本发明涉及一种基因重组，具体涉及一种pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒及其制备方法和用途。
背景技术：
1、pedv（porcine epidemic diarrhea virus,pedv）可以感染所有年龄阶段的猪群，易感猪群感染后年龄越小发病越严重，死亡率越高，10日龄以内哺乳仔猪感染后死亡率可高达100%。临床流行病学研究发现在我国流行的pedv是仔猪腹泻的主要病原，50%以上的腹泻病例中均检测到pedv的感染。分子流行病学研究发现，我国目前存在多个流行性腹泻病毒毒株，根据pedv s基因序列特征可以将pedv流行毒株分为g1、g2基因型，g1、g2基因型可进一步细分为g1a、g1b、g1c、g2a、g2b、g2c等基因亚型，另一类根据pedv全基因组序列和s基因缺失插入突变,将pedv毒株分为s-indel毒株和non s-indel毒株。目前g2流行毒株占比超过70%，使用不同基因型毒株制备高免血清进行交叉中和抗体测定，测定结果显示不同血清型之间虽然具有中和效果，但差异较大，因此通过单一毒株制备的疫苗较难诱导广谱的免疫力。
2、pedv主要通过粪口途径感染，哺乳仔猪感染后发病率和死亡率最高，年龄越小，发病率和死亡率越高，但这一阶段的仔猪难于建立主动免疫，因此针对哺乳仔猪pedv的防控主要依赖于母猪的母源抗体，其中母乳中iga抗体的高低与保护效果成正相关。
3、但当前市场上的灭活疫苗和弱毒疫苗免疫后均不能诱导免疫猪群产生黏膜免疫抗体。因此，开发一种能够诱导产生iga抗体的新型疫苗对pedv的防控具有重要临床价值。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种pedv s嵌合蛋白的重组腺病毒及其制备方法和用途，其主要是一种能够诱导免疫动物产生广谱黏膜免疫抗体的pedv疫苗，为临床上pedv感染的防控提供科学的手段。
2、为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
3、一种pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒制备方法，具体包括如下步骤：
4、步骤1：pedvs嵌合蛋白的设计及转移载体的构建；
5、步骤2：重组腺病毒的构建；
6、步骤3：重组病毒的制备和纯化；
7、其中，步骤1中，具体步骤如下：
8、根据pedv流行病学数据，人工设计能够表达pedvs蛋白的序列并进行密码子优化，核苷酸如seq id no.1所示，融合蛋白序列如seq id no.2所示。
9、在一些具体的实施例案例中，步骤1中，
10、融合蛋白1-22位为分泌信号肽：mdamkrglccvlllcgavfvsn；
11、23-761位氨基酸序列来源于pedv g2毒株；
12、762-1326位氨基酸序列来源于pedv g1型毒株
13、1327-1329位gsg连接肽；
14、1330-1354位多肽来源于tequatrovirus t4的fibritin_c多肽，使包含该序列的蛋白形成稳定的三聚体，1355-1357位gsg连接肽，1358-1365位为flag标签蛋白，1366-1372位促进蛋白表达的多肽；
15、将上述序列按照猪的密码子特征进行优化，获得表达该融合蛋白的核苷酸序列，在序列末端添加终止密码子后合成，并克隆至pdc316载体的ecorⅰ和hindⅲ酶切位点之间，测序正确的质粒命名为pdc316-sq。
16、在一些具体的实施例案例中，步骤2具体步骤如下：
17、常规方法传代hek 293a细胞至孔板，传代后第二天使用转染试剂转染按照操作说明共转染pdc316-sq和pbhgloxdele13cre质粒各1ug，转染后将细胞置37℃，5%二氧化碳培养箱中培养；每日观察细胞状态，出现细胞病变后将细胞置-80℃反复冻融三次，-80℃保存，计为adv-pedv sq p1代病毒；
18、常规方法传代hek 293a细胞至10cm培养皿，待细胞汇合度达到90%以上时接种adv-pedv sq p1代病毒，使用2%胎牛血清的dmem作为维持液在37℃，5%二氧化碳培养箱中培养至85%以上细胞出现细胞病变时收获病毒，记为adv-pedv sq p2代病毒。
19、在一些具体的实施例案例中，步骤3具体步骤如下：
20、使用无血清培养基按照常规方法传代hek 293f细胞至100ml摇瓶，细胞密度达到5×106/ml时接种adv-pedv sq p2代病毒，接种后置37℃，5%二氧化碳培养箱轨道式摇床上120rpm培养，每日观察细胞状态，并记录细胞活率，当细胞活率低于30%时将培养瓶置-80℃冰箱反复冻融三次，12000rpm离心10分钟，取上清加入到100kd超滤离心管中，4000rpm离心至原来体积的1/10后加入0.1m 磷酸盐缓冲液至原体积，4000rpm离心至原体积的1/100，最后按照5：1的比例添加甘油后分装并置于-80℃保存，记为adv-pedv sq p3代病毒。
21、另外，本发明还公开了一种pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒，由权上述所述的pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒制备方法制得。
22、另外，本发明还公开了一种pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒用途，具体为用于制备疫苗。
23、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24、本发明开发的疫苗能够通过口服、肌肉注射等方式免疫，而现有灭活疫苗和活疫苗均不能通过口服的方式免疫；此外本发明将不同基因型的毒株s蛋白进行嵌合，选择了主要的g2型流行毒株s1蛋白和经典的g1型毒株的s2蛋白，因此使用一个蛋白可以诱导针对g2型毒株的s1蛋白抗体，也能诱导针对g1型毒株的s2蛋白的抗体，可以诱导免疫动物更广谱的免疫抗体，通过重组腺病毒系统能够产生广谱的siga抗体，免疫保护效果更好。
1.一种pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒制备方法，其特征在于，步骤1中，
3.根据权利要求2所述的一种pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒制备方法，其特征在于，步骤2具体步骤如下：
4.根据权利要求3所述的一种pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒制备方法，其特征在于，步骤3具体步骤如下：
5.一种pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒，其特征在于：由权利要求1-4中任意一项所述的pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒制备方法制得。
6.一种pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒用途，其特征在于：权利要求5中制备的pedvs嵌合蛋白的重组腺病毒用于制备疫苗。
