一种调控玉米叶夹角和株高的ZmHLH2基因及其应用
本发明涉及植物基因工程及分子生物学领域，具体涉及调控玉米叶夹角和株高的zmhlh2基因及其应用。
背景技术：
1、玉米是我国重要的粮食作物，也是饲料和生物能源的重要来源。由于人口的持续增长和随之而来的经济扩张，对玉米的需求也在不断增加。如何提高玉米单位面积粮食产量是一个十分重要的问题。越来越多的证据表明，增加种植密度是提高作物单位面积产量的有效策略。然而，玉米种植密度增加会导致红光(r):远红光(fr)的比大幅降低，引起玉米的避阴综合征(shade avoidance responses,sar)。这种信号可以作为邻居竞争即将到来的警告，并触发玉米植株的一些生理变化，导致一系列不良后果，包括植株分枝减少、茎伸长、易倒伏、叶耳增高、早花和衰老、光效利用率降低、籽粒灌浆减少以及主动抑制对病原体和食草动物的防御反应等，最终导致玉米生物量和产量降低(martinez-garcia androdriguez-concepcion,2023；wang et al.,2016)。决定大田玉米最佳种植密度的一个关键因素是玉米对遮荫的响应。因此，为了最大限度地提高作物的单产，迫切需要培育具有减轻sar有害影响性状的新品种。
2、叶夹角和株高(la)是植物垂直茎与叶片中脉之间的角度，是调控密植植物结构的关键农艺性状。直立叶片可以增强密植冠层的光感、光合效率、通风和抗逆性，从而实现密植，提高谷类作物的产量。例如，水稻突变体osdwarf4在密集种植下叶片直立，生物量和产量高于野生型(sakamotoet al.,2006)。在玉米中，两个经典基因，zmlg1(liguleless1)和zmlg2(liguleless2)，在改变叶片角度的舌状区域形成中起关键作用(morenoetal.,1997；walshetal.,1998)。在lg1和lg2突变体中，由于没有形成舌叶和耳廓，导致植物叶片表现出过度直立，叶夹角和株高变小(morenoetal,1997；walshetal.,1998；mantilla-perezandsalasfernandez,2017)。将lg2突变等位基因渗入玉米自交系中可提高玉米籽粒产量(pendletonetal.，1968；lambertandjohnson,1978)。在最近的研究中，证明zmravl1直接激活zmbrd1表达，导致br水平升高和叶夹角和株高增大(tianet al.,2019)。zmlg1可以直接结合zmravl1的上游调控序列。此外，zmdrl1(一种具有c2c2锌指dna结合域的yabby蛋白，la的负调节因子)可以与zmlg1发生物理相互作用，抑制zmlg1对zmravl1的转录激活，从而减小玉米叶夹角和株高(strableetal.,2017)。在过去的30年里，基于遗传、分子和转录组学分析在玉米中已经鉴定了一些与叶夹角和株高形成有关的基因，然而其调控叶夹角和株高的分子机制有待进一步研究(caoetal.,2022)。本研究涉及的基因zmhlh2是一个由261个氨基酸组成，具有hlh保守功能结构域的非典型bhlh转录因子，其生物学功能目前在玉米中尚未报道。本发明研究了该基因调控玉米叶夹角和株高的分子生物学功能，并为培育耐密株型的优良高产玉米新品种提供了基因资源。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种调控玉米叶夹角和株高的zmhlh2基因及其应用。
2、本发明采用以下技术方案来实现：
3、本发明的第一目的在于提供一种调控玉米叶夹角和株高的zmhlh2基因，所述zmhlh2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、作为对本发明的进一步改进，所述zmhlh2基因的编码蛋白具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。
5、本发明的第二目的在于提供一种上述zmhlh2基因在调控玉米叶夹角和株高中的应用。
6、作为对本发明的进一步改进，所述zmhlh2基因表达调控玉米叶夹角和株高变小。
7、本发明的第三目的在于提供一种敲除载体，所述敲除载体为包含用于敲除上述zmhlh2基因的sgrna靶位点序列的crispr敲除载体。
8、作为对本发明的进一步改进，所述sgrna靶位点序列包括如seq id no.4和seq idno.5所示的核苷酸序列：
9、seq id no.4：targel1：5'-tgtcgtcggggcgacgtggc-3'；
10、seq id no.5：targel2：5'-ggcggcgtgaggactcaggg-3'。。
11、本发明的第四目的在于提供一种遗传工程菌，所述宿主细胞为含有上述敲除载体的农杆菌。
12、本发明的第五目的在于提供一种培育小叶夹角且矮株高玉米的方法，对玉米zmhlh2基因进行敲除突变，获得叶夹角变小和株高变矮的玉米植株。
13、作为对本发明的进一步改进，包括以下步骤：
14、(1)构建含有玉米zmhlh2基因sgrna靶位点序列的重组基因crispr/cas9敲除载体。
15、(2)将crispr/cas9敲除载体转入农杆菌感受态细胞中，利用农杆菌介导侵染玉米愈伤组织，培养获得玉米苗，测序正确后培养繁种获得小叶夹角且矮株高的玉米植株。
16、本发明通过crispr/cas9基因敲除技术，在kn5585自交系中敲除zmhlh2基因，获得了zmhlh2功能缺失的突变体，通过测序分析检测到两种突变类型，第一种突变体中缺失60个碱基，导致zmhlh2编码的蛋白序列发生大片段缺失，第二种突变体中缺失了59个碱基，导致zmhlh2编码的蛋白表达提前终止，两种敲除突变类型均导致玉米叶夹角减小。
17、本发明的有益效果是：本发明所提供的zmhlh2基因能够调控玉米叶夹角和株高，对玉米耐密育种具有重要意义；叶片直立的玉米品种具有较好的冠层结构以及较高的光能利用率，从而能获得较高的产量。
技术特征：
1.一种调控玉米叶夹角和株高的zmhlh2基因，其特征在于，所述zmhlh2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.权利要求1所述的调控玉米叶夹角和株高的zmhlh2基因，其特征在于，所述zmhlh2基因的编码蛋白具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。
3.一种权利要求1-2任一所述的zmhlh2基因在调控玉米叶夹角和株高中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述zmhlh2基因敲除后调控玉米叶夹角变小、株高变矮。
5.一种敲除载体，其特征在于，所述敲除载体为包含用于敲除权利要求1-2任一所述zmhlh2基因的sgrna靶位点序列的crispr敲除载体。
6.根据权利要求5所述的敲除突变体载体，其特征在于，所述sgrna靶位点序列包括如seq id no.4和seq id no.5所示的核苷酸序列：
7.一种遗传工程菌，其特征在于，所述遗传工程菌为含有如权利要求5-6任一所述敲除载体的农杆菌。
8.一种培育小叶夹角且矮株高玉米的方法，其特征在于，对玉米zmhlh2基因进行敲除突变，获得叶夹角变小和株高变矮的zmhlh2基因突变体玉米植株。
9.根据权利要求8所述的培育小叶夹角且矮株高玉米的方法，其特征在于，包括以下步骤：
技术总结
本发明公开了一种调控玉米叶夹角和株高的ZmHLH2基因及其应用，属于植物基因工程技术领域，所述ZmHLH2基因的基因组序列如SEQ ID NO:1所示，CDS序列如SEQ ID NO:3所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明利用CRISPR/Cas9技术敲除玉米ZmHLH2基因，突变体的叶夹角和株高和株高明显减小，其对玉米耐密育种具有重要意义。直立的叶片能够使密集种植的作物减少相互遮蔽而捕获更多的光，从而有助于提高作物单位面积的产量。
技术研发人员：吴青青,何影,吴家帅
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23