一种BEAS-2B细胞炎症损伤模型的构建方法

本发明属于细胞模型，具体涉及一种beas-2b细胞炎症损伤模型的构建方法。

背景技术：

1、慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺，chronicobstructivepulmonarydisease，copd)是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。与有害气体及有害颗粒的异常炎症反应有关，致残率和病死率很高。气流受限和气道阻塞是慢性阻塞性肺疾病最重要的病理生理改变。其确切病因尚不清楚，应是内因(个体易患因素)与外因(环境因素)共同作用的结果。目前最常见和最主要的病因是长期吸烟，此外长期吸入职业性粉尘和化学气体，也会增加慢性阻塞性肺疾病的发生风险。

2、吸烟和感染是导致copd发展最重要的暴露因素，且上述两个因素所导致的copd的加重性炎症是引起copd死亡的重要原因，因而，抑制炎症反应是治疗copd的重要策略。然而，由于copd复杂的病因及发病机制，目前，尚不存在从根本上阻止其气流受限渐进性进展的有效治疗药物和方法，进而，建立有效模拟copd患者肺部炎症的模型对于为呼吸系统炎症损伤相关疾病防治药物的筛选具有重要意义。

3、现有技术中虽然也存在一些模拟肺部细胞炎症损伤模型研究，如田思琪进行了三种典型重金属诱导肺支气管上皮细胞(beas-2b)损伤及多酚类化合物毒性抑制作用研究(田思琪.三种典型重金属诱导肺支气管上皮细胞(beas-2b)损伤及多酚类化合物毒性抑制作用研究[j])，但是目前的肺部细胞炎症损伤模型的构建过程中，由于参数或检测手段的非科学和不合理性，使得建立的肺部细胞炎症损伤模型的稳定性和重复性均较差，与人体copd炎症的病理生理状态差异较大，无法真实反映呼吸系统炎症损伤相关疾病的状态。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种beas-2b细胞炎症损伤模型的构建方法，所述构建方法建立的beas-2b细胞炎症损伤模型的稳定性高，重复性好，接近人体呼吸系统炎症的病理生理状态。

2、本发明提供了一种beas-2b细胞炎症损伤模型的构建方法，包括如下步骤：

3、1)香烟烟雾提取物的终浓度筛选：将对数生长期的beas-2b细胞接种于细胞培养板中培养至细胞贴壁后，加入系列干预组合物进行干预培养24h，所述系列干预组合物包括不同终浓度的香烟烟雾提取物和终浓度为1μg/ml的脂多糖，得到多组干预培养后的beas-2b细胞；

4、采用cck8法分别测定所述多组干预培养后的beas-2b细胞的细胞存活率，计算所述多组干预培养后的beas-2b细胞存活率的ic50值；

5、以所述ic50值的1/8、1/4和1/2的香烟烟雾提取物终浓度作为三个水平的香烟烟雾提取物的终浓度；

6、2)脂多糖的终浓度筛选：将对数生长期的beas-2b细胞接种于细胞培养板中培养至细胞贴壁后，加入系列干预组合物进行干预培养24h，所述系列干预组合物包括不同终浓度的脂多糖和终浓度为1％的香烟烟雾提取物，得到多组干预培养后的beas-2b细胞；

7、采用elisa法分别测定所述多组干预培养后的beas-2b细胞的细胞上清液中的il-8含量；

8、以il-8含量与空白对照组具有显著性差异的脂多糖终浓度作为三个水平的脂多糖的终浓度；

9、3)干预培养时间的筛选：将beas-2b细胞接种于细胞培养板中分别按照不同的干预培养时间进行培养，得到多组培养后的beas-2b细胞；

10、采用cck8法分别测定所述多组培养后的beas-2b细胞的od450nm值，以干预培养时间和对应的od450nm值分别为横坐标和纵坐标绘制beas-2b细胞生长曲线；

11、依据所述beas-2b细胞生长曲线选取3个相对生长快速的干预培养时间作为三个水平的干预培养时间；

12、4)以所述香烟烟雾提取物浓度、脂多糖浓度和干预培养时间为三因素，以步骤1)所述三个水平的香烟烟雾提取物的终浓度为所述香烟烟雾提取浓度的三水平，以步骤2)所述三个水平的脂多糖的终浓度为所述脂多糖浓度的三水平，以步骤3)所述三个水平的干预培养时间为所述干预培养时间的三水平，设定三因素三水平响应面试验，得到由最优香烟烟雾提取物的终浓度、最优脂多糖终浓度和最优干预培养时间组成的组合条件；

13、5)将对数生长期的beas-2b细胞接种于细胞培养板中培养至细胞贴壁后，在所述细胞培养板中加入香烟烟雾提取物和脂多糖按照最优干预培养时间进行干预培养25.08h，得到所述beas-2b细胞炎症损伤模型；

14、所述香烟烟雾提取物和脂多糖在所述细胞培养板中的终浓度分别为2.25％和0.5μg/ml；

15、步骤1)-步骤-3)的时间顺序不分先后。

16、优选的，步骤1)中所述不同终浓度的香烟烟雾提取物包括终浓度为0、0.5％、1.5％、2.5％、3.5％、4.5％、5.5％、6.5％、7.5％和8.5％的香烟烟雾提取物。

17、优选的，步骤2)中所述不同终浓度的脂多糖包括终浓度为0、0.25、0.5、1、2、4、5和10μg/ml的脂多糖。

18、优选的，步骤3)中所述不同的干预培养时间包括12、24、36、48、60和72h。

19、优选的，步骤1)所述三个水平的香烟烟雾提取物的终浓度包括0.56％、1.13％和2.25％。

20、优选的，步骤2)所述三个水平的脂多糖浓度包括0.5、1和2μg/ml。

21、优选的，步骤3)所述三个水平的干预培养时间包括12、24和36h。

22、优选的，步骤4)中所述最优香烟烟雾提取物的终浓度为2.25％，所述最优脂多糖终浓度为0.5μg/ml，所述最优干预培养时间为25.08h。

23、优选的，所述香烟烟雾提取物的制备步骤包括：

24、将dmem不完全培养基置于负压抽滤装置的气体吸收器中，在真空橡胶管上连接3根不带滤嘴的燃烧的香烟，采用真空负压抽滤的方式将所述泰山牌香烟产生的烟雾收集于所述气体吸收器中，静置15min，得到香烟烟雾粗提物；

25、调节所述香烟烟雾粗提物的ph值至7.3-7.4，并将调节ph值后的粗提物过滤除菌，得到所述香烟烟雾提取物。

26、本发明还提供了上述技术方案所述的构建方法得到的beas-2b细胞炎症损伤模型在呼吸系统炎症损伤相关疾病防治药物筛选中的应用。

27、有益效果：

28、本发明提供了一种beas-2b细胞炎症损伤模型的构建方法，所述构建方法选取香烟烟雾提取物和脂多糖代表导致呼吸系统炎症损伤相关疾病的吸烟和感染的两个重要暴露因素，能够有效模拟包括copd在内的呼吸系统疾病所出现的急性加重的肺功能急剧下降的症状；另外，本发明以响应面法筛选beas-2b细胞炎症损伤模型构建的关键参数，可以更加直观地分析香烟烟雾提取物、脂多糖和干预培养时间与其各自多水平响应值之间的关系，以及上述三个因素之间的交互关系，较正交设计等方法能够更加准确地预测不同条件下的模型结果，清晰地分析香烟烟雾提取物、脂多糖和干预培养时间的影响因素与水平的影响以及上述因素与水平间的交互作用，获得最优的beas-2b细胞炎症损伤模型构建参数。采用本发明所述构建方法获得的beas-2b细胞炎症损伤模型，稳定可靠，重复性好，接近人体呼吸系统炎症的病理生理状态，可用于呼吸系统炎症损伤相关疾病防治药物的筛选及发病机制的研究。

技术特征：

1.一种beas-2b细胞炎症损伤模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述不同终浓度的香烟烟雾提取物包括终浓度为0、0.5％、1.5％、2.5％、3.5％、4.5％、5.5％、6.5％、7.5％和8.5％的香烟烟雾提取物。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述不同终浓度的脂多糖包括终浓度为0、0.25、0.5、1、2、4、5和10μg/ml的脂多糖。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3)中所述不同的干预培养时间包括12、24、36、48、60和72h。

5.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述三个水平的香烟烟雾提取物的终浓度包括0.56％、1.13％和2.25％。

6.根据权利要求1或3所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述三个水平的脂多糖浓度包括0.5、1和2μg/ml。

7.根据权利要求1或4所述的构建方法，其特征在于，步骤3)所述三个水平的干预培养时间包括12、24和36h。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤4)中所述最优香烟烟雾提取物的终浓度为2.25％，所述最优脂多糖终浓度为0.5μg/ml，所述最优干预培养时间为25.08h。

9.根据权利要求1、2、5或8所述的构建方法，其特征在于，所述香烟烟雾提取物的制备步骤包括：

10.权利要求1-9任一项所述的构建方法得到的beas-2b细胞炎症损伤模型在呼吸系统炎症损伤相关疾病防治药物的筛选中的应用。

技术总结
本发明属于细胞模型技术领域，具体涉及一种BEAS‑2B细胞炎症损伤模型的构建方法。采用本发明所述构建方法获得的BEAS‑2B细胞炎症损伤模型，稳定可靠，重复性好，接近人体呼吸系统炎症的病理生理状态，可用于呼吸系统炎症损伤相关疾病防治药物的筛选及发病机制的研究。

技术研发人员：周文斌,刘盈盈,魏立新
受保护的技术使用者：中国科学院西北高原生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23