一种基于低共熔溶剂提取油茶叶多糖的方法及其应用

本发明属于生物提取，具体地，涉及一种基于低共熔溶剂提取油茶叶多糖的方法及其应用。

背景技术：

1、油茶(camellia oleifera abel)是系山茶科(theaceae)山茶属(camellia)的常绿小乔木，其主要经济价值是生产茶油。我国油茶种植面积到2025年预期达600.3万hm2。为了提高油茶产量，每年苗木修剪，产生占整个植株叶片的1/3油茶叶被丢弃，造成严重的资源浪费。油茶叶含有多种生物活性成分，主要为多糖、多酚和皂苷等，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖和抑菌等功效。因此，研究油茶叶的利用价值对提高油茶的综合利用率有重要的现实意义。

2、多糖是油茶叶极为重要的活性成分，由于其具有抗氧化、抗肿瘤和降血糖等作用而逐渐被关注。目前，油茶叶多糖(polysaccharide of c.oleifara leaves，clps)的提取方法主要为水提法(例如：gc-ms分析超声辅助热水法、热水提取法等)，而传统水提法存在提取率低和提取物活性弱等缺陷，因此，本领域亟需开发一种新型绿色、高效的提取溶剂以用于油茶叶多糖的提取中，提升其得率并进一步拓展其在食品、医药等领域中的应用。

3、低共熔溶剂(deep eutectic solvents，dess)是一类绿色、可生物降解的溶剂。dess主要由两种或以上的氢键供体(hydrogen bond donor，hbds)和氢键受体(hydrogenbond acceptor，hbas)通过氢键作用恰当而完美的结合而成，近年来，dess由于其高效，环保，低成本等优势被用于生物活性物质的提取。因此，筛选一种适合提取油茶叶多糖的dess溶剂，优化提取条件，对解决传统水提法提取率低等问题、提升油茶的综合利用率意义重大。

技术实现思路

1、有鉴于此，为了克服目前传统水提法对多糖的提取率低这一技术问题，本发明以油茶叶为原料，利用筛选得到的des-3提取油茶叶多糖并优化提取方法，为本领域提供了一种基于低共熔溶剂提取油茶叶多糖的方法，所述方法具有提取率高、提取物活性好、绿色环保、操作简单等优点。

2、本发明的上述发明目的通过以下技术方案得以实现：

3、本发明的第一方面提供了一种基于低共熔溶剂提取油茶叶多糖的方法。

4、进一步，所述方法包括如下步骤：

5、(1)将油茶叶干燥粉碎得到油茶叶粉末；

6、(2)采用低共熔溶剂bet-la对步骤(1)中所述的油茶叶粉末进行提取，得到油茶叶多糖提取液；

7、(3)将步骤(2)中所述的油茶叶多糖提取液经醇沉后收集沉淀，冷冻干燥，得到油茶叶多糖；

8、所述低共熔溶剂bet-la中，氢键受体为甜菜碱，氢键供体为乳酸。

9、进一步，所述低共熔溶剂bet-la中甜菜碱和乳酸的摩尔比为1:(1-10)；

10、优选地，所述低共熔溶剂bet-la中甜菜碱和乳酸的摩尔比为1:3。

11、进一步，所述低共熔溶剂bet-la的含水量为10％-50％；

12、优选地，所述低共熔溶剂bet-la的含水量为30％。

13、在本发明中，所述低共熔溶剂bet-la中的bet是指甜菜碱(betaine,bet)，所述低共熔溶剂bet-la中的la是指乳酸(lactic acid,la)，所述试剂均为本领域常规试剂，通过常规购买途径即可获得。

14、在一些实施方案中，所述低共熔溶剂bet-la采用如下制备方法制备得到：将上述甜菜碱和乳酸按照一定摩尔比置于烧杯中，加热搅拌至透明均匀液体形成，取出自然冷却至室温，若无沉淀形成则表明成功合成得到低共熔溶剂bet-la。

15、在本发明中，发明人通过大量对比实验验证发现，并不是任何常规的低共熔溶剂均能用于油茶叶多糖的有效提取中，具体地，本发明对11种不同类型的低共熔溶剂(bet-u、bet-meu、bet-gly、bet-pg、bet-eg、bet-lea、bet-la、bet-bg、bet-sorb、bet-ma、bet-xyl)的多糖提取效果及理化性质进行了测定和对比，结果显示，在11种不同类型的低共熔溶剂中，只有4种低共熔溶剂的多糖提取率高于传统水提法，其中，本发明采用的bet-la的提取率最高，这一技术效果属于本领域技术人员基于现有技术公开的内容所预料不到的技术效果。

16、在本发明中，所述甜菜碱和乳酸均为天然有机化合物，通过加热和搅拌混合，就能够形成均一的低共熔溶剂，通过在低共熔溶剂中加入适量的水，就能够降低低共熔溶剂的粘度，有利于提取时，提取物有效成分的扩散和溶剂质子的渗透。

17、进一步，步骤(2)中所述低共熔溶剂bet-la和油茶叶粉末对应的液料比(5-25)ml/g；优选地，步骤(2)中所述低共熔溶剂bet-la和油茶叶粉末对应的液料比14.4ml/g。

18、进一步，步骤(2)中所述提取的温度为(60-80)℃；

19、优选地，步骤(2)中所述提取的温度为71℃；

20、优选地，步骤(2)中所述提取的时间为(60-80)min；

21、更优选地，步骤(2)中所述提取的时间为69min；

22、优选地，步骤(2)中所述提取的方式为恒温水浴提取。

23、在一些实施方案中，所述恒温水浴提取的具体实验方法如下：称取油茶叶粉末，按照一定的液料比加入所述低共熔溶剂bet-la，在一定温度的恒温水浴锅下提取一定的时间，将得到的上清液进行过滤，离心后得到油茶叶多糖提取液。

24、进一步，步骤(3)中所述醇沉为采用乙醇进行醇沉。

25、进一步，所述醇沉包括如下步骤：

26、①旋蒸浓缩所述油茶叶多糖提取液后，加入乙醇得到沉淀；

27、②于所述沉淀中加入sevag试剂去除蛋白，收集上清液；

28、③透析所述上清液去除低共熔溶剂bet-la，浓缩后冷冻干燥得到油茶叶多糖；

29、优选地，所述sevag试剂为包含正丁醇和三氯甲烷的试剂；

30、优选地，所述sevag试剂中正丁醇和三氯甲烷的比例为1:4。

31、进一步，所述乙醇为无水乙醇。

32、进一步，所述无水乙醇的加入体积为9倍经旋蒸浓缩后的油茶叶多糖上清液的体积。

33、在一些实施方案中，所述醇沉的具体实验方法如下：将步骤(2)所得的茶叶多糖提取液进行过滤、离心后收集上清液，旋蒸浓缩去除多余的水后加入9倍体积的无水乙醇，4℃下过夜，离心收集沉淀，沉淀加水溶解后加入sevag试剂(正丁醇:三氯甲烷＝1:4)反复除蛋白至无蛋白析出，收集上清液透析3d左右，每天换水3～5次，尽可能除去所述低共熔溶剂，将透析的液体浓缩后冷冻干燥得到油茶叶多糖。

34、本发明还提供了一种本发明第一方面中所述低共熔溶剂bet-la的回收方法。

35、进一步，所述方法包括如下步骤：收集上样流出液，酒精沉淀后收集含有所述低共熔溶剂bet-la的上清液，旋蒸除去其中的水分和乙醇，即可重新用于油茶叶多糖的提取，即完成低共熔溶剂bet-la的回收。

36、在一些实施方案中，将回收的低共熔溶剂bet-la通过旋蒸去除多余的水分和乙醇，按照本发明第一方面中所述的步骤重新提取油茶叶多糖，直至油茶叶多糖的提取率低于80％，即认为提取效率下降明显，不能重复利用。

37、在本发明的具体实施方案中，本发明通过实验验证发现，随着循环使用次数的增加，本发明提供的低共熔溶剂bet-la仍具有较大的萃取能力，利用第三次回收的低共熔溶剂bet-la提取油茶叶多糖的提取效率仍可高达87.1％。

38、本发明的第二方面提供了采用本发明第一方面所述的方法制备得到的油茶叶多糖。

39、本发明的第三方面提供了如下任一方面应用：

40、(1)本发明第二方面所述的油茶叶多糖在制备缓解重金属毒性或治疗重金属中毒的药物中的应用；

41、(2)本发明第二方面所述的油茶叶多糖在制备抗氧化产品和/或降血糖产品中的应用；

42、(3)本发明第一方面中所述的低共熔溶剂bet-la在提取油茶叶多糖中的应用。

43、进一步，所述重金属包括al、hg、pb、cd、cr和/或ni。

44、本发明还提供了油茶叶多糖在制备抗肿瘤产品和/或抑菌产品中的应用。

45、在一些实施方案中，所述产品包括但不限于：药物、药物组合物或药物制剂，其主要有效活性成分为采用本发明第一方面所述的方法制备得到的油茶叶多糖。

46、在一些实施方案中，所述药物、药物组合物或药物制剂的剂型包括经肠胃道给药剂型、非经胃肠道给药剂型。在一些实施方案中，所述经肠胃道给药剂型包括溶液剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、散剂、缓释剂、泡腾剂、乳剂、糖浆剂、滴剂、咀嚼剂。在一些实施方案中，所述非经胃肠道给药剂型包括注射给药剂型、呼吸道给药剂型、腔道给药剂型、粘膜给药剂型、皮肤给药剂型。

47、在一些实施方案中，所述的药物、药物组合物或药物制剂的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、受试者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及所希望的对治疗有效的给药剂量。

48、在本发明的具体实施方案中，本发明采用秀丽线虫证明了采用本发明第一方面所述的方法制备得到的油茶叶多糖通过调控秀丽线虫daf-16、skn-1和hsf-1核转录因子入核，激活线虫氧化防御系统，降低线虫体内ros和mda水平，减少脂质和脂褐素的积累，缓解肠道损伤等增强秀丽线虫对重金属胁迫的抵抗能力。研究结果证实了油茶叶多糖具有缓解多种重金属毒性的作用。本发明的这一研究成果为油茶叶多糖开发成治疗重金属中毒的天然药物的提供了理论基础和理论依据。

49、相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：

50、(1)本发明首次将低共熔溶剂用于油茶叶多糖的提取，并筛选出最适合用于油茶叶多糖提取的低共熔溶剂体系bet-la(1:3)，其提取率比传统水提法高2.5倍，此外，本发明从秀丽线虫的生理生化水平上证明了油茶叶多糖的拮抗重金属作用，为油茶叶多糖开发成治疗重金属中毒的天然药物提供了理论基础和理论依据；

51、(2)本发明为油茶叶多糖提取这一技术领域提供了一种新型的基于低共熔溶剂bet-la提取油茶叶多糖的工艺技术，并实现了低共熔溶剂的重复利用，具有绿色、环保、高效、可重复利用、操作简单、提取率高、提取物活性好等优点，为油茶叶多糖的提取提供了新的思路和策略，可实现工业化生产。

技术特征：

1.一种基于低共熔溶剂提取油茶叶多糖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低共熔溶剂bet-la中甜菜碱和乳酸的摩尔比为1:(1-10)；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低共熔溶剂bet-la的含水量为10％-50％；

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述低共熔溶剂bet-la和油茶叶粉末对应的液料比(5-25)ml/g；

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述提取的温度为(60-80)℃；

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述醇沉为采用乙醇进行醇沉。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述醇沉包括如下步骤：

8.权利要求1-7中任一项所述的方法制备得到的油茶叶多糖。

9.如下任一方面应用：

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述重金属包括al、hg、pb、cd、cr和/或ni。

技术总结
本发明公开了一种基于低共熔溶剂提取油茶叶多糖的方法及其应用，本发明首次将低共熔溶剂用于油茶叶多糖的提取，并筛选出最适合用于油茶叶多糖提取的低共熔溶剂体系Bet‑LA(1:3)，其提取率比传统水提法高2.5倍，此外，本发明从秀丽线虫的生理生化水平上证明了油茶叶多糖的拮抗重金属作用，为油茶叶多糖开发成治疗重金属中毒的天然药物提供了理论基础和理论依据。

技术研发人员：冯士令,李逍,冷海琴,邓官峰,李平进,石国卿,陈涛,周莉君,丁春邦
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23