体外支架蛋白介导漆酶木聚糖酶多酶复合体及其制备方法和应用
本发明涉及酶工程领域，尤其涉及一种体外支架蛋白介导漆酶/木聚糖酶多酶复合体及其制备方法和应用。
背景技术：
1、木质素是由苯丙烷类似物为单元构成的一大类生物多聚体，组成单元的结构及其连接键复杂而稳定，难以降解，并且在纸浆中木质素与木聚糖形成复合体紧密地附着在纤维上，难以除去。木质素发生氧化反应后将生成有色物质导致纸张泛黄，同是有一部分研究者认为木质素的存在将使纸张ph值呈现酸性，继而加剧纤维素链中糖苷键的水解断裂并引起纸张机械强度的大幅下降，可见，目前木质素被普遍被认为是导致纸张泛黄、物理强度低的主要原因。
2、为了提高纸张的白度和物理强度，去除木质素是目前主要的研究方向，传统机械法和化学法去除木质素，机械法耗能且不能去除木质素，化学法虽耗能减少、纤维量降低，但对环境不友好。相较之下，生物制浆具有清洁、温和的特性。目前，在纸浆生物漂白过程中常利用微生物或半纤维素酶和木素降解酶等酶制剂协同联合处理纸浆，使其有利于脱木素，以改善纸浆色泽、提高纸浆白度、改善纸浆可漂性性。但是多种酶进行协同催化纸浆中的木质素存在催化效率低的问题，原因是多种酶均以游离的形态存在，协同催化的中间产物的传递效率低。
技术实现思路
1、为了克服以上问题，本发明的目的是提供一种体外支架蛋白介导漆酶/木聚糖酶多酶复合体及其制备方法和应用，制备得到的漆酶/木聚糖酶多酶复合体能够明显提高对纸浆中木质素的降解能力。
2、为实现上述目的，本发明所设计的体外支架蛋白介导漆酶/木聚糖酶多酶复合体的制备方法，包括步骤：
3、步骤1、支架蛋白mcipa的获取：
4、从cipa基因中截取支架蛋白mcipa基因，将支架蛋白mcipa基因装载到载体质粒中得到重组质粒，再将重组质粒转入宿主菌中，得到重组菌株，对重组菌株诱导表达、蛋白纯化后得到支架蛋白mcipa，支架蛋白mcipa具有2～9个内聚蛋白结构域和一个纤维素结构域；
5、步骤2、漆酶cota-docs的获取：
6、将核苷酸序列如seq id no.7所示的锚定蛋白基因docs同核苷酸序列如seq idno.3所示的野生型漆酶cota基因的c末端串联后装载到载体质粒中得到重组质粒，再将重组质粒转入宿主菌中，得到重组菌株，对重组菌株诱导表达、蛋白纯化后得到漆酶cota-docs；
7、步骤3、木聚糖酶xyn-docs的获取：
8、将核苷酸序列如seq id no.7所示的锚定蛋白基因docs同核苷酸序列如seq idno.5所示的野生型木聚糖酶xyn基因的c末端串联后装载到载体质粒中得到重组质粒，再将重组质粒转入宿主菌中，得到重组菌株，对重组菌株诱导表达、蛋白纯化后得到木聚糖酶xyn-docs；
9、步骤4、漆酶/木聚糖酶多酶复合体的体外组装
10、将支架蛋白mcipa、漆酶cota-docs和木聚糖酶xyn-docs混合，位于漆酶cota和木聚糖酶xyn c末端的锚定蛋白docs同支架蛋白mcipa上的内聚蛋白结构域之间通过疏水作用介导，在体外组装成漆酶/木聚糖酶多酶复合体。
11、作为优选方案，所述支架蛋白mcipa基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述支架蛋白mcipa具有3个内聚蛋白结构域和一个纤维素结构域。
12、作为优选方案，所述步骤1、步骤2和步骤3中，载体质粒均为pet-23a(+)，所述宿主菌均为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。
13、作为优选方案，所述步骤1中，诱导表达的具体过程为，从培养平板上挑取单菌落至培养基中活化，转接4～5％菌株量到培养基中，培养至od600达到0.6～0.8之间，加入iptg至终浓度为0.08～0.11mmol，再加入45～50mm硫酸铜溶液母液，至终浓度为0.20～0.25mm，25～28℃、100～120rpm诱导4～5h后，25～28℃恒温培养箱静置16～18h。
14、作为优选方案，所述步骤2和步骤3中，诱导表达的具体过程为，从培养平板上挑取单菌落至培养基中活化，再转接4～5％菌株量到培养基中，培养至od600达到0.6～0.8之间，加入iptg至终浓度为0.3～0.4mmol，18～20℃、140～150rpm，诱导12～14h。
15、作为优选方案，所述步骤4中，支架蛋白mcipa、漆酶cota-docs和木聚糖酶xyn-docs的蛋白摩尔量的比为1.5～2：1～1.5：1～1.5，组装的温度为30～35℃、ph为6.0～7.0、结合时间为2～3小时。
16、漆酶/木聚糖酶多酶复合体包括mcipa-docs-cota漆酶小体、mcipa-docs-xyn木聚糖酶小体和mcipa-docs-cota-xyn漆酶/木聚糖酶小体的混合物；所述支架蛋白mcipa的内聚蛋白结构域通过疏水作用介导漆酶形成mcipa-docs-cota漆酶小体；所述支架蛋白mcipa的内聚蛋白结构域通过疏水作用介导木聚糖酶形成mcipa-docs-xyn木聚糖酶小体；所述支架蛋白mcipa的内聚蛋白结构域通过疏水作用介导漆酶和木聚糖酶形成mcipa-docs-cota-xyn漆酶/木聚糖酶小体。
17、一种制备漆酶/木聚糖酶多酶复合体在纸浆漂白工艺的应用。
18、作为优选方案，所述纸浆漂白工艺的反应体系中纸浆的浓度为3～6％，ph6.5～7.0，温度为45～50℃，漆酶/木聚糖酶多酶复合体的漆酶酶活为1～2u，木聚糖酶的酶活为5～10u。
19、作为优选方案，所述纸浆漂白工艺包括酶处理过程和过氧化氢处理过程，
20、所述酶处理过程：酶反应体系中纸浆的浓度为3～6％，ph6.5～7.0，温度为45～50℃，漆酶/木聚糖酶多酶复合体的漆酶酶活浓度为1～2u，木聚糖酶的酶活浓度为5～10u，100～150rpm反应12～14h得到酶处理浆料；
21、所述过氧化氢处理过程：酶处理结束后向浆料中加入edta进行螯合，再经清洗烘干得到螯合纸浆，然后向螯合纸浆中加入h2o2 1～5％，mgso4 0.1～0.2％，naoh 1～2％，na2sio3 0.2～0.5％，65～70℃，ph10～11处理1～2h。
22、本发明的优点在于：本发明首先利用锚定蛋白docs与支架蛋白mcipa上的内聚蛋白结构域将木聚糖酶和漆酶固定在支架蛋白mcipa上，形成漆酶/木聚糖酶多酶复合体，漆酶/木聚糖酶多酶复合体包括mcipa-docs-cota漆酶小体、mcipa-docs-xyn木聚糖酶小体和mcipa-docs-cota-xyn漆酶/木聚糖酶小体的混合物，相比于游离的漆酶和游离的木聚糖酶，通过支架蛋白mcipa固定一方面可以拉近酶和底物的反应距离，另一方面，虽然游离的漆酶和游离的木聚糖酶在体系中可以发挥协同作用，但是两种游离的酶距离远，协同效应传递的效率太低，通过将两种酶固定在支架蛋白mcipa形成的mcipa-docs-cota-xyn漆酶/木聚糖酶小体，可以拉近两种酶的距离，提高协同效应传递的效率。
技术特征：
1.一种体外支架蛋白介导漆酶/木聚糖酶多酶复合体的制备方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的体外支架蛋白介导漆酶/木聚糖酶多酶复合体的制备方法，其特征在于，所述支架蛋白mcipa基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述支架蛋白mcipa具有3个内聚蛋白结构域和一个纤维素结构域。
3.根据权利要求2所述的体外支架蛋白介导漆酶/木聚糖酶多酶复合体的制备方法，其特征在于，所述步骤1、步骤2和步骤3中，载体质粒均为pet-23a(+)，所述宿主菌均为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。
4.根据权利要求3所述的体外支架蛋白介导漆酶/木聚糖酶多酶复合体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，诱导表达的具体过程为，从培养平板上挑取单菌落至培养基中活化，转接4～5％菌株量到培养基中，培养至od600达到0.6～0.8之间，加入iptg至终浓度为0.08～0.11mmol，再加入45～50mm硫酸铜溶液母液，至终浓度为0.20～0.25mm，25～28℃、100～120rpm诱导4～5h后，25～28℃恒温培养箱静置16～18h。
5.根据权利要求3所述的体外支架蛋白介导漆酶/木聚糖酶多酶复合体的制备方法，其特征在于，所述步骤2和步骤3中，诱导表达的具体过程为，从培养平板上挑取单菌落至培养基中活化，再转接4～5％菌株量到培养基中，培养至od600达到0.6～0.8之间，加入iptg至终浓度为0.3～0.4mmol，18～20℃、140～150rpm，诱导12～14h。
6.根据权利要求2所述的体外支架蛋白介导漆酶/木聚糖酶多酶复合体的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，支架蛋白mcipa、漆酶cota-docs和木聚糖酶xyn-docs的蛋白摩尔量的比为1.5～2：1～1.5：1～1.5，组装的温度为30～35℃、ph为6.0～7.0、结合时间为2～3小时。
7.一种如权利要求1～6任一项制备所得的漆酶/木聚糖酶多酶复合体，其特征在于，所述漆酶/木聚糖酶多酶复合体包括mcipa-docs-cota漆酶小体、mcipa-docs-xyn木聚糖酶小体和mcipa-docs-cota-xyn漆酶/木聚糖酶小体的混合物；所述mcipa-docs-cota漆酶小体是支架蛋白mcipa的内聚蛋白结构域通过疏水作用介导漆酶形成；所述mcipa-docs-xyn木聚糖酶小体是支架蛋白mcipa的内聚蛋白结构域通过疏水作用介导木聚糖酶形成；所述mcipa-docs-cota-xyn漆酶/木聚糖酶小体是支架蛋白mcipa的内聚蛋白结构域通过疏水作用同时介导漆酶和木聚糖酶形成。
8.一种如权利要求1～6任一项制备所得的漆酶/木聚糖酶多酶复合体在纸浆漂白工艺的应用。
9.根据权利要求8所述的漆酶/木聚糖酶多酶复合体在纸浆漂白工艺的应用，其特征在于，所述纸浆漂白工艺的反应体系中纸浆的浓度为3～6％，ph6.5～7.0，温度为45～50℃，漆酶/木聚糖酶多酶复合体的漆酶酶活浓度为1～2u，木聚糖酶的酶活浓度为5～10u。
10.根据权利要求9所述的漆酶/木聚糖酶多酶复合体在纸浆漂白工艺的应用，其特征在于，所述纸浆漂白工艺包括酶处理过程和过氧化氢处理过程：
技术总结
本发明涉及酶工程领域，尤其涉及一种体外支架蛋白介导漆酶/木聚糖酶多酶复合体及其制备方法和应用。首先利用锚定蛋白DocS与支架蛋白mCipA上的内聚蛋白结构域将木聚糖酶和漆酶固定在支架蛋白mCipA上，形成漆酶/木聚糖酶多酶复合体。将漆酶/木聚糖酶多酶复合体用于纸浆的生物漂白，可以有效降低硫酸盐杨木纸浆卡伯值，提高纸浆白度。
技术研发人员：江正兵,刘家书,李华南,程万里,宋慧婷,邓佳宝
受保护的技术使用者：湖北大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23