一种糖基化核桃肽钙螯合物及其制备方法和应用

本发明涉及肽钙螯合物领域，尤其涉及一种糖基化核桃肽钙螯合物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、核桃（ juglans regia l.）又名胡桃、羌桃，是胡桃科（ juglandaceae）核桃属（ juglans）的落叶乔木树种，世界四大坚果之一，享有“益智果”、“万岁子”、“长寿果”的美称。核桃富含多种对人体有益的营养物质，被广泛应用于食品加工及医药研发等方面。

2、在我国由于核桃富含油脂，大部分用于榨油，只有少部分核桃采收后未经加工直接食用。榨油加工过程中往往会产生大量核桃粕。作为核桃油提取的副产品，核桃粕含有40%以上的蛋白质，这些蛋白质具有较高含量的必需氨基酸。然而，大多数脱脂核桃粕（dwm）常被用作肥料或动物饲料，造成了优质蛋白质资源的巨大浪费。近年来，对dwm的深加工有了较大的关注，为充分利用核桃粕资源，目前广泛应用水解脱脂核桃粕蛋白（dwmp）制备天然生物活性肽（dwmph）。dwm和dwmph的利用率在逐年提高，而对于dwmph促钙吸收方面的研究很少见报道。

3、市场上主要有无机钙、有机钙、氨基酸钙螯合物及多肽钙螯合物四类补钙剂产品。钙螯合肽作为一种新兴的矿物质补充剂，因其稳定性、吸附性和安全性等优点而受到人们的广泛关注。氨基酸组成和肽序列是影响肽钙结合能力的最重要因素。国内外学者对于具有促进钙吸收活性的肽已做了很多研究，越来越多的钙结合肽段从食物蛋白中被鉴定出来。肽分子量大小、所带电荷、以及亲水性同样影响着肽钙螯合物的螯合能力。修饰改性是蛋白及多肽加工中常用的技术手段，通过改性可改变多肽结构进而提高其钙结合能力，在目前钙离子螯合食物源蛋白肽的研究中有利用磷酸化和脱酰胺化等化学法对金属多肽进行改性研究。温庆辉等对珠蚌肽进行磷酸化改性后与钙螯合使其持钙能力得到增强，珠蚌肽经磷酸化改性后钙质量分数由3.3%增加到7.3%。崔宇等利用酸法和酶法对大豆肽进行脱酰胺改性，结果显示，酸法和酶法脱酰胺均可改善大豆肽螯合钙的能力。但目前对于糖基化改性肽能否提高钙结合能力的相关研究还较少。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明从脱脂核桃粕中分离到特定的肽经壳寡糖（cos）糖基化反应，制备具有高钙结合能力的糖基化肽钙螯合物，糖基化反应能够进一步提高肽与钙螯合的能力，制备得到的螯合物具有更好的热稳定性和酸稳定性，并提高在肠道中的生物利用率，能够用于制备生物补钙剂。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种糖基化核桃肽钙螯合物，所述肽的氨基酸序列为mmgged；所述肽钙螯合物的结构式如下：壳寡糖cos-mmgged-ca。糖基化核桃肽cos-mmgged与ca2+之间螯合后，形状棱角明晰、结构致密，为无定形结构；蛋白质二级结构发生改变，α-螺旋和不规则卷曲减少，β-折叠和β-转角增加，更好地与ca2+螯合，且具有良好的热稳定性和酸稳定性。

3、本发明还提供所述糖基化核桃肽钙螯合物的制备方法，所述方法操作如下：通过超滤分离获得≤1 kda的核桃肽wnp，并经trince-sds-page凝胶电泳分离，液相二级质谱lc-ms/ms鉴定，分子对接模拟筛选出具有高钙结合能力的潜在多肽，采用固相合成的方法合成纯化潜在多肽；

4、壳寡糖cos与多肽mmgged进行糖基化反应得到糖基化肽cos-mmgged，糖基化肽cos-mmgged与ca2+螯合制备糖基化核桃肽钙螯合物。

5、作为对上述方案的进一步描述：超滤分离获得≤1 kda的核桃肽的过程如下：将核桃粕采用碱溶酸沉法提取核桃蛋白，核桃蛋白经碱性蛋白酶酶解后得到核桃蛋白肽，用截留分子量为≤1 kda的超滤管分离核桃肽并收集超滤管的下部馏分冷冻干燥，经trince-sds-page凝胶电泳分离。

6、作为对上述方案的进一步描述：所述lc-ms/ms鉴定≤1kda核桃肽的过程如下：将分离后的凝胶电泳胶条切至0.5 ~1 mm3大小，切好的胶条转移至ep管并做好标记；加入脱色液于36-38℃脱色；加入二硫苏糖醇dtt于50-60℃还原0.5-1.5 h；加入碘乙酰胺iam，室温避光30-60 min；提取并真空抽干备用；

7、lc-ms/ms鉴定多肽：一级质谱参数：resolution为70000 at 200 m/z，agctarget为16，maximum it为50 ms，dynamic exclusion为30.0 s；二级质谱参数：resolution at200 m/z，normalized collision energy为27 ev，underfill为0.1%，activation type为hcd，isolation window为2 m/z；质谱测试原始文件用搜索引擎max quant1.6.14检索对比相应的蛋白质数据库，得到多肽分子质量和氨基酸序列；数据库采用uniprot网站下载的蛋白数据库（uniprot juglans regia l. unique. fasta）。

8、作为对上述方案的进一步描述：采用分子对接模拟方法筛选出具有高钙结合能力的肽的过程如下：利用yinfo云平台中的dock 6.9软件对挑选出的多肽与ca进行分子对接，ca的三维结构来源于蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)，肽结构在dock6.9协议中绘制，由配体定义，亲和网格地图以0.375 å间距生成，并计算每个姿态的网格分数，最后，基于网格分数输出最佳姿态；并结合鉴定出肽序列氨基酸出现概率，选取氨基酸序列为ppsssgn、atrgrp、mmgged的三个肽段合成进行后续试验以挑选出螯合能力最佳肽段。

9、作为对上述方案的进一步描述：利用壳寡糖cos改性得到糖基化肽cos-mmgged的过程如下：

10、将多肽mmgged与壳寡糖cos混溶于超纯水中，调节反应体系ph为6.0-7.0，室温搅拌反应1-2h，2-6℃环境下静置10-15h；在密封条件下60-85℃水浴反应2-5 h，迅速冷却至室温结束反应，以500～1000 da透析袋透析，2500-3500 r/min、离心8-15 min，取上清液冷冻干燥，得到冻干糖基化肽cos-mmgged；

11、所述多肽mmgged与壳寡糖cos的质量比为1：1.0-1.2；多肽mmgged与水的质量体积比为1：30-40。

12、作为对上述方案的进一步描述：将冻干的糖基化肽cos-mmgged溶解于水中浓度为40-80 mg/ml，加入cacl2，使糖基化肽cos-mmgged与cacl2的质量比为1.5-2.5：1并调节ph至6.5-7.5，50-65℃水浴反应螯合40-80 min，螯合反应结束后，将反应溶液体积8-10倍的无水乙醇添加到反应体系中，最后将混合物在2-5℃以6000-11000×g离心8-12min，收集沉淀物，冷冻干燥，得到糖基化肽钙cos-mmgged-ca螯合物。

13、本发明还提供所述糖基化核桃肽钙螯合物在制备生物补钙剂中的应用。

14、作为对上述方案的进一步描述：所述cos-mmgged-ca能上调trpv6、calbindind9k的蛋白表达水平。

15、本发明的特点如下：（1）本发明通过超滤处理方法获得≤1 kda分子量段核桃肽（wnp），并经液相色谱质谱联用仪（lc-ms/ms）鉴定，鉴定出21条多肽，针对21条多肽制作氨基酸序列表，并筛选出具有高钙结合能力肽段，利用cos改性制备糖基化肽钙螯合物，经测定改性后的糖基化肽与钙螯合的能力出现了增长的趋势。

16、（2）通过多种结构表征方法分析cos-mmgged-ca的结构特征。结果表明：红外光谱分析结果显示，cos-mmgged与ca2+之间发生了螯合反应，螯合的主要方式是通过ca2+与mmgged中氨基氮原子和羧基氧原子之间的相互作用。紫外可见吸收光谱结果和荧光光谱结果显示，cos-mmgged与ca2+发生螯合反应并生成螯合物。扫描电子显微镜结果显示，cos-mmgged-ca形貌棱角明晰，结构致密。x-射线衍射结果显示，cos-mmgged-ca衍射峰弥散，为无定形结构。圆二色谱结果显示，mmgged经糖基化改性螯合钙后，蛋白质二级结构发生改变，α-螺旋和不规则卷曲减少，β-折叠和β-转角增加。分子动力学结果表明，cos-mmgged对于ca2+的模拟结合主要依靠cos-mmgged的c端及中部r基的羧基部分，ca2+与cos-mmgged作用过程中涉及的结合位点氨基酸主要为天冬氨酸（d）和谷氨酸（e）。

17、（3）通过综合热分析（tg-dsc）、酸碱稳定性和体外模拟胃肠道消化实验评价cos-mmgged-ca的稳定性。综合热分析和酸碱稳定性实验结果表明，cos-mmgged-ca具有较高稳定性。体外模拟胃肠道消化实验结果表明，cos-mmgged-ca可有效延长钙在胃肠道环境中的降解时间，提高其肠道中的生物利用率。

18、（4）构建caco-2细胞单层膜模型，通过检测钙跨膜转运量、caco-2细胞摄取ca2+情况和trpv6钙离子通路相关蛋白的相对表达量。对trpv6钙离子通路相关蛋白的相对表达量测定结果显示，cos-mmgged-ca能显著上调caco-2细胞中trpv6、calbindind9k的蛋白表达水平。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的糖基化核桃肽钙螯合物较普通肽钙螯合物具有更为优异的载钙能力，具备开发新型生物补钙剂的潜能，以核桃粕为原料分离多肽，原料来源丰富，同时提高了核桃粕利用率，避免资源的浪费。所述糖基化核桃肽钙螯合物具有良好稳定性，能有效延长钙在胃肠道环境中的降解时间，提高在肠道中的生物利用率，另外糖基化核桃肽钙螯合物也能促进对ca2+转运量和摄取量。

技术特征：

1.一种糖基化核桃肽钙螯合物，其特征在于，所述肽的氨基酸序列为mmgged；所述肽钙螯合物的结构式如下：壳寡糖cos-mmgged-ca。

2.根据权利要求1所述的糖基化核桃肽钙螯合物的制备方法，其特征在于，所述方法操作如下：通过超滤分离获得≤1 kda的核桃肽，并经trince-sds-page凝胶电泳分离，液相二级质谱lc-ms/ms鉴定，分子对接模拟筛选出具有高钙结合能力的潜在多肽，采用固相合成的方法合成纯化潜在多肽；

3.根据权利要求2所述的糖基化核桃肽钙螯合物的制备方法，其特征在于，超滤分离获得≤1 kda的核桃肽的过程如下：将核桃粕采用碱溶酸沉法提取核桃蛋白，核桃蛋白经碱性蛋白酶酶解后得到核桃蛋白肽，用截留分子量为≤1 kda的超滤管分离核桃肽并收集超滤管的下部馏分冷冻干燥，经trince-sds-page凝胶电泳分离。

4.根据权利要求2所述的糖基化核桃肽钙螯合物的制备方法，其特征在于，采用分子对接模拟方法筛选出具有高钙结合能力的肽的过程如下：利用yinfo云平台中的dock 6.9软件对挑选出的多肽与ca进行分子对接，ca的三维结构来源于蛋白质数据库，肽结构在dock6.9协议中绘制，由配体定义，亲和网格地图以0.375 å间距生成，并计算每个姿态的网格分数，最后，基于网格分数输出最佳姿态；并结合鉴定出肽序列氨基酸出现概率，选取氨基酸序列为ppsssgn、atrgrp、mmgged的三个肽段合成进行后续试验以挑选出螯合能力最佳肽段。

5.根据权利要求2所述的糖基化核桃肽钙螯合物的制备方法，其特征在于，利用壳寡糖cos改性得到糖基化肽cos-mmgged的过程如下：

6.根据权利要求5所述的糖基化核桃肽钙螯合物的制备方法，其特征在于，将冻干的糖基化肽cos-mmgged溶解于水中浓度为40-80 mg/ml，加入cacl2，使糖基化肽cos-mmgged与cacl2的质量比为1.5-2.5：1并调节ph为6.5-7.5，50-65℃水浴反应螯合40-80 min，螯合反应结束后，将反应溶液体积8-10倍的无水乙醇添加到反应体系中，最后将混合物在2-5℃下以6000-11000×g离心8-12min，收集沉淀物，冷冻干燥，得到糖基化肽钙cos-mmgged-ca螯合物。

7.根据权利要求1所述的糖基化核桃肽钙螯合物在制备生物补钙剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的糖基化核桃肽钙螯合物在制备生物补钙剂中的应用，其特征在于，所述cos-mmgged-ca能上调trpv6、calbindind9k的蛋白表达水平。

技术总结
本发明公开了一种糖基化核桃肽钙螯合物及其制备方法和应用，所述螯合物的结构式如下：壳寡糖COS‑MMGGED‑Ca。本发明通过超滤分离获得≤1kDa的核桃肽，并经Trince‑SDS‑PAGE凝胶电泳验证，液相二级质谱鉴定，筛选出具有高钙结合能力的肽，固相合成纯化肽，利用COS改性得到糖基化肽，糖基化肽与Ca<supgt;2+</supgt;螯合制备糖基化核桃肽钙螯合物。本发明提供的糖基化核桃肽钙螯合物较普通肽钙螯合物具有更为优异的载钙能力，具备开发新型补钙剂的潜能，以核桃粕为原料分离多肽，原料来源丰富，避免资源浪费。所述糖基化核桃肽钙螯合物具有良好稳定性，提高在肠道中的生物利用率，另外也能促进对Ca<supgt;2+</supgt;转运量和摄取量。

技术研发人员：陶亮,田洋,王紫琳,刘俐彤,蒋海芬,代佳和,王一帆,顾瑞静
受保护的技术使用者：云南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23