本发明涉及海参深加工，具体是一种高钙高蛋白海参肽及其制备方法。
背景技术：
1、海参是棘皮动物门海参纲动物的统称。海参肽是海参的提取物，海参肽主要有补肾益精，养血润燥，止血等功效，常用于人体补肾补血以及提高机体免疫力。海参属于高蛋白、低脂肪、低糖食物，所含蛋白质非常优质又易被人体消化吸收，是补充蛋白质及人体必需氨基酸的优秀食材，除含有大量的优质蛋白外，海参还富含ε-3多不饱和脂肪酸、多种人体必需的脂溶性维生素、b族维生素、铁、钙、镁、锌、硒等营养元素，具有很高的营养价值。目前从海参中提取海参肽的方法主要有酶解法、酸解法和碱解法这3种，酶解法主要是利用蛋白酶对海参蛋白进行水解得到海参肽，反应条件温和，对海参的营养成分破坏较小，能有针对性地水解特定的肽键，得到特定结构和功能的肽段且产物纯度相对较高，副反应少。但使用酶解法提取海参中的海参肽也存在对海参中微量元素钙提取率较低和酶解产物分离纯化难度较大等问题，因此考虑增强对海参中微量元素钙和蛋白质的提取率、保持蛋白质的功能性，辅助酶解产物分离纯化，进而得到一种高钙高蛋白海参肽提取物，同时也使得该海参肽提取物更有利于被人体吸收。
技术实现思路
1、（1）要解决的技术问题
2、本发明的目的在于提供一种高钙高蛋白海参肽及其制备方法，用以增强对海参中微量元素钙和蛋白质的提取率、保持蛋白质的功能性，辅助酶解产物分离纯化，进而得到一种高钙高蛋白海参肽提取物，同时也使得该海参肽提取物更有利于被人体吸收。
3、（2）技术方案
4、为实现上述目的，本发明提供了一种高钙高蛋白海参肽的制备方法，包括以下步骤：
5、s11. 预处理：取新鲜海参，将内脏与杂物去除后洗净得到海参壁，将海参壁研磨破碎后放入纯化水中并进行超声，海参壁与纯化水的质量比为1：（1.5~3），超声频率40~50khz，超声温度5~20℃，超声2~3h后得到海参壁匀浆液；
6、s12. 酶解：搅拌状态下在海参壁匀浆液中加入复合酶溶液，海参壁浆液与复合酶溶液的质量比为（1~1.5）：（2~3），同时用tris-hcl缓冲液控制ph在7.5~8.5，反应温度35~50℃，反应时间8~12h，得到第一混合溶液；
7、s13. 助剂辅助提取：在搅拌状态下依次往第一混合溶液中加入柠檬酸水溶液和改性壳聚糖，搅拌温度35~50℃，反应时间4~5h，得到第二混合溶液；
8、s14. 升温灭酶：在搅拌状态下，将第二混合溶液在温度为80~100℃的条件下处理15~25min，冷却至室温后得到第三混合溶液；
9、s15. 分离纯化：将第三混合溶液进行离心分离，离心转速6000~8000rpm/min，离心5~10min后分离得到上清液和滤渣，在上清液中加入活性炭进行脱色脱腥处理后通过截留相对分子质量为6000~10000的中空纤维素膜，在0.15~0.25mpa的压力下进行超滤，得到海参肽液；
10、s16. 浓缩干燥：将海参肽液进行冷冻干燥，冷冻温度-10~0℃，冷冻时间20~25h，得到片状海参肽，将片状海参肽在低温状态下粉碎即得海参肽粉。
11、进一步地，所述改性壳聚糖的比表面积在60~80 m2/g且其表面具有羧基基团。
12、进一步地，所述改性壳聚糖的制备方法包括：
13、s21. 将壳聚糖与十二烷基硫酸钠（c12h25so4na）分别溶于质量分数为1~2.5%的冰乙酸（ch3cooh），得到壳聚糖溶液和十二烷基硫酸钠溶液；
14、s22. 在搅拌状态下将壳聚糖溶液缓慢滴加到十二烷基硫酸钠溶液中，搅拌4~5h，并采用质量分数为1~1.5%的氢氧化钠溶液调节溶液ph至中性，过滤、清洗、干燥后得到中间产物；
15、s23. 在搅拌状态下往纯化水中依次加入柠檬酸（c6h8o7）和磷酸二氢钠（nah2po4），搅拌温度55~70℃，搅拌时间2~4h，得到柠檬酸混合液；
16、s24. 在搅拌状态下向柠檬酸混合液中加入中间产物，反应温度55~70℃，反应时间2~4h，过滤、清洗、干燥得到粗产物；
17、s25. 将所述粗产物放在10~15%氨基丁三醇/甲醇溶液中洗脱除去十二烷基硫酸钠，洗涤干燥至恒重，粉碎后得到改性壳聚糖。
18、进一步地，所述壳聚糖与十二烷基硫酸钠（c12h25so4na）的质量比为（1~1.5）：（1.5~2）。
19、进一步地，柠檬酸（c6h8o7）、磷酸二氢钠（nah2po4）和中间产物的质量比为（1~2）：（1.5~2）：（1.5~2.5）。
20、进一步地，所述复合酶溶液是胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的复配，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按重量份比为(1.5~3)：(1.5~3)：(1~2)。
21、进一步地，所述tris-hcl缓冲液的配制方法为在搅拌状态下将12~15g 三羟甲基氨基甲烷（tris）加入600~800ml纯化水中，搅拌时间1~2h直至充分溶解，再使用浓盐酸调节溶液的ph值至7~9。
22、进一步地，所述助剂辅助提取中海参壁、柠檬酸和改性壳聚糖按重量份比为(1~1.2)：(1.5~3)：(2~3)。
23、进一步地，所述海参肽由所述的一种高钙高蛋白海参肽的制备方法制备得到。
24、上述蛋白酶和助剂的作用机制如下：
25、胰蛋白酶是胰脏分泌的一种蛋白质水解酶，它是一种内切酶。胰蛋白酶通过识别蛋白质分子中的特定氨基酸序列，将大分子蛋白质中的碱性氨基酸残基（如赖氨酸和精氨酸）的羧基端，特异性地将蛋白质分解成小分子的肽片段和氨基酸。胰蛋白酶在ph值为7~8和作用温度在37℃时活性最高，在高温、强酸或强碱条件下会失活。
26、木瓜蛋白酶是从木瓜中提取的一种蛋白酶，它是一种外切酶，它从蛋白质分子的n端开始，特异性逐步水解掉氨基酸残基，从而释放出小分子的肽和氨基酸木瓜蛋白酶在ph值为7~8时活性最高，在高温、强酸或强碱环境下活性会降低。
27、风味蛋白酶是在食品加工行业中用于增加食品风味的酶制剂，它通过水解将大分子蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，这些小分子不仅能够作为营养成分被人体吸收，还能与食品中的其他成分（如糖、脂质、矿物质等）发生反应，生成复杂的风味化合物，如挥发性有机化合物（vocs）和风味前体物质，从而丰富食品的风味。
28、柠檬酸（c6h8o7）是一种重要的有机弱酸，它能够通过降低溶液的ph值来增加蛋白质的溶解性，在生物化学中，柠檬酸是三羧酸循环的中间体，三羧酸循环发生在所有需氧生物的新陈代谢中，柠檬酸被广泛用作络合剂，它具有一定的络合能力，可与金属离子发生络合作用，促进钙、镁等微量元素释放的同时也增加了人体对柠檬酸钙、柠檬酸镁络合物的吸收，这是因为相较于单纯的钙离子，柠檬酸钙、柠檬酸镁络合物的结构能够保护钙、镁离子在复杂的胃肠道环境中不被沉淀或形成不溶性复合物，从而更容易被肠道细胞吸收。
29、壳聚糖是一种从甲壳类动物外壳中提取的天然多糖，具有阳离子特性，可以与带负电荷的肽结合，壳聚糖在水中形成微小的颗粒，可以包裹海参肽等活性物质，形成稳定的微胶囊结构，这种结构有助于肽的缓释和靶向递送。通过改性壳聚糖从而在壳聚糖表面引入了羧基基团，羧基（-cooh）的引入增加了壳聚糖的亲水性，有助于壳聚糖与海参肽中的正电荷氨基酸残基形成更强的相互作用，同时壳聚糖也具有良好的生物相容性、细胞亲和性和生物降解性，进而有助于提高人体对海参肽的吸收。
30、在酶解法提取海参中海参肽的过程中，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶首先通过特异性地识别断裂肽键，将大分子蛋白质分解成较小的肽片段和氨基酸，随着酶解过程的进行，柠檬酸的加入使得钙离子与柠檬酸发生络合作用，形成的金属-柠檬酸络合物具有较高的溶解性，这有助于金属离子钙从海参组织中被提取出来，生成的柠檬酸钙络合物更容易被肠道细胞吸收。同时通过物理吸附和化学作用，改性壳聚糖的分子链缠绕和包裹海参肽形成一个微胶囊保护层，保护海参肽不被外界环境中的酶或其他分解物质破坏，这也有助于酶解过程结束后酶解产物的分离与纯化。在人体食用过程中，微胶囊结构的存在可以控制海参肽活性物质的释放速度，避免一次性释放过多，导致吸收效率降低或产生副作用，且改性壳聚糖本身具有良好的亲水性，这也有助于微胶囊结构在消化道中的溶解，从而促进内部活性物质的释放和吸收。此外，柠檬酸与改性壳聚糖之间还存在协同效应，柠檬酸提供的酸性环境促进了蛋白质的溶解，改性壳聚糖吸附提取液中的氨基酸和金属-柠檬酸络合物，有助于酶解产物的分离与纯化，同时柠檬酸的酸性基团与壳聚糖的碱性基团相互作用形成稳定的复合物有助于保持海参肽的三维结构，从而有效地保护和稳定了活性成分。
31、（3）有益效果
32、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
33、1. 酶解过程中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶等蛋白酶通过特异性地识别断裂肽键，将大分子蛋白质分解成较小的肽片段和氨基酸；
34、2. 柠檬酸与金属离子钙发生络合作用形成的金属-柠檬酸络合物，具有较高的溶解性，有助于提高金属离子钙的提取率，同时生成的柠檬酸钙络合物也更容易被肠道细胞吸收；
35、3. 改性壳聚糖通过物理吸附和化学作用将海参肽缠绕和包裹起来形成一个微胶囊保护层，保护海参肽不被外界环境中的酶或其他分解物质破坏，控制海参肽活性物质的释放速度，促进人体吸收，也有助于酶解产物的分离与纯化；
36、4. 柠檬酸提供的酸性环境促进了蛋白质的溶解，改性壳聚糖吸附提取液中的氨基酸和金属-柠檬酸络合物，同时柠檬酸的酸性基团与壳聚糖的碱性基团相互作用形成稳定的复合物有助于保持海参肽的三维结构，这种协同效应有效地保护和稳定了这些活性成分。
1.一种高钙高蛋白海参肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高钙高蛋白海参肽的制备方法，其特征在于，所述改性壳聚糖的比表面积在60~80 m2/g且其表面具有羧基基团。
3.根据权利要求2所述的一种高钙高蛋白海参肽的制备方法，其特征在于，所述改性壳聚糖的制备方法包括：
4.根据权利要求3所述的所述的一种高钙高蛋白海参肽的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖与十二烷基硫酸钠（c12h25so4na）的质量比为（1~1.5）：（1.5~2）。
5.根据权利要求3所述的所述的一种高钙高蛋白海参肽的制备方法，其特征在于，柠檬酸（c6h8o7）、磷酸二氢钾（nah2po4）和中间产物的质量比为（1~2）：（1.5~2）：（1.5~2.5）。
6.根据权利要求1所述的一种高钙高蛋白海参肽的制备方法，其特征在于，所述复合酶溶液是胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的复配，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按重量份比为(1.5~3)：(1.5~3)：(1~2)。
7. 根据权利要求1所述的一种高钙高蛋白海参肽的制备方法，其特征在于，所述tris-hcl缓冲液的配制方法为在搅拌状态下将12~15g 三羟甲基氨基甲烷（tris）加入600~800ml纯化水中，搅拌时间1~2h直至充分溶解，再使用浓盐酸调节溶液的ph值至7~9。
8.根据权利要求1所述的一种高钙高蛋白海参肽的制备方法，其特征在于，所述助剂辅助提取中海参壁、柠檬酸和改性壳聚糖按重量份比为(1~1.2)：(1.5~3)：(2~3)。
9.一种高钙高蛋白海参肽，其特征在于，所述海参肽由权利要求1~8任一所述的一种高钙高蛋白海参肽的制备方法制备得到。
