古单抗(efungumab)(mycograb)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾思莫单抗(elsilimomab)、恩莫单抗(enlimomab)、伊匹莫单抗(epitumomab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)(rexomun)、埃达珠单抗(etaracizumab)(abegrin)、艾韦单抗(exbivirumab)、法索单抗(fanolesomab)(neutrospec)、法拉莫单抗(faralimomab)、伐吐珠单抗(farletuzumab)、非维珠单抗(felvizumab)、非扎奴单抗(fezakinumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)(huzaf)、福拉韦单抗(foravirumab)、夫苏木单抗(fresolimumab)、加利昔单抗(galiximab)、甘替鲁单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、吉瑞昔单抗(girentuximab)、格雷巴土木单抗(glembatumumab)、戈利木单抗(golimumab)(simponi)、戈利昔单抗(gomiliximab)、伊巴珠单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、伊戈伏单抗(igovomab)(indimacis-125)、英西单抗(imciromab)(myoscint)、英利昔单抗(infliximab)(remicade)、英妥木单抗(intetumumab)、伊诺莫单抗(inolimomab)、伊珠单抗(inotuzumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、凯利昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)(cea-cide)、来金珠单抗(lebrikizumab)、来马索单抗(lemalesomab)、乐地单抗(lerdelimumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、利韦单抗(libivirumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)(bosatria)、美替木单抗(metelimumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗木单抗(morolimumab)、莫维珠单抗(motavizumab)(numax)、莫罗单抗(muromonab)-cd3(orthocloneokt3)、他那可单抗(nacolomab)、他那莫单抗(naptumomab)、那他珠单抗(natalizumab)(tysabri)、奈巴库单抗(nebacumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)(theracim)、诺非单抗(nofetumomab)、奥克雷珠单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗(odulimomab)、奥法木单抗(ofatumumab)(arzerra)、奥拉妥单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)(xolair)、翁提西珠单抗(ontecizumab)、奥普珠单抗(oportuzumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)(ovarex)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、帕昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)(synagis)、帕尼单抗(panitumumab)(vectibix)、帕诺库单抗(panobacumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、潘妥莫单抗(pemtumomab)(theragyn)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(omnitarg)、培克珠单抗(pexelizumab)、平妥莫单抗(pintumomab)、普立昔单抗(priliximab)、普托木单抗(pritumumab)、pro140、雷韦单抗(rafivirumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、雷珠单抗(ranibizumab)(lucentis)、雷昔库单抗(raxibacumab)、瑞加韦单抗(regavirumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)(rituxan)、罗妥木单抗(robatumumab)、罗塔利珠单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)(leukarrest)、鲁利单抗(ruplizumab)(antova)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomabpendetide)、司韦单抗(sevirumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西法木单抗(sifalimumab)、思图昔单抗(siltuximab)、西利珠单抗(siplizumab)、苏兰珠单抗(solanezumab)、索尼普西珠单抗(sonepcizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、司他莫单抗(stamulumab)、硫索单抗(sulesomab)(leukoscan)、他珠单抗(tacatuzumab)(afp-cide)、特特拉克斯坦(tetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、他尼珠单抗(tanezumab)、帕他普莫单抗(taplitumomab paptox)、替非珠单抗(tefibazumab)(aurexis)、阿替莫单抗(telimomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替奈昔单抗(teneliximab)、替利珠单抗(teplizumab)、tgn1412、替西木单抗(ticilimumab)(曲美木单抗(tremelimumab))、替加珠单抗(tigatuzumab)、tnx-650、托珠单抗(tocilizumab)(阿利珠单抗(atlizumab)，actemra)、托利珠单抗(toralizumab)、托西莫单抗(tositumomab)(bexxar)、曲妥珠单抗(herceptin)、曲美木单抗、土库珠单抗(tucotuzumab)、妥韦单抗(tuvirumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、优特克单抗(ustekinumab)(stelera)、伐利昔单抗(vapaliximab)、维多珠单抗(vedolizumab)、维托珠单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、维西珠单抗(visilizumab)(nuvion)、伏洛昔单抗(volociximab)(humaspect)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎芦木单抗(zalutumumab)(humex-egfr)、扎木单抗(zanolimumab)(humax-cd4)、齐拉木单抗(ziralimumab)和阿佐莫单抗(zolimomab)。
73、治疗剂优选是细胞毒性剂或细胞抑制剂。
74、对于细胞毒性剂，我们意指典型地通过杀伤细胞而对细胞具毒性的药剂。毒性可以通过坏死或细胞凋亡导致细胞死亡。
75、对于细胞抑制剂，我们意指抑制或终止细胞生长和/或繁殖的药剂。
76、优选地，治疗剂选自以下类别的治疗剂：细胞周期进程抑制剂、血管生成抑制剂、mapk信号传导路径抑制剂、pi3k/m-tor/akt路径抑制剂、激酶抑制剂、rtk抑制剂、hdac抑制剂、蛋白质伴侣蛋白抑制剂、parp抑制剂、wnt/hedgehog/notch信号传导路径抑制剂、rna聚合酶抑制剂、dna结合药物、dna损害药物、dna烷基化药物、微管稳定剂、微管去稳定剂、铂化合物、激酶抑制剂、吡啶并咔唑和其衍生物和拓扑异构酶异i和ii抑制剂。
77、dna结合或烷基化药物的实例包括cc-1065和其类似物、蒽环霉素(anthracycline)(例如阿霉素、表柔比星(epirubicin)、艾达霉素(idarubicin)、道诺霉素(daunorubicin))和其类似物、玫瑰树碱和其衍生物、烷基化剂(例如卡奇霉素(calicheamicin)、放线菌素(dactinomycin)、丝裂霉素(mitromycin)、吡咯并苯并二氮呯)和衍生物。
78、cc-1065类似物的实例包括多卡霉素(duocarmycin)sa、多卡霉素c1、多卡霉素c2、多卡霉素b2、du-86、kw-2189、比折来新(bizelesin)、断-阿多来新(seco-adozelesin)和其衍生物。
79、微管稳定和去稳定剂的实例包括紫杉烷化合物，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)；类美登素；海兔毒素；西马多丁(cemadotin)；奥瑞他汀和其类似物；微管溶素a和b衍生物；长春花生物碱衍生物；埃博霉素(epothilone)；和隐藻素(cryptophycin)。
80、类美登素或类美登素类似物的实例包括美登醇(maytansinol)和美登醇类似物、美登素(maytansine)或dm-1和dm-4。奥瑞他汀的实例包括奥瑞他汀e(海兔毒素-10的衍生物)、奥瑞他汀eb、奥瑞他汀efp、单甲基奥瑞他汀e(mmae)、单甲基奥瑞他汀f(mmaf)、奥瑞他汀f和海兔毒素。长春花生物碱的实例包括长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)和诺维本(navelbine)(长春瑞滨(vinorelbine))。埃博霉素化合物的实例包括埃博霉素a、b、c、d、e和f和其衍生物。铂化合物的实例包括顺铂(cisplatin)卡铂(carboplatin)奥沙利铂(oxaliplatin)异丙铂(iproplatin)、欧恩纳铂(onnaplatin)和四铂(tetraplatin)。拓扑异构酶i抑制剂的实例包括喜树碱(camptothecin)、喜树碱衍生物、喜树碱类似物和非天然喜树碱，例如cpt-11(伊立替康(irinotecan))、sn-38、拓扑替康(topotecan)、9-氨基喜树碱、9-溴喜树碱、二氟替康(diflomotecan)、鲁比替康(rubitecan)、赛拉替康(silatecan)、勒托替康(lurtotecan)、依沙替康(exatecan)、贝洛替康(belotecan)、吉马替康(gimatecan)、卡仑尼替星(karenitecin)、勒托替康和s39625。
81、血管生成抑制剂的实例包括vegf抑制剂、metap2抑制剂、p1gf抑制剂、vgfr抑制剂、pdgfr抑制剂。vgfr和pdgfr抑制剂的实例包括索拉非尼(sorafenib)舒尼替尼(sunitinib)和瓦他拉尼(vatalanib)。细胞周期进程抑制剂的实例包括cdk抑制剂，例如bms-387032和pd0332991；rho激酶抑制剂，例如gsk429286；关卡激酶抑制剂，例如azd7762；极光激酶抑制剂，例如azd1152、mln8054和mln8237；plk抑制剂，例如bi2536、bi6727(volasertib)、gsk461364、on-01910(estybon)；和ksp抑制剂，例如sb743921、sb 715992(伊斯平斯(ispinesib))、mk-0731、azd8477、az3146和arry-520。pi3k/m-tor/akt信号传导路径抑制剂的实例包括磷酸肌醇3-激酶(pi3k)抑制剂、gsk-3抑制剂、atm抑制剂、dna-pk抑制剂和pdk-1抑制剂。
82、pi3激酶的实例包括bez235、bgt226、bkm120、cal101、cal263、去甲氧基甲绿胶霉素(demethoxyviridin)、gdc-0941、gsk615、ic87114、ly294002、palomid 529、哌立福新(perifosine)、pf-04691502、px-866、sar245408、sar245409、sf1126、渥曼青霉素(wortmannin)、xl147和xl765。akt抑制剂的实例包括at7867。mapk信号传导路径抑制剂的实例包括mek、ras、jnk、b-raf和p38 mapk抑制剂。mek抑制剂的实例包括gdc-0973、gsk1120212、msc1936369b、as703026、ro5126766和r04987655、pd0325901、azd6244、azd8330和gdc-0973。b-raf抑制剂的实例包括cdc-0879、plx-4032和sb590885。
83、p38 mapk抑制剂的实例包括birb 796、ly2228820和sb 202190。
84、受体酪氨酸激酶(rtk)调节剂/抑制剂的实例包括抗erbb2受体药物，例如aee788(nvp-aee 788)、bibw2992(阿法替尼(afatinib))、拉帕替尼(lapatinib)、埃罗替尼(erlotinib)和吉非替尼(gefitinib)
85、
86、多特异性rtk抑制剂的实例包括靶向fgfr、flt-3、vegfr-pdgfr和bcr-abl受体的ap24534(普纳替尼(ponatinib))；靶向flt-3和vegfr-pdgfr受体的abt-869(立尼法尼(linifanib))；靶向vegfr-pdgfr、flt-1和vegf受体的azd2171；靶向vegfr-pdgfr、fgfr、flt-3和c-kit受体的chr-258(多韦替尼(dovitinib))；靶向vegfr、pdgfr、kit、flt-3和csf-ir的舒尼替尼(sutent)；靶向vegfr、pdgfr、raf/mek/erk路径的丝氨酸/苏氨酸激酶和玫瑰树碱的索拉非尼和瓦他拉尼。
87、蛋白质伴侣蛋白抑制剂的实例包括hsp90抑制剂，例如17aag衍生物、biib021、biib028、snx-5422、nvp-auy-922和kw-2478。hdac抑制剂的实例包括贝林司他(belinostat)(pxd101)、cudc-101、决昔诺司他(droxinostat)、itf2357(吉韦诺他(givinostat)，加韦诺他(gavinostat))、jnj-26481585、laq824(nvp-laq824，达欣斯特(dacinostat))、lbh-589(帕比司他(panobinostat))、mc1568、mgcd0103(莫塞诺他(mocetinostat))、ms-275(恩替诺特(entinostat))、pci-24781、吡咯沙敏(pyroxamide)(nsc 696085)、sb939、曲古抑菌素a(trichostatin a)和伏立诺他(vorinostat)(saha)。parp抑制剂的实例包括依尼帕瑞(iniparib)(bsi 201)、奥拉帕尼(olaparib)(azd-2281)、abt-888(维利帕瑞(veliparib))、ag014699、cep 9722、mk 4827、ku-0059436(azd2281)、lt-673、3-氨基苯甲酰胺、a-966492和azd2461。wnt/hedgehog信号传导路径抑制剂的实例包括维莫德吉(vismodegib)(rg3616/gdc-0449)、环巴胺(cyclopamine)(11-去氧芥芬胺)(hedgehog路径抑制剂)和xav-939(wnt路径抑制剂)。notch路径抑制剂的实例包括γ-分泌酶抑制剂mk0752、ro4929097、pf-03084,014、ly450139、bms-708163、γ-分泌酶改性剂mpc-7869和显性阴性mastermind/csl/notch化合物。
88、rna聚合酶抑制剂的实例包括鹅膏毒素(amatoxin)，例如α-鹅膏菌素(α-amanitin)、β-鹅膏菌素、γ-鹅膏菌素、ε-鹅膏菌素、一羟鹅膏毒素酰胺(amanullin)、一羟鹅膏毒肽羧酸(amanullic acid)、三羟鹅膏毒肽酰胺(amaninamide)、鹅膏素(amanin)和二羟鹅膏毒肽酰胺原(proamanullin)。
89、药物有效负载可以以合成方式修饰以使其可使用多种方法(表2)共轭到生物分子(例如抗体)。此类化学修饰描述于[chari rv等人《应用化学国际英文版》.2014,53,3796-827]中。实例包括美登素派生物、mmae和mmaf、阿霉素、西马多丁、sn38和p5(海兔毒素-15中存在的五肽)和吡咯并苯并二氮呯二聚体(pbd)。
90、类美登素在本领域中是熟知的，并且适用于共轭到细胞结合剂上的衍生物可以根据美国专利第5,208020号、第5,416064号、第7,276497号和[chari rv等人《药物化学杂志》2006,49,4392]和[chari rv等人《药物化学杂志》2011,22,717]中完全公开的已知方法以合成方式制备。具有异双官能连接子的硫醇封端的类美登素处的反应产生经反应性nhs酯封端的不可还原稳定连接用于直接共轭到细胞结合剂上，如wo 2010/141566和[chari rv等人]《药物化学杂志》2011,54,3606中所公开。异双官能连接子除了胺反应性n-羟基琥珀酰亚胺nhs酯和巯基反应性末端之外，还含有带负电的磺酸酯基或亲水性不带电的peg基。
91、包括单甲基奥瑞他汀e(mmae)的奥瑞他汀描述于美国专利第20060074008号和[senter pd等人]《自然·生物技术》2003,21,778中，其公开了一种具有蛋白酶敏感性缬氨酸-瓜氨酸二肽作为组织蛋白酶b的裂解位点和自我牺牲型氨基甲酸对氨基苯甲酯的连接子。具有不可裂解连接子的单甲基奥瑞他汀f(mmaf)共轭物描述于美国专利第20110070428号中。
92、cc-1065和多卡霉素家族的环丙基吲哚dna烷基化剂的类似物公开于[goldmachervs等人《癌症研究》,1995,55,4079]和美国专利第8680293号中。
93、吡咯并苯并二氮呯二聚体(pbd)和共轭物已经描述于[senter pd等人《生物共轭化学》2013,24:1256；mcearchern ja等人《血液》,2013,122:1455]和美国专利第2014234346号和wo 2014 031566中
94、道诺霉素/阿霉素类似物也是适合有效负载并且已经在[firestone ra等人《控制释放杂志(j.controlled release)》,1996,39:251]和wo2012024223中公开作为马来酰亚氨基封端的药物。可释放组织蛋白酶b的阿霉素公开于[dubowchik g m等人《生物共轭化学》,2002,13,855]中。更有力的衍生物阿霉素-2-吡咯啉基和吗啉基-阿霉素公开于[senter pd等人《生物有机化学与医药化学快报(bioorg.med.chem.lett)》2006,16:358]和wo2014124227中。具有反应性酯基的奈莫柔比星(nemorubicin)(阿霉素的代谢物)衍生物和共轭物公开于美国专利第2014227299号中
95、可以使用的紫杉烷公开于[ojima i等人《药物化学杂志》2002,45,5620]和[ojimai《化学研究述评(acc.chem.res)》2008,41,108]和美国专利第72766499号中
96、sn-38，拓扑异构酶抑制剂伊立替康(喜树碱衍生物)的活性代谢物是适合有效负载，并且具有可裂解的并且并入peg的连接子的共轭物公开于[goldenberg dm等人《药物化学杂志》2008,51:6916]和wo2010/093395中
97、隐藻素属于最有力的抗有丝分裂剂，并且经由马来酰亚胺和反应性酯形成的共轭物公开于wo 2011/001052中。
98、微管溶素与海兔毒素-10具有结构类似性并且呈现作为微管蛋白修饰剂的高效力。这些和更简单的前微管溶素(pretubulysin)变异体公开于wo2014/0227295和[kazmaier u等人《欧洲有机化学杂志(eur.j.org.chem.)》2011,3050]中。
99、近期研究用作有效负载的一类有力药物是rna聚合酶ii抑制剂，例如α-鹅膏菌素，鹅膏毒素的双环八肽组分。到赖氨酸残基上的共轭物通过以下方式形成：用碳酸二琥珀酰亚胺酯活化胺封端的鹅膏菌素过夜，随后与细胞结合剂反应，如wo2012/041504中所公开
100、优选的治疗剂选自西马多丁、p5(西马多丁的早期前体)、p5-c5(具有5碳间隔基的p5)、阿霉素、玫瑰树碱、mmae、mmaf、太平洋紫杉醇、奥瑞他汀、美登素、海兔毒素、喜树碱、sn-38和吡咯并苯并二氮呯二聚体(pbd)、pnu-159862和吲哚啉并苯并二氮呯二聚体(ign)。
101、根据本发明的化合物的特定实例包括(但不限于)其中：
102、(i)所述载体分子是scfv并且所述治疗剂是西马多丁；
103、(ii)所述载体分子是scfv并且所述治疗剂是阿霉素
104、(iii)所述载体分子是scfv并且所述治疗剂是玫瑰树碱。
105、(iv)所述载体分子是scfv并且所述治疗剂是mmae。
106、(v)所述载体分子是scfv并且所述治疗剂是(p5)-c5。
107、(vi)所述载体分子是scfv并且所述治疗剂是美登素
108、(vii)所述载体分子是scfv并且所述治疗剂是吡咯并苯并二氮呯二聚体(pbd)。
109、(viii)所述载体分子是scfv并且所述治疗剂是mmaf。
110、这些特定实例可以使用任何scfv作为载体分子，但scfv的优选实例是结合到her2者，例如scfv(c6.5)或其修饰形式scfv(tct)(seq id no:2，参看实例27)。scfv的替代性优选实例是具有seq id no.4或seq id no.5的氨基酸序列的那些。
111、在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明的第一方面的化合物和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
112、在本发明的第三方面，提供了第一或第二方面的化合物或组合物，其用于诊断、治疗和/或预防疾病。
113、在本发明的第四方面，提供了第一或第二方面的化合物或组合物，其用于诊断、治疗和/或预防选自以下的疾病：癌症；良性肿瘤；传染病，包括细菌、病毒、真菌、锥虫、线虫和朊病毒感染；心血管疾病；和自身免疫疾病。
114、在本发明的第五方面，提供了如第一和第二方面中任一项所定义的化合物或组合物，其用于制造供治疗和/或预防选自以下的疾病用的药剂：癌症；良性肿瘤；传染病，包括细菌、病毒、真菌、锥虫、线虫和朊病毒感染；心血管疾病；和自身免疫疾病。
115、在本发明的第六方面，提供了一种治疗或预防选自以下的疾病的方法：癌症；良性肿瘤；传染病，包括细菌、病毒、真菌、锥虫、线虫和朊病毒感染；心血管疾病；和自身免疫疾病。
116、在本发明的第三、第四、第五和第六方面，疾病可以是例如以下的癌症：
117、实体肿瘤，包括(但不限于)：肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、绒膜癌、脊索瘤、血管肉瘤、甲状腺、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤(ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、胰脏癌、骨癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、食道癌、胃癌(例如，胃肠癌)、口腔癌、鼻癌、喉癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓性癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯氏肿瘤(wilms'tumor)、子宫颈癌、腹膜癌、肝细胞癌、肝肿瘤、唾液癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌、头颈癌、肾细胞癌、急性退行性大细胞癌、皮肤退行性大细胞癌、子宫癌、睾丸癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肺癌、非小细胞肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤，血液癌，包括(但不限于)：急性成淋巴细胞性白血病(all)、急性成淋巴细胞性b细胞白血病、急性成淋巴细胞性t细胞白血病、急性成骨髓细胞性白血病(aml)、急性前髓细胞性白血病(apl)、急性成单核细胞性白血病、急性红白血病性白血病、急性成巨核细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、急性未分化的白血病、慢性髓细胞性白血病(cml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性和慢性白血病，淋巴瘤，例如霍奇金氏病(hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin'slymphoma)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、重链病、真性红细胞增多症(polycythemia vera)。
118、疾病或者可以是例如以下的自身免疫疾病：
119、活性慢性肝炎、阿狄森氏病(addison's disease)、过敏性肺泡炎、变态反应、过敏性鼻炎、阿尔波特氏综合征(alport's syndrome)、过敏反应、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、关节炎、蛔虫病、曲霉病、萎缩性过敏症、萎缩性皮炎、萎缩性鼻炎、白塞氏病(behcet'sdisease)、支气管哮喘、卡普兰氏综合征(caplan's syndrome)、心肌病、脂泻病、恰加斯氏病(chagas'disease)、慢性丝球体肾炎、柯根氏综合征(cogan's syndrome)、冷凝集素病、先天性风疹感染、crest综合征、克罗恩氏病(crohn's disease)、冷球蛋白血症、库欣氏综合征(cushing's syndrome)、皮肌炎、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征(dressler'ssyndrome)、伊顿-兰伯特综合征(eaton-lambert syndrome)、埃可病毒感染、脑脊髓炎、内分泌眼病、艾伯斯坦-巴尔病毒(艾伯斯坦-巴尔病毒)感染、马肺气肿病、红斑、埃文斯综合征(evan'ssyndrome)、费尔蒂氏综合征(felty's syndrome)、纤维肌痛、法曲氏睫状体炎(fuch's cyclitis)、胃萎缩、胃肠过敏症、巨细胞动脉炎、丝球体肾炎、古德帕斯丘氏综合征(goodpasture's syndrome)、移植物抗宿主疾病、格雷夫斯氏病(graves'disease)、格林-巴利病(guillain-barre disease)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto's thyroiditis)、溶血性贫血、亨诺-许兰紫癜(henoch-schonlein purpura)、特发性肾上腺萎缩、特发性肺纤维化、iga肾病、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(i型)、兰伯特-伊顿综合征、蹄叶炎、扁平苔癣、类狼疮肝炎、淋巴球減少症、美尼尔氏病(meniere'sdisease)、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、多腺综合征、早老性痴呆、原发性无γ球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺现象(raynauds phenomenon)、复发性流产、莱特尔氏综合征(reiter's syndrome)、风湿热、类风湿性关节炎、萨姆普特氏综合征(sampter's syndrome)、血吸虫病、施密特氏综合征(schmidt's syndrome)、硬皮病、舒尔曼氏综合征(shulman'ssyndrome)、斯耶格伦氏综合征(sjorgen's syndrome)、交感性眼炎、全身红斑性狼疮、颞动脉炎、甲状腺炎、血小板减少症、甲状腺中毒症、中毒性表皮坏死溶解、b型胰岛素抗性、i型糖尿病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉牙肿病(wegener's granulomatosis)。
120、优选地，疾病选自结肠癌、肺癌、乳癌、头/颈癌、前列腺癌、皮肤癌、胃/胃肠癌、膀胱癌、神经胶质瘤、肾癌、卵巢癌、甲状腺癌和骨癌。
121、在本发明的第七方面，提供了一种制备如第一或第二方面中所定义的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
122、(i)提供治疗剂；
123、(ii)提供载体分子；
124、(iii)在至少一种极性非质子溶剂和水性缓冲剂存在下共轭所述治疗剂与所述载体分子。
125、术语“非质子溶剂”意指不具有oh基并且因此无法供给氢键的溶剂。
126、适当极性非质子溶剂是(但不限于)由以下组成的群组：二甲亚砜(dmso)；乙腈；n,n-二甲基甲酰胺(dmf)；二甲基乙酰胺(dma)；hmpa；二噁烷；四氢呋喃(thf)；二硫化碳；乙二醇二甲醚和二乙二醇二甲醚；2-丁酮(mek)；环丁砜；硝基甲烷；n-甲基吡咯烷酮；吡啶；和丙酮。可以使用的其它极性非质子溶剂为本领域技术人员所熟知。
127、作为此方法的一部分的共轭治疗剂与载体分子的步骤优选使用以下参数中的任一者或其组合执行：
128、●约0℃与约37℃之间、优选约10到约30℃的温度。
129、●约6.0与约10.0之间、优选约7.5到约9的ph。
130、●持续0.1小时与48小时之间。
131、本发明的方法还可以包括一个或多个选自以下的其它步骤：
132、(iv)使用赋形剂促进反应
133、(v)预孵育溶剂和缓冲剂组分以最小化不良混合效应
134、(vi)时间上受控地添加反应组分
135、(vii)将所述化合物与药学上可接受的载剂组合以形成药物组合物。
1.一种化合物，其包含以5:1的最小偶合比偶合到载体分子的治疗剂；其中所述载体分子是(i)抗体片段或其衍生物或(ii)抗体模拟物或其衍生物；并且其中所述治疗剂偶合到赖氨酸氨基酸残基上；并且此外其中所述治疗剂不是光敏剂。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述治疗剂和所述载体分子在偶合形式下的功能和物理特性与非偶合形式下的特性相比定性地大体上不变。
3.根据权利要求1到2中任一项所述的化合物，其中所述化合物的ic50是100nm或更低。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物的ic50比非共轭时的所述治疗剂低出至少10倍。
5.一种药物组合物，其包含根据权利要求1到4中任一项所述的化合物和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
6.权利要求1到5中任一项所述的化合物或组合物，其用于诊断、治疗和/或预防疾病。
7.权利要求1到5中任一项所述的化合物或组合物用于制造供治疗和/或预防选自以下的疾病用的药剂的用途：癌症；良性肿瘤；传染病，包括细菌、病毒、真菌、锥虫、线虫和朊病毒感染；心血管疾病；和自身免疫疾病。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述疾病是结肠癌、肺癌、乳癌、头/颈癌、前列腺癌、皮肤癌、胃/胃肠癌、膀胱癌、神经胶质瘤、肾癌、卵巢癌、甲状腺癌和骨癌。
9.一种制备根据权利要求1到4中任一项所述的化合物的方法，其包含以下步骤：
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种极性非质子溶剂选自由以下组成的群组：二甲亚砜(dmso)；乙腈；n,n-二甲基甲酰胺(dmf)；hmpa；二噁烷；四氢呋喃(thf)；二硫化碳；乙二醇二甲醚和二乙二醇二甲醚；2-丁酮(mek)；环丁砜；硝基甲烷；n-甲基吡咯烷酮；吡啶；和丙酮。
