本发明属于分子生物学领域，具体地说，是关于一种通用型检测rna甲基转移酶活性的方法。
背景技术：
1、rna分子的供体和转录后修饰发生在所有的生命王国中，而且这些修饰大多包括甲基化步骤。甲基转移到rna核苷是由rna甲基转移酶（rna mtases）催化的，几乎只使用s-腺苷甲硫氨酸（sam）作为甲基供体。rna甲基转移酶负责多种rna底物中核苷酸的共转录和转录后甲基化。检查这些酶的靶标特异性、催化活性和功能需要体外甲基化测定。
2、目前已有相关rna甲基转移酶活性检测方法的专利报道。最早的方案是底物放射性标记，反应在[甲基-3h]-sam和短gpppx-rna之间进行，对转移的[3h]ch3进行定量分析然后使用tlc产物分离和放射性计数进行分组。通过使用放射性标记的rna/核苷酸，可以观察核苷酸底物结构中出现的变化。该方法安全性低，存在放射性污染，且步骤繁琐，实验环境要求高，成本高。近年来，陆续开发了一些非放射性标记的方法。
3、cn106053795a利用免疫学方法检测sah的含量，来确定反应体系中甲基转移酶的活性。该方案涉及蛋白-sah偶联物的制备及使用，较为复杂。
4、cn116840197a利用s-腺苷-l-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶将生成的s-腺苷-l-同型半胱氨酸不可逆地转化为同型半胱氨酸；硫醇特异性荧光分子探针结合同型半胱氨酸后形成的化合物采用特异性结合硫醇基而发射荧光的分子探针来直接测定反应中产生的同型半胱氨酸含量，然后计算出相应的s-腺苷-l-同型半胱氨酸含量，以此测定2’-o-甲基转移酶活性。该方案的缺点是需设计带标记的特异性荧光分子探针，成本较高。
5、一种检测sam甲基转移酶的方法是通过s-腺苷-同型半胱氨酸水解酶和腺苷脱氨酶的酶偶联反应，获得sam甲基转移酶的检测结果。该方法解除了产物的反馈抑制，但步骤繁琐，涉及多次连锁反应。
6、现有技术中的另一种方法是测定不同体系中sah的形成情况，与标准曲线对比，得到sah的定量结果。但无法对甲基转移酶活性进行精准定量。
7、因此，本领域迫切需要开发一种通用型、重现性好且能够准确定量的检测rna甲基转移酶活性的方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种通用型、重现性好且能够准确定量的检测rna甲基转移酶活性的方法。
2、在本发明的第一方面，提供了一种检测rna甲基转移酶活性的方法，包括以下步骤：
3、（s1）提供长度为15-50nt（较佳地18-40nt，更佳地20-30nt）的单链rna分子作为反应底物；
4、（s2）对（s1）中的rna分子分别进行以下测试反应，所述测试反应包括在阴性测试体系、第一测试体系、第二测试体系反应，反应时间为t，其中：
5、阴性测试体系中，不包含酶；
6、第一测试体系中，包含rna甲基转移酶的标准品酶；
7、第二测试体系中，包含待检测的rna甲基转移酶；
8、（s3）检测所述阴性测试体系、第一测试体系、第二测试体系中的sah的生成量，分别记为a0、a1、a2；
9、（s4）基于针对所述sah生成量a0、a1、a2的分析，获得待检测的rna甲基转移酶活性的检测结果。
10、在另一优选例中，所述的检测结果为定量结果。
11、在另一优选例中，所述阴性测试体系与第一测试体系中的其他反应条件完全相同，区别仅在于所述第一测试体系中包含rna甲基转移酶的标准品酶；
12、所述第一测试体系与第二测试体系中的其他反应条件完全相同，区别仅在于所述第二测试体系中包含待检测的rna甲基转移酶。
13、在另一优选例中，所述步骤s1包括：
14、（s1a）通过化学合成纯度为200-1500ng/μl dna；所述dna长度为15-50nt，较佳地18-40nt，更佳地20-30nt；
15、（s1b）所述dna转录获得ssrna，所述ssrna长度为15-50nt，较佳地18-40nt，更佳地20-30nt，更佳地为22nt；
16、（s1c）所述ssrna通过cap0加帽反应，获得cap0 ssrna，作为反应底物。
17、在另一优选例中，所述反应底物是长度为20-30nt的单链rna分子。
18、在另一优选例中，所述单链rna分子的核苷酸序列如seq id no.3所示。
19、在另一优选例中，提供用于测试反应的第一缓冲体系；
20、从中取出一份作为所述阴性测试体系；向余下部分的第一缓冲体系至少一分为二，记作a，b缓冲体系，其中：
21、向a缓冲体系中加入rna甲基转移酶的标准品酶，作为第一测试体系；
22、向b缓冲体系中加入待检测rna甲基转移酶，作为第二测试体系。
23、在另一优选例中，在步骤（s4）中所述的分析是和标准曲线进行比对，从而获得待检测的rna甲基转移酶活性。
24、在另一优选例中，在步骤（s4）中所述的分析是将rna甲基转移酶的标准品酶的已知浓度进行换算从而得到待检测的rna甲基转移酶活性。
25、在另一优选例中，所述第一测试体系中含有预定酶量的rna甲基转移酶的标准品酶。
26、在另一优选例中，所述阴性测试体系中sah生成量为a0；第一测试体系中，当rna甲基转移酶的标准品酶的酶量为c1、c2、c3、c4、c5时，sah生成量为a1、a2、a3、a4、a5；第三测试体系中sah生成量为a6；其中，
27、a0表示质控值，即阴性测试体系中sah生成量；
28、a1、a2、a3、a4、a5分别表示酶量为c1、c2、c3、c4、c5时rna甲基转移酶的标准品酶的sah生成量；
29、a6表示待检测rna甲基转移酶的sah生成量；
30、如果a0=0，则认为测试体系正常；a0＞0，则认为测试失败；
31、如果以标准品酶的酶量为横坐标，sah生成量为纵坐标绘制标准曲线，同时将纵坐标截距校准为0，得到标准曲线y=ax，r2≥0.99，则认为标准曲线绘制成功；
32、如果a6＞0，则认为待检测的rna甲基转移酶有酶活性，活性=a6/a；
33、如果a6=0，则认为待检测的rna甲基转移酶无活性。
34、在另一优选例中，所述单链rna分子的序列如seq id no.3所示。
35、在另一优选例中，所述单链rna分子无干扰性的匹配结构，如茎环等。
36、在另一优选例中，所述rna甲基转移酶为mrna 2'-o-甲基转移酶。
37、在另一优选例中，在阴性测试体系、第一测试体系、第二测试体系中，所述rna的终浓度各自独立地为150μg/500μl-350μg/500μl，较佳地为250μg/500μl。
38、在另一优选例中，在阴性测试体系、第一测试体系、第二测试体系或第三测试体系中，各自独立地包含sam、10×加帽反应缓冲液和rnase抑制剂。
39、在另一优选例中，所述10×加帽反应缓冲液的终浓度为1×加帽反应缓冲液。
40、在另一优选例中，所述sam的终浓度为0.5 mm-1.0 mm，较佳地为0.7 mm。
41、在另一优选例中，所述rnase抑制剂的终浓度为0.5 u/μl-2 u/μl，较佳地为0.8u/μl。
42、在另一优选例中，第一测试体系中，所述rna甲基转移酶标准品酶的终浓度为0.1u/μl-0.5 u/μl。
43、在另一优选例中，第二测试体系中，所述待检测的rna甲基转移酶的终浓度为0.05mg/ml-0.2 mg/ml，较佳地为0.15 mg/ml。
44、在另一优选例中，所述反应时间t为0.8-1.4h；较佳地，反应时间t为1h。
45、在另一优选例中，所述测试反应在35-38℃下进行；较佳地，在37℃下进行。
46、在另一优选例中，第一测试体系中，反应条件为：37℃下，反应时间t为0.8-1.4h；较佳地，37℃下，反应时间t为1h。
47、在另一优选例中，第二测试体系中，反应条件为：37℃下，反应时间t为0.8-1.4h；较佳地，37℃下，反应时间t为1h。
48、在另一优选例中，（s1）中，所述长度为10-50nt的单链rna分子为cap0 mrna。
49、在另一优选例中，（s1）中，所述长度为10-50nt的单链rna分子为dna体外转录获得的mrna。
50、在另一优选例中，（s1）中，还包括：
51、（s1.1）提供一目的基因的dna；
52、（s1.2）体外转录（s1）中的dna，获得由所述dna转录的mrna；
53、（s1.3）dna转录的mrna，获得加帽的cap0 mrna。
54、在另一优选例中，（s1.2）中，还包括：将转录纯化后的mrna置于pcr仪中65℃5min，反应结束立刻置于冰上5min。
55、在另一优选例中，（s1.2）中，使用t7 rna聚合酶转录dna，获得由所述dna转录的mrna。
56、在另一优选例中，所述mrna序列如seq id no.3所示。
57、在另一优选例中，（s1.3）中，使用牛痘病毒加帽酶加帽转录mrna，获得由所述cap0mrna。
58、在另一优选例中，（s3）中，所述检测为hplc检测。
59、在另一优选例中，（s3）中，包括：
60、（s3.1）设置适合sah分离的色谱条件；
61、（s3.2）绘制rna甲基转移酶的标准曲线：将第二测试体系中的rna甲基转移酶标准品酶梯度稀释为不同酶量的rna甲基转移酶标准品酶溶液，在（s3.1）的色谱条件下，根据液相色谱中sah峰面积，以rna甲基转移酶标准品酶的酶量为横坐标，sah峰面积为纵坐标，同时将纵坐标截距校准为0，绘制标准曲线y=ax；
62、（s3.3）计算sah的含量：在（s3.1）所述的色谱条件下，分别检测第一测试体系、第二测试体系和阴性对照组，获取相应的sah峰面积，分别代入（s3.2）中的标准曲线进行计算，得到第一测试体系、第二测试体系和阴性对照组中相应的rna甲基转移酶的酶量。
63、在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗的方法。
64、在另一优选例中，所述方法为体外方法。
65、在另一优选例中，所述“适合sah分离的色谱条件”是指，sah的出峰位置t1，与测试体系中sam的出峰位置t0相比，(t1-t0)≥5min；较佳地≥10min；更佳地≥15min。
66、在本发明的第二方面，提供了一种检测rna甲基转移酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括：
67、（a）第一容器，以及位于第一容器中的阴性测试体系；
68、（b）第二容器，以及位于第二容器中的第一测试体系；
69、（c）第三容器，以及位于第三容器中的第二测试体系；
70、（d）第四容器，以及位于第四容器中的反应底物；所述反应底物是长度为15-50nt的单链rna分子；其中，
71、阴性测试体系中，不包含酶；第一测试体系中，包含rna甲基转移酶标准品酶；第二测试体系中，包含待检测的rna甲基转移酶。
72、在另一优选例中，在阴性测试体系、第一测试体系、第二测试体系中，各自独立地包含sam、10×加帽反应缓冲液和rnase抑制剂。
73、在另一优选例中，所述试剂盒还包括使用说明书。
74、在另一优选例中，所述rna甲基转移酶标准品酶用于绘制rna甲基转移酶的标准曲线。
75、在本发明的第三方面，提供了一种rna甲基转移酶活性的检测装置，所述装置包括：
76、（d1）反应模块，所述的反应模块包括阴性对照室、第一反应室、第二反应室，其中，
77、阴性对照室包含阴性测试体系及反应底物；
78、第一反应室包含第一反应模块，所述第一反应模块包含第一测试体系及反应底物；
79、第二反应室包含第二反应模块，所述第二反应模块包含第二测试体系及反应底物；
80、其中，阴性测试体系中，不包含酶；第一测试体系中，包含rna甲基转移酶的标准品酶；第二测试体系中，包含待检测的rna甲基转移酶；所述反应底物是长度为15-50nt的单链rna分子；
81、（d2）数据采集模块，所述数据采集模块被配置为对反应模块中各个反应室中的sah峰面积进行数据采集；
82、（d3）分析模块，所述分析模块被配置为对来自所述数据采集模块的sah峰面积通过rna甲基转移酶的“峰面积-酶量”标准曲线进行分析，获得待筛选的rna甲基转移酶活性分析结果；
83、（d4）输出模块，所述输出模块输出筛选分析模块的分析结果。
84、在另一优选例中，第一测试体系中，所述rna甲基转移酶的标准品酶的终浓度为0.1 u/μl-0.5 u/μl。
85、在另一优选例中，第二测试体系中，所述rna甲基转移酶的终浓度为0.05mg/ml-0.2 mg/ml，较佳地为0.15 mg/ml。
86、在另一优选例中，第一测试体系中，反应条件为：37℃下，反应0.8-1.4h；较佳地，37℃下，反应1h。
87、在另一优选例中，第二测试体系中，反应条件为：37℃下，反应0.8-1.4h；较佳地，37℃下，反应1h。
88、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
1.一种检测rna甲基转移酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴性测试体系与第一测试体系中的其他反应条件完全相同，区别仅在于所述第一测试体系中包含rna甲基转移酶的标准品酶；
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（s1）包括：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应底物是长度为20-30nt的单链rna分子。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链rna分子的核苷酸序列如seq idno.3所示。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（s4）中所述的分析是将rna甲基转移酶的标准品酶的已知浓度进行换算从而得到待检测的rna甲基转移酶活性。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴性测试体系中sah生成量为a0；第一测试体系中，当rna甲基转移酶的标准品酶的酶量为c1、c2、c3、c4、c5时，sah生成量分别为a1、a2、a3、a4、a5；第三测试体系中sah生成量为a6；其中，
8.一种检测rna甲基转移酶活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
9.如权利要求8所述的检测rna甲基转移酶活性的试剂盒，其特征在于，所述rna甲基转移酶标准品酶用于绘制rna甲基转移酶的标准曲线。
10.一种rna甲基转移酶活性的检测装置，其特征在于，所述装置包括：
11. 如权利要求10所述的rna甲基转移酶活性的检测装置，其特征在于，第一测试体系中，所述rna甲基转移酶的标准品酶的终浓度为0.1 u/μl-0.5 u/μl。
