一种温氏支原体荧光定量PCR检测盒及应用
本发明涉及支原体检测，更具体的说是涉及一种温氏支原体荧光定量pcr检测盒及应用。
背景技术：
1、温氏支原体(m.wenyonii)是引起牛嗜血支原体病的主要病原之一。m.wenyonii的传播已遍及全球，它不仅能够侵袭多种动物物种，还能对人类健康构成威胁。m.wenyonii通常寄生于动物的红细胞表面和骨髓中，使红细胞携氧能力下降，被感染的牛会出现体温升高、皮肤黏膜苍白或黄染、生产性能下降、流产或引起其他多种疾病继发感染死亡等症状。
2、由于嗜血原体缺乏细胞壁，它们的外形相对较柔软和不规则，在血浆中游离做翻滚上升等运动，当他们附着于红细胞表面会就停止运动使红细胞呈现出星芒状，蓖麻球状等。有研究表明在嗜血原体表面有细长的细丝结构，在电镜下观察到的红细胞表面的凹陷，变形可能是这些细丝结构连接到细胞膜上导致的。但有时因其他血液性疾病导致红细胞变形难以判断，所以通过镜检方法只能初步判断具体还要依靠分子生物学诊断。
3、目前，牛m.wenyonii的主要诊断方法有镜检、pcr技术、elisa和胶体金免疫层析测定法等实验室诊断方法。但由于缺乏体外诊断抗原，导致牛m.wenyonii血清学检测研究进展缓慢。随着分子生物学和信息学技术的发展，qpcr技术已被应用于病原定量检测、基因突变筛查和基因分型等方面。该技术因具有快速、准确、操作简单、具有较强的特异性和较高的敏感性等优点，适合用于病原微生物的快速检测。
4、为改进m.wenyonii的检测方法，本发明拟以新疆阿克苏地区牛m.wenyonii为研究对象，通过基因克隆技术获得m.wenyonii的16srrna基因阳性克隆质粒，建立基于牛m.wenyonii 16s rrna的taqman荧光定量pcr检测方法，该方法通过使用taqman荧光探针进行荧光检测，以期达到快速筛查牛m.wenyonii的感染情况，有利于掌握新疆阿克苏地区牛m.wenyonii的感染情况，为新疆牛m.wenyonii病原的防控做贡献。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种温氏支原体荧光定量pcr检测盒及应用。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、一种温氏支原体荧光定量pcr检测盒，所述试剂盒包括荧光定量pcr上游引物m.wenyonii-f，荧光定量pcr下游引物m.wenyonii-r；
4、所述荧光定量pcr上游引物m.wenyonii-f序列如seq id no.3所示；
5、所述荧光定量pcr下游引物m.wenyonii-r序列如seq id no.4所示。
6、进一步的，所述试剂盒还包括探针m.wenyonii-p；
7、所述探针m.wenyonii-p序列如seq id no.5所示。
8、进一步的，所述荧光定量pcr反应条件为：恒温段：95℃，5min，循环1次；循环段：95℃，10s，60℃，30s，循环29次。
9、一种温氏支原体荧光定量pcr检测盒在检测温氏支原体中的应用。
10、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：
11、通过显微镜可观察到牛m.wenyonii形态特征呈单个游离在血浆中呈球形，附着在红细胞表面使红细胞变形呈星芒状，电镜下观察到红细胞表面有凹陷m.wenyonii嵌在表面。
12、本发明基于牛m.wenyonii 16s rrna基因设计特异性引物对样本进行pcr扩增，扩增结果与牛m.wenyonii片段大小一致(738bp)，并将其连接到了t载体上。为了验证克隆结果，本发明将克隆后的基因序列与在genbank数据库中已知的牛m.wenyonii的16s rrna基因序列(mg948625)进行了比对。经过分析，两个序列之间显示出100％的相似性，表明目的基因成功连接到克隆载体上，并将其命名为pmd-19t-m.wenyonii-1。
13、以pmd-19t-m.wenyonii-1阳性质粒作为标准品，构建针对牛m.wenyonii的taqmanqpcr检测方法。通过对引物浓度的优化以及退火温度的调整，得到了最佳的反应条件。在此基础上，本发明利用倍比稀释法构建出标准曲线，与朱水芳等人建立的标准曲线相符，呈现良好的线性关系。对该qpcr的特异性进行验证，试验结果表明牛m.wenyonii与babesiabovis、m.suis、t.luwenshuni.和anaplasma基因扩增结果显示，样本中并未出现任何交叉感染现象，表明了所采用的扩增技术具有极高的特异性。同时，该方法的灵敏性为4.52×102拷贝/μl，通过符合率试验证明此方法对牛m.wenyonii的检测结果可信。这一结果对于后续的遗传分析和诊断工作提供了重要的基础。该方法不仅提高了工作效率，而且增加了阳性检出率，可更准确地判断牛m.wenyonii的感染情况。相比于染料法而言，探针法虽然花费较高，但特异性强，敏感度高。染料法会受到引物二聚体的困扰，无法做到绝对的特异性。此外，该技术还有助于进行病原流行病学调查，为疾病的预防、控制和有效治疗提供了有力支持。通过这种方法，本发明能够更精准地监测病原体的传播动态，从而确保畜牧业生产的健康和安全。
技术特征：
1.一种温氏支原体荧光定量pcr检测盒，其特征在于，所述试剂盒包括荧光定量pcr上游引物m.wenyonii-f，荧光定量pcr下游引物m.wenyonii-r；
2.根据权利要求1所述的一种温氏支原体荧光定量pcr检测盒，其特征在于，所述试剂盒还包括探针m.wenyonii-p；
3.根据权利要求1所述的一种温氏支原体荧光定量pcr检测盒，其特征在于，所述荧光定量pcr反应条件为：恒温段：95℃，5min，循环1次；循环段：95℃，10s，60℃，30s，循环29次。
4.权利要求1所述一种温氏支原体荧光定量pcr检测盒在检测温氏支原体中的应用。
技术总结
本发明公开了一种温氏支原体荧光定量PCR检测盒及应用，支原体检测技术领域。所述试剂盒包括荧光定量PCR上游引物M.wenyonii‑F，下游引物M.wenyonii‑R；所述上游引物M.wenyonii‑F序列如SEQ ID No.3所示；所述下游引物M.wenyonii‑R序列如SEQ ID No.4所示。本发明提供了一种灵敏度高、特异性强的荧光定量PCR试剂盒，用于测定M.wenyonii。通过设计引物浓度和系统地优化了反应体系提高扩增效率，可应用临床检测。
技术研发人员：李莲瑞,李雪娇,侯梦哲,黎双,郝斌,刘淑华,陈鑫,梁樊鑫
受保护的技术使用者：塔里木大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23