诱导性修复疾病非人动物模型的构建与应用

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种疾病非人动物模型的构建方法、由此产生的细胞、组织或器官及其在在生物医药的应用。

背景技术：

1、疾病动物模型是指医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物，已被广泛用来研究人类疾病的发生发展机制、药物筛选以及治疗评价等。人类疾病发展十分复杂，以人作为实验对象来探讨疾病发生机制存在诸多局限，许多实验在伦理上也受到限制。而在动物体内试验，可以避免人体实验所造成的风险、危害和伦理问题。对于罕见病和遗传性疾病还存在实验对象不足、致病因素复杂等困难。借助动物模型的构建，可以针对性地模拟自然条件下存在的致病因素，更加准确、快速地得到实验结果，并与人类疾病进行比较，排除不确定因素，便于高效解析人类疾病的发生发展规律，制定预防和治疗措施。

2、一个好的疾病动物模型须尽可能满足与人类疾病比较的“三性”特征,即发病机理同源性、行为表象一致性、药物治疗预见性,同时具有创建易行性,重现性与经济性的特点。缺乏合适的动物模型是许多重大疾病发病机制解析、预防、诊断预后标志物发现、药物筛选和评价、疫苗开发的重要瓶颈。

3、小鼠和人的基因相似度99％，因其繁殖迅速、饲养相对廉价、遗传操作简便，而被广泛运用于各种研究中。利用小鼠模型研究基因功能时，通常会采用功能缺失(loss offunction)或功能获得(gain of function)的策略来研究目的基因的具体执行功能和调控机制。小鼠模型已是生物医学研究中不可或缺的工具，对于单个基因的功能研究、各种疾病机制研究、药物功效和毒性评价有着巨大贡献。

4、人类遗传性疾病的发病率和死亡率日益突出，这些疾病对人类的危害极大且大多难以用药物治疗。遗传性疾病分为单基因、多基因和染色体异常遗传病三类。基因治疗是通过对造成患者疾病的基因进行补充、修复或替换来治疗疾病，有望成为一种有效的方法来治疗这些遗传性疾病。基因治疗针对异常的基因本身，相对于传统药物具有明显的优势。体内单基因突变导致的血友病和肌营养不良症等都是基因治疗研究领域的热点疾病。

5、以duchenne肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy，dmd)和becker肌营养不良症(becker muscular dystrophy，bmd)为例，它们都是致死性的x连锁隐性遗传病，由抗肌萎缩蛋白(dystrophin，dmd)基因的各种不同突变导致。大约70％的duchenne肌营养不良症是由单外显子或多外显子缺失或重复引起的，基因突变导致肌肉细胞膜上的duchene肌营养障碍(<5％)，抗肌萎缩蛋白缺失。在becker肌营养不良症中，85％的患者单外显子或多外显子有缺失，10％有重复，基因突变导致duchene肌营养障碍，抗肌萎缩蛋白异常生成或不足。

6、duchenne肌营养不良症影响大约10/100,000的活产男性，通常表现在2至3岁之间。肌无力影响近端肌肉，开始时影响下肢。儿童常表现为蹒跚步态、用脚趾走路和脊柱前凸。他们在跑步、跳跃、爬楼梯和从地面上站立时存在困难。儿童经常跌倒，往往造成手臂或腿部骨折(约占患者20％)。几乎所有的患儿肌无力慢慢进展，肢体屈曲性挛缩和脊柱侧凸进展。发展成肌假性肥大(脂肪和纤维取代了特定肥大的肌肉组织，尤其是在腓部)。大多数儿童到12岁时需要使用轮椅，到20岁时死于呼吸并发症。

7、与duchenne肌营养不良症相比，becker肌营养不良症影响<8/100,000名活产男性，通常症状出现的时间较晚，且较轻。离床活动通常维持至少到15岁，许多患儿保持不卧床直至成年。受影响最严重的患儿存活到30多岁和40多岁。

8、人类dmd基因位于x染色体xp21上，基因全长约2,220kb，含79个外显子，cdna长14kb，包含3685个氨基酸，是目前已知最大的基因之一，并且具有进化保守性。dmd蛋白是一个细胞骨架蛋白，位于肌膜下的细胞质内，作为分子桥连接肌动蛋白和跨膜糖蛋白形成dapc(dystrophin associated protein complex)复合物。dmd蛋白缺失会导致肌细胞在离心性收缩时会被机械力破坏，以及对机械力敏感的离子通道失调。肌细胞膜因无法保持完整，出现异常蛋白和钙内流、肌酸激酶外流等，最终造成肌细胞变性和坏死，进而引发炎症反应加重肌萎缩进程。

9、目前最常用的肌营养不良症小鼠模型是c57bl/10scsn-dmdmdx(简称mdx小鼠)，是由自发突变获得，23号外显子上发生c.c2983t点突变，导致p.q995x，使得蛋白合成提前终止，造成蛋白截短。mdx小鼠已广泛应用到肌营养不良症的致病机理、病理改变、临床表型和临床前实验的研究转化工作中，尽管mdx小鼠病理表型相比病人临床表型较弱。

10、目前针对肌营养不良症的治疗主要为药物治疗、基因治疗和细胞治疗。药物辅助治疗主要是服用类固醇来延长行走、减缓肌肉萎缩和改善心脏功能等，但长期服用类固醇会有副作用，如：骨质疏松、白内障、高血压、易感染等。基因治疗主要是通过纠正病人的dmd基因突变、激活胎儿时期内源性utrn蛋白的表达或引入外源dmd蛋白进行回补修复。细胞治疗主要是通过分离病人自身干细胞体外修复dmd基因突变后回输到病人体内，或异体健康人的干细胞直接回输病人体内。移植细胞类型主要有成肌细胞、血管诱导产生的干细胞和间充质干细胞等。其中基因治疗和细胞治疗主要都是为了回补dmd蛋白的正常功能，从而达到疾病治疗的目的。

11、国际上主要在研方向是通过基因修复治疗，其中基因治疗药物eteplirsen和golodirsen已被fda批准，其作用机理是通过反义寡核苷酸(aso)封闭突变形成的非正常剪切位点，使剪切后形成的dmd mrna跳过一个或几个外显子序列，恢复原有读码框。虽然dmd蛋白有所截短，但仍具有基本功能。但这两种药临床上存在严重不良反应，仅被fda有条件获批，仍需要进行上市后研究，继续提供其有效性和安全性证明。另外还有translama(ataluren)也获批，主要是通过在造成突变终止密码子上的核糖体连读，从而翻译出正常dmd蛋白，有一定的临床改善。现在还有许多肌营养不良症治疗方法还在进行临床实验，但由于病人疾病进程的持续性恶化，在疾病晚期已对患者造成了不可挽回的损伤，即使重新回补dmd蛋白也可能疗效不佳。

12、因此除了基因治疗和细胞治疗本身的技术瓶颈外，对肌营养不良症的最佳治疗时间窗口并不清晰。病人在疾病进程的哪个阶段时，还能通过回补dmd蛋白改善其疾病表型？不同疾病进程的修复治疗会导致怎样的改善表型？这些相关研究目前还不明确，仍无法成功治愈肌营养不良症，依然有许多问题等待我们去揭示。我们需要结合各种动物模型，在各个层面对肌营养不良症从病因到治疗方案进行深入研究，从而最终实现治愈肌营养不良症。

13、由于dmd蛋白是最大的蛋白质之一，各种传统外源基因导入方法都受到限制，是疗效不佳的原因之一。

14、条件性基因调控是一种在特定时空或条件下调控基因表达或基因组编辑的技术。实现该技术的基础是特异启动子和位点特异性重组系统。位点特异性重组系统由重组酶和特异性识别位点两部分组成，重组酶能够在没有辅助蛋白的帮助下，实现基因组dna的切除、倒位和易位。可以通过对重组酶优化升级改造，使其成为诱导性重组系统。在疾病动物模型中利用条件性基因编辑实现诱导性基因治疗，可以为人类遗传性疾病研究提供理论基础和治疗方向。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明在常规的疾病非人动物模型的基础上，构建出诱导性修复疾病非人动物模型，从而可以从基因组上实现突变的致病基因转变回野生型基因。

2、一方面，本发明提供一种疾病非人动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法向含有突变的致病基因的常规的疾病非人动物模型中，外源引入重组识别序列，所述重组识别序列可诱导地实现序列重组，可以从基因组上实现突变的致病基因转变回野生型基因。

3、另一方面，本发明提供一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于本发明任一前述方法构建的诱导性修复疾病非人动物模型。

4、另一方面，本发明提供一种组织或器官，其特征在于，所述组织或器官来源于本发明任一前述方法制备的诱导性修复疾病非人动物模型。

5、另一方面，本发明提供本发明任一前述构建方法获得的诱导性修复疾病非人动物模型的应用，其特征在于，所述的应用包括：

6、1)用于疾病治疗方案的临床前实验，为各种疾病临床治疗手段提供临床前实验的阳性对照组；或

7、2)为临床方案提供最佳治疗时间窗口、病人入组条件、生物标志物选择、最佳临床实验终点中的一或多个参考标准，所述的应用为非疾病的诊断和治疗目的。

8、该诱导性修复疾病非人动物模型，在常规的疾病非人动物模型的基础上，通过诱导性修复突变的致病基因组序列，在不同疾病进程时期进行致病基因表达蛋白的回补，分析观察疾病表型和治疗情况，积累相关数据，从而选择最佳治疗窗口和优化治疗方案。

9、creer小鼠在tam给药后是全身性修复，即基因型最强修复方式。此外，还可用腺相关病毒(aav)等病毒或其他载体递送cre重组酶，也能实现基因型修复。

10、该非人动物模型可用于相关疾病治疗方案的临床前实验，为各种相关疾病临床治疗手段提供临床前实验的阳性对照组，用于药效和疗效评价；还能为临床方案提供最佳治疗时间窗口、病人入组条件、生物标志物选择、最佳临床实验终点等参考标准。

技术特征：

1.一种诱导性修复疾病非人动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法向含有突变的致病基因的常规的疾病非人动物模型中，外源引入重组识别序列，所述重组识别序列可诱导地实现序列重组，可以从基因组上实现突变的致病基因转变回野生型基因。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述重组识别序列可由选自由以下组中的重组酶识别：cre重组酶，dre重组酶，flp重组酶，bxb1整合酶和整合酶。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述重组识别序列选自以下的组：loxp序列、loxp l3序列、loxp 2l序列、loxfas序列、lox511序列、lox2272序列、lox2372序列、lox5171序列、loxm2序列、lox71序列、lox66序列、frt序列、rox序列、rox7序列、rox8序列、rox12序列、rox61序列、rox85序列、rox2152序列、rox2352序列、rox2232序列、rox2131序列、bxb1 attp序列、bxb1attb序列、 attp序列和 attb序列。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述重组识别序列可由cre重组酶识别，选自以下的组：loxp序列、loxp l3序列、loxp 2l序列、loxfas序列、lox511序列、lox2272序列、lox2372序列、lox5171序列、loxm2序列、lox71序列和lox66序列。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述常规的疾病非人动物模型与creer动物交配，获得双基因型阳性动物；其中所述creer动物可表达由tamoxifen(tam)诱导的cre重组酶，优选由广谱表达的强启动子介导。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述cre重组酶通过病毒或载体递送，优选通过腺相关病毒递送。

7.根据权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，所述突变的致病基因或含有突变的部分区段翻转为野生型基因或野生型的部分区段。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物是哺乳动物，优选啮齿动物，尤其优选小鼠。

9.根据权利要求1-8任一项所述的构建方法，其特征在于，所述疾病选自duchenne肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy，dmd)和becker肌营养不良症(becker musculardystrophy，bmd)。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述常规的疾病非人动物模型是肌营养不良症小鼠模型，其中小鼠dmd基因23号外显子上引入c.c2983t点突变，导致p.q995x。

11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述cre重组酶可以实现从突变23号外显子翻转为野生型23号外显子。

12.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求1-11任一所述方法构建的诱导性修复疾病非人动物模型。

13.一种组织或器官，其特征在于，所述组织或器官来源于权利要求1-11任一所述的方法制备的诱导性修复疾病非人动物模型。

14.一种权利要求1-11任一所述的构建方法获得的诱导性修复疾病非人动物模型的应用，其特征在于，所述的应用包括：

技术总结
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种疾病非人动物模型的构建方法、由此产生的细胞、组织或器官及其在在生物医药的应用。由此构建的疾病非人动物模型可用于相关疾病治疗方案的临床前实验，为各种相关疾病临床治疗手段提供临床前实验的阳性对照组，用于药效和疗效评价；还能为临床方案提供最佳治疗时间窗口、病人入组条件、生物标志物选择、最佳临床实验终点等参考标准。

技术研发人员：蒋婧,谢甜,高瑞钰,施宸唯,陈淑藯,刘琳,李劲松
受保护的技术使用者：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23