一种冠脉乐片指纹图谱方法与流程
本发明涉及药品检测领域，具体是一种冠脉乐片指纹图谱方法。
背景技术：
1、冠脉乐片具有增加冠状动脉血流量，调节心律，降低心肌耗氧量的功效。主要用于治疗冠心病、心绞痛。
2、指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的dna，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。
3、现有冠脉乐片缺乏指纹图谱检测方法，需要改进。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种冠脉乐片指纹图谱方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、一种冠脉乐片指纹图谱方法，包括以下步骤：
4、步骤1，设定色谱条件；
5、步骤2，对供试品溶液进行制备；
6、步骤3，对色谱条件优化；
7、步骤4，对供试品溶液制备进行考察；
8、步骤5，基于色谱条件来验证供试品溶液；
9、步骤6，取尿苷、肌苷、尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤及腺苷对照品，加甲醇制成每1ml各含50ug的对照品溶液，分别进样，并与供试品溶液比较；若结果未见供试品溶液与以上对照品对应的特征峰，判断本品辅料对指纹图谱无干扰；
10、步骤3包括：
11、步骤31，对检测波长进行选择，比较后选择280nm作为检测波长；
12、步骤32，对色谱梯度进行选择，选择梯度c:0～60min,3％b～20％b为冠脉乐片hplc指纹图谱的色谱梯度；
13、步骤4包括：
14、步骤41，对提取溶剂考察，并选择提取溶剂；
15、步骤42，对提取方式考察，选择提取方式；
16、步骤43，对提取时间考察，选择提取时间；
17、步骤44，对提取体积考察，选择提取体积；
18、步骤5包括：
19、步骤51，基于步骤2获取供试品溶液，基于步骤1设定色谱条件，连续进样6次，以中位数法，时间窗宽度为0.1分钟，设参照图谱，多点校正，全峰匹配，完成对仪器精密度验证；若计算各共有峰的相似度均为1.0，表明仪器精密度良好；
20、步骤52，基于步骤2获取供试品溶液，基于步骤1设定色谱条件，分别进样检测，以中位数法，时间窗宽度为0.1分钟，设参照图谱，多点校正，全峰匹配，完成对供试品溶液重复性验证；若计算各共有峰的相似度为1.0，表明重复性良好；
21、步骤53，基于步骤2获取供试品溶液，基于步骤1设定色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24h进样测定，以中位数法，时间窗宽度为0.1分钟，设参照图谱，多点校正，全峰匹配，完成对供试品溶液稳定性验证；若计算各共有峰的相似度均为1.0，表明溶液在24小时内稳定性良好；
22、步骤54，基于色谱条件来验证供试品溶液，完成对供试品溶液耐用性验证；
23、步骤55，基于步骤2获取供试品溶液，基于步骤1设定色谱条件，进样检测并与供试品溶液的色谱图进行比较，完成对供试品溶液专属性验证；若结果辅料样品溶液无色谱峰出现，说明本方法专属性良好。
24、作为本发明再进一步的方案：步骤1中，设定色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相a，以0.05％磷酸溶液为流动相b，按梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为35℃；检测波长280nm；进样体积20μl。
25、作为本发明再进一步的方案：步骤2中包括：
26、步骤21，对冠脉乐片片剂而言，除去糖衣，研细，取0.2g；对冠脉乐片原料而言，取0.2g；
27、步骤22，将0.2g冠脉乐片材料置于锥形瓶中，加水10ml，水浴加热回流1小时，放冷，滤过，取续滤液获得供试品溶液。
28、作为本发明再进一步的方案：步骤31中，取片剂供试品溶液，利用dad检测器进行190-600nm全波长扫描，分别在220nm、254nm、280nm下进一步选择波长，结果表明：254nm波长下体现的信息量最大，但基线不太平稳、部分色谱峰分离不佳，而280nm波长下明显的色谱峰也达到7个以上，其基线平稳、主要色谱峰分离效果好；220nm下色谱峰信息较254nm、280nm波长少，综合比较，最终选择280nm作为检测波长。
29、作为本发明再进一步的方案：步骤32中，以0.05％磷酸溶液为流动相a，甲醇为流动相b，考察不同梯度条件下色谱峰分离情况，梯度条件分别为a：0～100min,3％b～100％b；b：0～60min,3％b～30％b；c:0～60min,3％b～20％b，记录色谱图，结果表明梯度c条件下色谱图基线平稳，色谱峰峰形好、分离度好，因此选择梯度c:0～60min,3％b～20％b为冠脉乐片hplc指纹图谱的色谱梯度。
30、作为本发明再进一步的方案：步骤41中，取冠脉乐片(批号：20230601)研细，取0.2g，平行9组，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇、乙醇、70％乙醇、稀乙醇、30％乙醇、水10ml，分别进行超声处理(功率250w，频率40khz)60分钟，放冷，滤过，取续滤液作为供试品溶液，分别吸取各供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，按上述液相色谱条件测定；结果为水提取色谱峰峰形、分离度较好，且各主要峰的峰面积均较大，综合考虑，选择水为提取溶剂。
31、作为本发明再进一步的方案：步骤42中，取冠脉乐片(批号：20230601)研细，取0.2g，平行3组，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水10ml，分别进行超声处理(功率250w，频率40khz)、加热回流、振荡提取60分钟，放冷，滤过，取续滤液作为供试品溶液，分别吸取各供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，按上述液相色谱条件测定，通过对比超声处理、加热回流、振荡提取发现，加热回流处理总峰面积/称样量值大，提取完全，操作简便，因此，选择加热回流提取作为供试品溶液的提取方式。
32、作为本发明再进一步的方案：步骤43中，取冠脉乐片(批号：20230601)研细，取0.2g，平行4组，精密称定，置锥形瓶中，精密加入水10ml，称定重量，水浴加热回流15、30、45、60分钟，放冷，称重，补足减失重量，滤过，取续滤液即得，分别吸取各供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，按液相色谱条件测定，结果表明，通过对比不同提取时间对指纹图谱的影响发现，提取时间为60分钟时的总峰面积最大，因此，最终选择提取时间为60分钟。
33、作为本发明再进一步的方案：步骤44中，取冠脉乐片(批号：20230601)研细，取0.2g，平行3组，精密称定，置锥形瓶中，分别加入水10ml、25ml、50ml，称定重量，水浴加热回流60分钟，放冷，称重，补足减失重量，滤过，取续滤液即得，分别吸取各供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，按液相色谱条件测定，结果表明，通过对比不同提取体积对指纹图谱的影响发现，提取体积为10ml时的总峰面积已达最大(增加溶剂体积未见明显的提高)，因此，最终选择提取体积为10ml。
34、作为本发明再进一步的方案：步骤54包括：
35、步骤541，对不同柱温考察，基于步骤51获取供试品溶液，基于步骤1设定色谱条件，分别考察了柱温为30℃、35℃、40℃时的样品分离效果，记录色谱图。将三张色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版本)进行相似度计算，结果表明：不同温度下色谱图的相似度均不低于0.98(说明柱温对检测结果的影响不大)。
36、步骤542，对不同色谱柱考察，基于步骤51获取供试品溶液，基于步骤1设定色谱条件，考察不同色谱柱在不同色谱条件下对同一份样品检测结果之间的差异。色谱柱分别为a：kromasil 100-5-c18(kromasil，4.6×250mm，5μm)；b：agilentzorbaxsb-c18(agilent，4.6×250mm，5μm)；c：venusil mp c18(agela，4.6×250mm，5μm)，记录色谱图。将三张色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版本)进行相似度计算；结果表明：三根色谱柱所得色谱图的相似度不低于0.99(表明此方法对不同色谱柱的适用性广)。
37、步骤543，对不同色谱仪器考察，基于步骤51获取供试品溶液，基于步骤1设定色谱条件，考察不同色谱仪器对同一份样品检测结果之间的差异。色谱仪器分别为：agilent1290、thermo vanquishhplc、岛津-40d，记录色谱图，将三张色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版本)进行相似度计算，结果表明，不同色谱仪器相似度不低于0.95(表明此方法对不同色谱仪器的选择性较低)。
38、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明对冠脉乐片及类似药品的指纹图谱检测领域提供参考，能够对药品性能获得更全面的认知。
技术特征：
1.一种冠脉乐片指纹图谱方法，其特征在于，该冠脉乐片指纹图谱方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的冠脉乐片指纹图谱方法，其特征在于，步骤1中，设定色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相a，以0.05％磷酸溶液为流动相b，按梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为35℃；检测波长280nm；进样体积20μl。
3.根据权利要求1所述的冠脉乐片指纹图谱方法，其特征在于，步骤2中包括：
4.根据权利要求1所述的冠脉乐片指纹图谱方法，其特征在于，步骤31中，取片剂供试品溶液，利用dad检测器进行190-600nm全波长扫描，分别在220nm、254nm、280nm下进一步选择波长，结果表明：254nm波长下体现的信息量最大，但基线不太平稳、部分色谱峰分离不佳，而280nm波长下明显的色谱峰也达到7个以上，其基线平稳、主要色谱峰分离效果好；220nm下色谱峰信息较254nm、280nm波长少，综合比较，最终选择280nm作为检测波长。
5.根据权利要求1所述的冠脉乐片指纹图谱方法，其特征在于，步骤32中，以0.05％磷酸溶液为流动相a，甲醇为流动相b，考察不同梯度条件下色谱峰分离情况，梯度条件分别为a：0～100min,3％b～100％b；b：0～60min,3％b～30％b；c:0～60min,3％b～20％b，记录色谱图，结果表明梯度c条件下色谱图基线平稳，色谱峰峰形好、分离度好，因此选择梯度c:0～60min,3％b～20％b为冠脉乐片hplc指纹图谱的色谱梯度。
6.根据权利要求1所述的冠脉乐片指纹图谱方法，其特征在于，步骤41中，取冠脉乐片研细，取0.2g，平行9组，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇、乙醇、70％乙醇、稀乙醇、30％乙醇、水10ml，分别进行超声处理60分钟，放冷，滤过，取续滤液作为供试品溶液，分别吸取各供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，按上述液相色谱条件测定；结果为水提取色谱峰峰形、分离度较好，且各主要峰的峰面积均较大，综合考虑，选择水为提取溶剂。
7.根据权利要求1所述的冠脉乐片指纹图谱方法，其特征在于，步骤42中，取冠脉乐片研细，取0.2g，平行3组，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水10ml，分别进行超声处理、加热回流、振荡提取60分钟，放冷，滤过，取续滤液作为供试品溶液，分别吸取各供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，按上述液相色谱条件测定，通过对比超声处理、加热回流、振荡提取发现，加热回流处理总峰面积/称样量值大，提取完全，操作简便，因此，选择加热回流提取作为供试品溶液的提取方式。
8.根据权利要求1所述的冠脉乐片指纹图谱方法，其特征在于，步骤43中，取冠脉乐片研细，取0.2g，平行4组，精密称定，置锥形瓶中，精密加入水10ml，称定重量，水浴加热回流15、30、45、60分钟，放冷，称重，补足减失重量，滤过，取续滤液即得，分别吸取各供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，按液相色谱条件测定，结果表明，通过对比不同提取时间对指纹图谱的影响发现，提取时间为60分钟时的总峰面积最大，因此，最终选择提取时间为60分钟。
9.根据权利要求1所述的冠脉乐片指纹图谱方法，其特征在于，步骤44中，取冠脉乐片研细，取0.2g，平行3组，精密称定，置锥形瓶中，分别加入水10ml、25ml、50ml，称定重量，水浴加热回流60分钟，放冷，称重，补足减失重量，滤过，取续滤液即得，分别吸取各供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，按液相色谱条件测定，结果表明，通过对比不同提取体积对指纹图谱的影响发现，提取体积为10ml时的总峰面积已达最大，因此，最终选择提取体积为10ml。
10.根据权利要求1到9任意一项所述的冠脉乐片指纹图谱方法，其特征在于，步骤54包括：
技术总结
本发明公开了一种冠脉乐片指纹图谱方法，涉及药品检测领域，步骤1，设定色谱条件；步骤2，对供试品溶液进行制备；步骤3，对色谱条件优化；步骤4，对供试品溶液制备进行考察；步骤5，基于色谱条件来验证供试品溶液；步骤6，取尿苷、肌苷、尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤及腺苷对照品，加甲醇制成每1ml各含50ug的对照品溶液，分别进样，并与供试品溶液比较；若结果未见供试品溶液与以上对照品对应的特征峰，判断本品辅料对指纹图谱无干扰；与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明对冠脉乐片及类似药品的指纹图谱检测领域提供参考，能够对药品性能获得更全面的认知。
技术研发人员：张屹峰
受保护的技术使用者：三明市三真药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23