一种将聚唾液酸合成大肠杆菌经基因改造为产唾液酸乳糖的方法
本发明属于生物工程，特别是涉及一种将聚唾液酸合成大肠杆菌经基因改造为产唾液酸乳糖的方法。
背景技术：
1、聚唾液酸（polysialic acid, psa）是一种由多聚唾液酸分子通过α-2,8糖苷键连接形成的多糖，其在生物医学领域具有重要的应用价值，尤其在神经保护、抗炎、抗肿瘤等方面具有显著的效果。唾液酸（sialic acid, sa）及其衍生物是许多生物分子的重要组成部分，参与细胞识别、信号转导和免疫调节等多种生物过程。唾液酸乳糖（sialyllactose,sl）是一种含有唾液酸的低聚糖，在婴儿营养、免疫调节和肠道健康等方面具有重要的作用。
2、目前，唾液酸和唾液酸乳糖的工业生产主要依赖于动物来源，存在成本高、产量低和污染环境等问题。因此，利用微生物发酵生产唾液酸及其衍生物成为一种具有潜力的替代方法。大肠杆菌（escherichia coli）作为一种常见的工业微生物，具有生长快、遗传操作简便等优点，被广泛用于多种生物制品的生产。然而，野生型大肠杆菌中唾液酸及其衍生物的合成效率较低，难以满足工业化生产的需求。
3、近年来，通过基因工程技术对大肠杆菌进行改造，已经成为提高唾液酸及其衍生物生产效率的主要途径之一。例如，通过敲除或调控关键酶基因，可以显著提高大肠杆菌中唾液酸的合成效率。然而，现有的基因改造方法往往需要复杂的操作步骤和多次筛选，难以实现高效、稳定的基因编辑。
技术实现思路
1、本发明的主要目的在于提供一种将聚唾液酸合成大肠杆菌经基因改造为产唾液酸乳糖的方法，可以有效解决背景技术中的问题。
2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
3、一种将聚唾液酸合成大肠杆菌经基因改造为产唾液酸乳糖的方法，包括以下步骤：
4、a.敲除聚唾液酸合成大肠杆菌基因组中的neu5ac α-2,8-唾液酸转移酶(neus)基因，其n20序列为cattaattgaagaggggacaggg； b. 将唾液酸转移酶基因导入基因编辑后的聚唾液酸合成大肠杆菌。
5、进一步的，其中所述敲除neus基因的方法包括以下步骤：
6、a.设计引物扩增带有neus目标基因sgrna序列的序列，所述引物为sgrna-f: cattaattgaagaggggacaggggttttagagctagaaatagcaagtt和sgrna-r: ccctgtcccctcttcaattaatgactagtattatacctaggactgagc；
7、b.将扩增产物经dpni内切酶消化并纯化后转化e.coli dh5a，得到环化的ptargetf-sgrna质粒；
8、c.通过融合pcr制备重组同源臂，设计并合成上下游片段扩增引物up-f:tatggcttaggtgagcgcgtc，up-r: gctagtttaaagaagttgaggaacatctccctctttgcacga，down-f: tcgtgcaaagagggagatgttcctcaacttctttaaactagc，down-r: acattgaacgcttcgatttga，以聚唾液酸合成大肠杆菌基因组dna为模板，分别得到上下游同源臂片段；
9、d.提取pcas质粒，并将其转化导入聚唾液酸合成大肠杆菌菌株；
10、e.制作电转化感受态细胞，将含有pcas质粒的菌株培养至od600=0.2，加入1%(v/v)1 m l-阿拉伯糖溶液诱导，继续培养至od600=0.60~0.65，低温收集菌体并制作电转感受态；
11、f.将ptargetf-sgrna和融合片段dna按照1:4(摩尔比)的比例加入感受态细胞中进行电转化，涂布含有氨苄青霉素和卡那霉素的平板固体培养基，提基因组测序验证获得阳性敲除子。
12、进一步的，其中进一步消除ptargetf-sgrna质粒，包括以下步骤：
13、a.确定neus基因敲除成功后，划线培养并挑取单菌落重新接种，添加iptg培养12小时，后涂布抗生素平板对比培养，获得ptargetf-sgrna被消除的菌株。
14、进一步的，其中进一步消除pcas质粒，包括以下步骤：
15、a.确定ptargetf-sgrna质粒消除成功后，挑取单菌落，于42℃培养过夜，涂无抗性平板并挑单菌落，验证后获得pcas消除的菌株。
16、进一步的，其中所述唾液酸转移酶基因导入基因编辑后的聚唾液酸合成大肠杆菌的方法包括：
17、a.根据α-2,3-唾液酸转移酶编码基因序列进行全基因合成，并连接到ptrc99a载体上，得到重组表达质粒ptrc99a-3sl；
18、b.将经neus基因敲除的聚唾液酸合成大肠杆菌制备化学感受态，将重组表达质粒ptrc99a-3sl转化涂布带有卡那霉素抗生素的平板固体培养基，过夜培养挑取单菌落进行验证。
19、进一步的，其中所述重组大肠杆菌在lb培养基中过夜培养后，以5%(v/v)比例接种至含有甘油培养基的发酵罐中，接种后分别添加iptg和乳糖至终浓度0.5 mm和15 g/l，30℃培养，并保持溶氧量不低于20%。
20、进一步的，其中培养时间为40小时，经高效液相色谱检测得到3’-唾液酸乳糖。
21、进一步的，其中培养时间为72小时，经高效液相色谱检测得到3’-唾液酸乳糖。
22、进一步的，其中在基因敲除成功后，进一步消除ptargetf-sgrna质粒和pcas质粒，以获得纯净的基因编辑菌株。
23、进一步的，其中所述消除ptargetf-sgrna质粒和pcas质粒的方法包括：
24、a.确定neus基因敲除成功后，通过添加iptg和在42℃培养，分别消除ptargetf-sgrna质粒和pcas质粒。
25、与现有技术相比，本发明具有如下改进点：
26、高效基因敲除和插入技术：现有技术中，通常需要多次筛选和复杂的操作步骤来敲除目标基因和插入新的基因。本发明采用了高效的crispr-cas9基因编辑技术，通过设计特异性sgrna和同源重组片段，能够快速、准确地敲除聚唾液酸合成大肠杆菌中的neus基因，并插入唾液酸转移酶基因，显著提高了基因编辑效率和稳定性。
27、·聚唾液酸向唾液酸乳糖的转化：传统的聚唾液酸合成途径主要集中在神经保护和抗炎等应用，而本发明通过基因改造，将聚唾液酸合成大肠杆菌转化为能够生产唾液酸乳糖的工程菌株，实现了从聚唾液酸到唾液酸乳糖的高效转化，拓宽了其在生物医药和功能性食品领域的应用范围。
28、·高效发酵生产工艺：本发明优化了唾液酸乳糖的发酵生产工艺，通过在发酵过程中添加适量的iptg和乳糖，显著提高了唾液酸乳糖的产量。与传统的生产方法相比，本发明的发酵时间更短，生产效率更高，具有更好的工业应用前景。
29、·改进的质粒消除方法：在基因编辑完成后，本发明提供了一种高效的质粒消除方法，通过添加iptg和在高温条件下培养，能够快速、有效地消除ptargetf-sgrna和pcas质粒，获得纯净的基因编辑菌株，避免了质粒对菌株稳定性和生产性能的影响。
30、·减少污染和降低成本：现有技术中，唾液酸和唾液酸乳糖的生产主要依赖于动物来源，存在成本高、产量低和污染环境等问题。本发明通过微生物发酵生产，不仅降低了生产成本，提高了产量，还减少了对环境的污染，具有显著的环保优势。
技术特征：
1.一种将聚唾液酸合成大肠杆菌经基因改造为产唾液酸乳糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述敲除neus基因的方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：其中进一步消除ptargetf-sgrna质粒，包括以下步骤：
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：其中进一步消除pcas质粒，包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述唾液酸转移酶基因导入基因编辑后的聚唾液酸合成大肠杆菌的方法包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：其中所述重组大肠杆菌在lb培养基中过夜培养后，以5%(v/v)比例接种至含有甘油培养基的发酵罐中，接种后分别添加iptg和乳糖至终浓度0.5 mm和15 g/l，30℃培养，并保持溶氧量不低于20%。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：其中培养时间为40小时，经高效液相色谱检测得到3’-唾液酸乳糖。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：其中培养时间为72小时，经高效液相色谱检测得到3’-唾液酸乳糖。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中在基因敲除成功后，进一步消除ptargetf-sgrna质粒和pcas质粒，以获得纯净的基因编辑菌株。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：其中所述消除ptargetf-sgrna质粒和pcas质粒的方法包括：
技术总结
本发明公开了一种将聚唾液酸合成大肠杆菌经基因改造为产唾液酸乳糖的方法，属于生物工程技术领域。方法包括：敲除大肠杆菌中的Neu5Ac α‑2,8‑唾液酸转移酶(NeuS)基因，导入唾液酸转移酶基因。通过设计引物扩增NeuS基因的sgRNA序列，得到pTargetF‑sgRNA质粒；利用融合PCR制备重组同源臂片段，转化大肠杆菌并制作感受态细胞，进行电转化获得阳性敲除子。通过添加IPTG和高温培养，消除pTargetF‑sgRNA质粒和pCAS质粒，得到纯净的基因编辑菌株。本方法提高了基因编辑效率和稳定性，实现了高效生产唾液酸乳糖，为其工业化生产提供了新途径。
技术研发人员：朱德强,李昊,甄庚尧,常化难,刘新利,李宁,宁占国,曹建帮,高学秀,魏田慧,陈又铭,周焕霞
受保护的技术使用者：齐鲁工业大学（山东省科学院）
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23