一种含L-EV的丝蛋白水凝胶及其制备与应用的制作方法

本发明涉及组织修复材料，尤其是涉及一种含l-ev的丝蛋白水凝胶及其制备与应用。

背景技术：

1、evs(细胞外囊泡)是一组具有类似细胞膜的脂质双分子层的纳米级颗粒，是由细胞分泌并参与细胞间通讯的重要旁分泌产物。众所周知，mscs(间充质干细胞)在组织再生中起到重要作用，由于msc-evs(间充质干细胞源性胞外囊泡)一定程度上继承了亲代细胞的功能，目前其作为无细胞疗法在再生医学中得到了广泛的应用。与细胞移植相比，evs除了可以避免细胞移植可能造成的并发症和伦理问题，其纳米级别尺寸允许它们在生产过程中用滤器灭菌，并且可在反复冻融和冻干后仍保持一定活性，evs的这些特性降低了其大规模生产和应用的门槛。然而，evs在体内的稳定性和保留性较差是临床应用的主要障碍，体液流动和血液循环的快速清除阻碍了evs在体内实现缓释而限制其持续发挥作用，为保证疗效往往需要频繁多次给药，这也给患者带来极大的不便与额外的负担。

2、因此，提供一种能够增强evs在体内的稳定性和保留性的方法是至关重要的。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种含l-ev的丝蛋白水凝胶及其制备与应用。本发明首先将第一溶液进行超声预处理后预冷，随即用于重悬l-ev沉淀，待凝胶形成后得到含l-ev的丝蛋白水凝胶；其中，第一溶液选自丝蛋白溶液或丝蛋白/锂皂土溶液中的一种；l-ev为经lps免疫刺激的间充质干细胞源性胞外囊泡。本发明的含l-ev的丝蛋白水凝胶的制备方法简单，l-ev在丝蛋白水凝胶中具有良好的分散性和缓释性能；本发明制备得到的含l-ev的丝蛋白水凝胶中l-ev能够增强皮肤缺损和牙槽骨缺损的修复效果，实际应用时可根据不同组织缺损类型选择适配的第一溶液。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的第一个目的是提供一种含l-ev的丝蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

4、第一溶液进行超声预处理后预冷，随即用于重悬l-ev沉淀，待凝胶形成后得到含l-ev的丝蛋白水凝胶；

5、其中，第一溶液选自丝蛋白溶液或丝蛋白/锂皂土溶液中的一种；

6、l-ev为经lps免疫刺激的间充质干细胞源性胞外囊泡；

7、当第一溶液为丝蛋白溶液时，含l-ev的丝蛋白水凝胶为丝蛋白/l-ev水凝胶(rsp/l-ev)；

8、当第一溶液为丝蛋白/锂皂土溶液时，含l-ev的丝蛋白水凝胶为丝蛋白/锂皂土/l-ev水凝胶(rsp/lap/l-ev)。

9、在本发明的一个实施方式中，将锂皂土与丝蛋白水溶液混匀，得到丝蛋白/锂皂土溶液；

10、锂皂土与丝蛋白的质量比为1～10：100；优选地，锂皂土与丝蛋白的质量比为5：100；

11、其中，丝蛋白水溶液的浓度为3～5wt％。

12、在本发明的一个实施方式中，超声预处理过程中，时间为1～3min；

13、预冷过程中，温度为0～4℃。

14、在本发明的一个实施方式中，所述l-ev通过下述方法制备得到：

15、(a1)将经传代处理后的bmscs(骨髓间充质干细胞)细胞置于含有lps(脂多糖)的免疫刺激条件培养基中进行免疫刺激，得到免疫刺激后的bmscs细胞；

16、(a2)将步骤(a1)制备得到的免疫刺激后的bmscs细胞后处理后置于无外泌体细胞培养基中培养，培养结束后收集上清液进行差速梯度离心处理，得到免疫刺激的间充质干细胞源性胞外囊泡：l-ev。

17、在本发明的一个实施方式中，l-ev在第一溶液的浓度为2～50μg/ml；

18、优选地，l-ev在第一溶液中的浓度为20μg/ml。

19、本发明的第二个目的是提供一种通过上述方法制备得到的含l-ev的丝蛋白水凝胶。

20、本发明的第三个目的是提供一种含l-ev的丝蛋白水凝胶在制备皮肤缺损修复药物中的应用，含l-ev的丝蛋白水凝胶为丝蛋白/l-ev水凝胶。

21、本发明的第四个目的是提供一种含l-ev的丝蛋白水凝胶在制备骨缺损修复药物中的应用，含l-ev的丝蛋白水凝胶为丝蛋白/锂皂土/l-ev水凝胶。

22、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

23、本发明优化了含l-ev的丝蛋白水凝胶制备过程，通过调整超声预处理时间，精确控制溶胶-凝胶窗口期，而后在溶胶状态下直接重悬l-ev沉淀。该过程快速简便，在保证l-ev生物活性的同时，使其均匀分散在水凝胶体系内，并能在体内缓释发挥其生物功能。本发明制备得到的rsf/l-ev可显著促进大鼠皮肤缺损修复，而rsf/lap/l-ev水凝胶可显著促进大鼠牙槽骨缺损修复。根据不同组织缺损类型可选择适配的l-ev丝蛋白水凝胶体系，使其获得更好的疗效，本发明在组织工程领域具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种含l-ev的丝蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种含l-ev的丝蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，将锂皂土与丝蛋白水溶液混匀，得到丝蛋白/锂皂土溶液；

3.根据权利要求2所述的一种含l-ev的丝蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，丝蛋白/锂皂土溶液中，锂皂土与丝蛋白的质量比为5：100。

4.根据权利要求1所述的一种含l-ev的丝蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，超声预处理过程中，时间为1～3min；

5.根据权利要求1所述的一种含l-ev的丝蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述l-ev通过下述方法制备得到：

6.根据权利要求5所述的一种含l-ev的丝蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，l-ev在第一溶液的浓度为2～50μg/ml。

7.根据权利要求6所述的一种含l-ev的丝蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，l-ev在第一溶液中的浓度为20μg/ml。

8.一种通过权利要求1～7任一所述的方法制备得到的含l-ev的丝蛋白水凝胶。

9.一种如权利要求8所述的含l-ev的丝蛋白水凝胶在制备皮肤缺损修复药物中的应用，其特征在于，含l-ev的丝蛋白水凝胶为丝蛋白/l-ev水凝胶。

10.一种如权利要求8所述的含l-ev的丝蛋白水凝胶在制备骨缺损修复药物中的应用，其特征在于，含l-ev的丝蛋白水凝胶为丝蛋白/锂皂土/l-ev水凝胶。

技术总结
本发明涉及组织修复材料技术领域，尤其是涉及一种含L‑EV的丝蛋白水凝胶及其制备与应用。本发明首先将第一溶液进行超声预处理后预冷，随即用于重悬L‑EV沉淀，待凝胶形成后得到含L‑EV的丝蛋白水凝胶；其中，第一溶液选自丝蛋白溶液或丝蛋白/锂皂土溶液中的一种；L‑EV为经LPS免疫刺激的间充质干细胞源性胞外囊泡。本发明的含L‑EV的丝蛋白水凝胶的制备方法简单，L‑EV在丝蛋白水凝胶中具有良好的分散性和缓释性能；本发明制备得到的含L‑EV的丝蛋白水凝胶中L‑EV能够增强皮肤缺损和牙槽骨缺损的修复效果，实际应用时可根据不同组织缺损类型选择适配的第一溶液。

技术研发人员：刘月华,孙良䶮,陈新,赵丙姣
受保护的技术使用者：上海市口腔医院（上海市口腔健康中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23