5'UTR元件、表达载体及其应用的制作方法

本发明涉及体外转录领域，尤其涉及5′utr元件、表达载体及其应用。

背景技术：

1、5′utr是指成熟mrna位于编码区上游、5′端帽下游不被翻译为蛋白质的区域。5′utr从转录起始位点开始，在起始密码子的前一个核苷酸处结束，可以包含通过调控元件控制基因表达的元件。5′utr通过与rna结合蛋白相互作用调控mrna稳定性、核糖体识别、mrna二级结构，很大程度上决定了蛋白质表达效率和翻译效率。

2、真核细胞中m7g是mrna中广泛存在的5′帽结构，它通过一个三磷酸键连接mrna 5′端第一个核苷酸，称为帽0(m7gpppn，又称cap 0)，cap 0结构对mrna的翻译至关重要。mrna的起始核苷酸2′o位置额外的甲基化修饰为帽1(m7gpppnm，又称cap 1)修饰，cap 1修饰能够降低mrna体内应用引起的免疫反应。mrna 5′帽能调节前体mrna的剪切、保护mrna不被核酸酶降解并决定蛋白质翻译的启动。因此体外合成的mrna中，cap 1的比例越高越好。

3、体外合成mrna是一种利用酶、模板、ntps和反应buffer等成分，模拟mrna在生物体内的合成过程。一般流程为：制备并纯化模板、体外转录mrna、加帽反应、去除模板dna、纯化mrna。其中加帽反应受到5′utr热力学自由能的影响非常大。经简单探究，5′utr热力学自由能越低，加帽反应越难以进行。以此推测热力学自由能较高的5′utr有着较高的加帽率。在其它条件相同的条件下，加帽效率越高的mrna表达效率也越高。因此，体外转录的mrna，其5′utr既直接影响着mrna的表达效率，又通过影响加帽效率间接影响着mrna的稳定性和表达效率。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了5′utr元件、表达载体及其应用。本发明通过提供5′utr序列，解决体外合成mrna(信使核糖核酸)时，mrna表达载体5′utr(5′非翻译区)序列无法同时具有既能使mrna表达效率高，又能使其加帽效率高的功能的问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了5′utr元件，所述5′utr元件具有：

4、(1)、如seq id no:1至seq id no:12任意所示的核苷酸序列；或

5、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

6、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

7、在本发明的一些实施方案中，seq id no:1的序列为：actcttctgctcgccacagtctggagacgaacgcacc。(a1)

8、在本发明的一些实施方案中，seq id no:2的序列为：attggattgtgacgaagagattgagagagaactgacc。(a2)

9、在本发明的一些实施方案中，seq id no:3的序列为：ataggattgtgacgaagagattgagagagaactgacc。(a3)

10、在本发明的一些实施方案中，seq id no:4的序列为：aatattaaggtaaaaagagagtgagagagaacgcacc。(a5)

11、在本发明的一些实施方案中，seq id no:5的序列为：aatattaagg taaaaagagagaggtgaattagagagtagccacc。(a7)

12、在本发明的一些实施方案中，seq id no:6的序列为：aatattattgtaaaaagagagtgagagagaagggacc。(a9)

13、在本发明的一些实施方案中，seq id no:7的序列为：aatattagggtaaaaagagagtgagagagaagggacc。(a10)

14、在本发明的一些实施方案中，seq id no:8的序列为：aatattagagtaaaaagagagtgagagagaagggacc。(a11)

15、在本发明的一些实施方案中，seq id no:9的序列为：acatttgcttc tgacacaactgtgttcacttcacgcatcaaacagacacc。(b1)

16、在本发明的一些实施方案中，seq id no:10的序列为：acatttgctt ctgacacaactgtgttcacttcacgcatcaaacggacacc。(b2)

17、在本发明的一些实施方案中，seq id no:11的序列为：acatttgctt ctgacacaactacatcaacttcactaatcatacggccacc。(b8)

18、在本发明的一些实施方案中，seq id no:12的序列为：acatctgctt ctgacacaactacatcaacttcactaatcatacggccacc。(b9)

19、在本发明的一些实施方案中，上述5′utr元件中，所述核苷酸的5′端还包括：ggg碱基和/或ag碱基。

20、在本发明的一些实施方案中，上述5′utr元件中，所述5′utr元件具有：

21、(4)、如seq id no:13至seq id no:36任意所示的核苷酸序列；或

22、(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

23、(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

24、在本发明的一些实施方案中，seq id no:13的序列为：gggactcttctgctcgccacagtctggagacgaacgcacc。(ggg+a1)

25、在本发明的一些实施方案中，seq id no:14的序列为：agactcttctgctcgccacagtctggagacgaacgcacc。(ag+a1)

26、在本发明的一些实施方案中，seq id no:15的序列为：gggattggattgtgacgaagagattgagagagaactgacc。(ggg+a2)

27、在本发明的一些实施方案中，seq id no:16的序列为：agattggattgtgacgaagagattgagagagaactgacc。(ag+a2)

28、在本发明的一些实施方案中，seq id no:17的序列为：gggataggattgtgacgaagagattgagagagaactgacc(ggg+a3)

29、在本发明的一些实施方案中，seq id no:18的序列为：agataggattgtgacgaagagattgagagagaactgacc(ag+a3)

30、在本发明的一些实施方案中，seq id no:19的序列为：gggaatattaaggtaaaaagagagtgagagagaacgcacc。(ggg+a5)

31、在本发明的一些实施方案中，seq id no:20的序列为：agaatattaaggtaaaaagagagtgagagagaacgcacc。(ag+a5)

32、在本发明的一些实施方案中，seq id no:21的序列为：gggaatatt aaggtaaaaagagagaggtgaattagagagtagccacc。(ggg+a7)

33、在本发明的一些实施方案中，seq id no:22的序列为：agaatatta aggtaaaaagagagaggtgaattagagagtagccacc。(ag+a7)

34、在本发明的一些实施方案中，seq id no:23的序列为：gggaatattattgtaaaaagagagtgagagagaagggacc。(ggg+a9)

35、在本发明的一些实施方案中，seq id no:24的序列为：agaatattattgtaaaaagagagtgagagagaagggacc。(ag+a9)

36、在本发明的一些实施方案中，seq id no:25的序列为：gggaatattagggtaaaaagagagtgagagagaagggacc。(ggg+a10)

37、在本发明的一些实施方案中，seq id no:26的序列为：agaatattagggtaaaaagagagtgagagagaagggacc。(ag+a10)

38、在本发明的一些实施方案中，seq id no:27的序列为：gggaatattagagtaaaaagagagtgagagagaagggacc。(ggg+a11)

39、在本发明的一些实施方案中，seq id no:28的序列为：agaatattagagtaaaaagagagtgagagagaagggacc。(ag+a11)

40、在本发明的一些实施方案中，seq id no:29的序列为：gggacattt gcttctgacacaactgtgttcacttcacgcatcaaacagacacc。(gg g+b1)

41、在本发明的一些实施方案中，seq id no:30的序列为：agacatttgc ttctgacacaactgtgttcacttcacgcatcaaacagacacc。(ag+b1)

42、在本发明的一些实施方案中，seq id no:31的序列为：gggacattt gcttctgacacaactgtgttcacttcacgcatcaaacggacacc。(gg g+b2)

43、在本发明的一些实施方案中，seq id no:32的序列为：agacatttgc ttctgacacaactgtgttcacttcacgcatcaaacggacacc。(ag+b2)

44、在本发明的一些实施方案中，seq id no:33的序列为：gggacattt gcttctgacacaactacatcaacttcactaatcatacggccacc。(gg g+b8)

45、在本发明的一些实施方案中，seq id no:34的序列为：agacatttgc ttctgacacaactacatcaacttcactaatcatacggccacc。(ag+b8)

46、在本发明的一些实施方案中，seq id no:35的序列为：gggacatct gcttctgacacaactacatcaacttcactaatcatacggccacc。(gg g+b9)

47、在本发明的一些实施方案中，seq id no:36的序列为：agacatctgc ttctgacacaactacatcaacttcactaatcatacggccacc。(ag+b9)

48、本发明还提供了表达盒，包括：上述5′utr元件。

49、本发明还提供了表达载体，包括：上述5′utr元件和/或上述表达盒以及可接受的基因元件。

50、在本发明的一些实施方案中，上述表达载体中，所述基因元件包括：启动子、kozak序列、荧光素酶基因、3′utr元件和多聚腺苷尾中的一种或多种。

51、在本发明的一些实施方案中，上述表达载体中，所述启动子包括：t7启动子。

52、在本发明的一些实施方案中，上述表达载体中，所述荧光素酶基因包括：高斯荧光素酶基因或萤火虫荧光素酶基因。

53、在本发明的一些实施方案中，上述表达载体中，还包括骨架质粒：pmrvac。

54、本发明还提供了宿主，转化和/或转染上述表达载体。

55、本发明还提供了上述5′utr元件、上述表达盒、上述表达载体和/或上述宿主在体外转录mrna中的应用。

56、本发明还提供了上述5′utr元件、上述表达盒、上述表达载体和/或上述宿主提高体外转录mrna的表达效率和/或加帽效率。

57、本发明还提供了体外转录mrna的方法，取上述表达载体线性化后，体外转录mrna，加帽反应，获得所述mrna。

58、本发明提供了5′utr元件，所述5′utr元件具有：

59、(1)、如seq id no:1至seq id no:12任意所示的核苷酸序列；或

60、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

61、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

62、本发明的有益效果包括：

63、(1)、本发明中的5′utr序列的加帽效率在体外合成的mrna中很高。

64、(2)、本发明中的5′utr序列的加帽效率高达80％以上。

65、(3)、本发明中的5′utr序列的表达效率在体外合成的mrna中高于现有的改造的5′utr序列。

66、(4)、因此本发明中的5′utr序列的表达效率和加帽效率在体外合成的mrna中都是已知5′utr序列中极高的。

技术特征：

1.5'utr元件，其特征在于，所述5'utr元件具有：

2.如权利要求1所述的5'utr元件，其特征在于，所述核苷酸的5'端还包括：ggg碱基和/或ag碱基。

3.如权利要求2所述的5'utr元件，其特征在于，所述5'utr元件具有：

4.表达盒，其特征在于，包括：如权利要求1至3任一项所述的5'utr元件。

5.表达载体，其特征在于，包括：如权利要求1至3任一项所述的5'utr元件和/或如权利要求4所述的表达盒以及可接受的基因元件。

6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述基因元件包括：启动子、kozak序列、荧光素酶基因、3'utr元件和多聚腺苷尾中的一种或多种。

7.宿主，其特征在于，转化和/或转染如权利要求5或6所述的表达载体。

8.如权利要求1至3任一项所述的5'utr元件、如权利要求4所述的表达盒、如权利要求5或6所述的表达载体和/或如权利要求7所述的宿主在体外转录mrna中的应用。

9.如权利要求1至3任一项所述的5'utr元件、如权利要求4所述的表达盒、如权利要求5或6所述的表达载体和/或如权利要求7所述的宿主提高体外转录mrna的表达效率和/或加帽效率。

10.体外转录mrna的方法，其特征在于，取如权利要求5或6所述的表达载体线性化后，体外转录mrna，加帽反应，获得所述mrna。

技术总结
本发明涉及体外转录领域，尤其涉及5'UTR元件、表达载体及其应用。本发明提供了5'UTR元件，所述5'UTR元件具有：如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12任意所示的核苷酸序列；或如所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或与所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。本发明通过提供5'UTR序列，解决体外合成mRNA时，原核生物5'UTR序列无法同时具有既能使mRNA表达效率高，又能使其加帽效率高的功能的问题。

技术研发人员：蒙伟能,廖鹏非,王秋积,刘晨,谢贤
受保护的技术使用者：云舟生物科技（广州）股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23