一种多聚磷酸激酶突变体及其在催化合成谷胱甘肽中的应用

(一)本发明属于基因工程和酶催化，具体涉及一种多聚磷酸激酶突变体，及其以聚磷酸盐为底物将adp转化atp在谷胱甘肽合成中的应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、谷胱甘肽(glutathione，gsh)是一种重要的三肽化合物，由l-半胱氨酸、l-谷氨酸和甘氨酸三种氨基酸通过肽键连接而成。作为细胞内含量最丰富的硫醇类化合物之一，gsh具有抗氧化、免疫调节、调节神经递质受体活性等多种重要的生理功能，在药物、食品、化妆品和保健品领域应用广泛。

2、目前，谷胱甘肽双功能酶一步酶法合成是工业合成gsh的理想途径，具有原材料易获取、高度专一、高原子经济性和环境友好等优势。该工艺通过谷胱甘肽双功能酶催化l-半胱氨酸、l-谷氨酸和甘氨酸实现gsh的合成，此过程高度依赖持续的三磷酸腺苷(atp)提供能量。然而，atp的高昂成本以及副产品腺苷二磷酸(adp)与腺苷一磷酸(amp)难以有效分离的问题成为了限制其在工业中的应用。因此，开发经济高效的atp合成及循环系统具有重要意义。

3、多聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ppk)是一类以多聚磷酸盐作为磷酸供体催化adp或amp生成atp的酶，是用于atp再生的重要酶催化剂。目前，基于蛋白质工程改造多聚磷酸激酶催化活性屡见报道。如gao等利用易错pcr技术改造来源于哈氏噬纤维菌cytophaga hutchinsonii的多聚磷酸激酶，获得酶活性提高4.3倍的双突变体；高惠等通过计算机辅助技术理性改造来源于c.hutchinsonii的多聚磷酸激酶(chppk)，重塑其双底物通道后获得酶活提高3.3倍的突变体。cao等通过理性设计来源于sinorhizobium meliloti的多聚磷酸激酶，大幅提高了其催化短链多聚磷酸合成atp的催化活性。由此可见，基于理性/非理性设计是提升多聚磷酸激酶催化活性的重要手段。

4、本发明人前期通过蛋白质工程对cytophaga hutchinsonii来源的多聚磷酸激酶进行改造，获得了活力大幅提升的ppk突变体，并利用其构成的atp再生体系辅助谷胱甘肽合成(cn202310871912.5)。然而，现有的多聚磷酸激酶的催化活性仍然较低，难以工业需求。本发明通过半理性设计方法，构建了可用于谷胱甘肽合成的高效多聚磷酸激酶突变体，为酶法合成谷胱甘肽奠定基础。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种多聚磷酸激酶突变体及其在催化合成谷胱甘肽中的应用，通过蛋白质工程技术，采用随机突变和定点突变等方法对cytophaga hutchinsonii来源多聚磷酸激酶突变体chppkm0进行进一步改造，提高其催化合成atp的活力，达到工业化生产的要求。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种多聚磷酸激酶突变体，所述突变体是将seq id no:2所示氨基酸序列第22位进行突变获得的。

4、进一步，优选所述多聚磷酸激酶突变体是将seq id no:2所示氨基酸序列第22位的丝氨酸替换为丙氨酸获得的，记为多聚磷酸激酶突变体chppkm1，氨基酸序列如seq idno.4所示，核苷酸序列如seq id no:3所示。

5、本发明还涉及所述多聚磷酸激酶突变体的编码基因，编码基因构建的重组载体，以及重组载体转化宿主菌构建的重组基因工程菌，其中重组载体以pet-28a为基础。所述宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞，作为优选，宿主细胞为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。

6、本发明还提供一种所述多聚磷酸激酶突变体在构建atp再生体系中的应用，所述应用是使用多聚磷酸激酶突变体和多聚磷酸盐(polyp)替换部分atp(腺嘌呤核苷三磷酸)辅助谷胱甘肽合成，所述多聚磷酸突变体以多聚磷酸激酶突变体基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体制备的粗酶液或纯酶的形式作用。

7、本发明还提供了所述多聚磷酸激酶突变体或其表达微生物在合成谷胱甘肽中的应用，所述应用的方法为：以多聚磷酸激酶突变体重组基因工程菌经诱导表达后获得的湿菌体或者经超声破碎后的细胞破碎液为催化剂，以六偏磷酸钠为底物，加入atp、mg2+、谷胱甘肽双功能合成酶(gshf)、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸和ph 7.0的缓冲液构成反应体系，在35℃反应完全，得到产物谷胱甘肽。其中mg2+是gshf的激活因子，六偏磷酸钠是多聚磷酸激酶突变体的底物，atp为谷胱甘肽合成的提供能量，mg2+是mgso4或mgcl2。

8、所述反应体系中，湿菌体以全细胞计为1-5g/l(优选2.5g/l)，细胞破碎液以破碎前全细胞计为1-5g/l(优选2.5g/l)；谷胱甘肽双功能合成酶加入量5-20g/l(优选10g/l)，六偏磷酸钠加入量20-70mm(优选30-50mm)，atp加入量1-20mm(优选2mm)，mg2+加入量20-70mm(优选60mm)，半胱氨酸30-90mm(优选60mm)，甘氨酸60-100mm(优选80mm)、谷氨酸60-100mm(优选80mm)。

9、所述催化剂按如下方法制备：将多聚磷酸激酶突变体重组基因工程菌接种到含有50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，37℃，180rpm培养过夜，随后以体积浓度2％的接种量转接到新鲜的含有50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，37℃，180rpm培养至菌体浓度od600为0.6～0.8，随后向培养基中加入终浓度为0.1mm的iptg，于28℃，180rpm诱导培养12h；将发酵液于4℃下8000rpm离心10min，收集湿菌体；湿菌体按10g/l的量，用50mm的tris-hcl缓冲液(ph＝7.5)重悬，超声破碎，破碎功率为200w，每工作1s，歇2s，总工作时间10min，破碎后，得到细胞破碎液；lb液体培养基组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，溶剂为水，ph 7.0。

10、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

11、本发明提供了cytophaga hutchinsonii来源的多聚磷酸激酶突变体，相较于改造前催化活性提升了2倍，其构成的atp再生体系可以用于谷胱甘肽合成反应，在2h内产生超过19g的谷胱甘肽，产物生成率近90％。

技术特征：

1.一种多聚磷酸激酶突变体，其特征在于，所述突变体是将seq id no:2所示氨基酸序列第22位进行突变获得的。

2.如权利要求1所述的多聚磷酸激酶突变体，其特征在于，所述多聚磷酸激酶突变体是将seq id no:2所示氨基酸序列第22位的丝氨酸替换为丙氨酸获得的。

3.一种含权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体编码基因的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体在构建atp再生体系中的应用。

5.一种权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体或其表达微生物在合成谷胱甘肽中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：以多聚磷酸激酶突变体重组基因工程菌经诱导表达后获得的湿菌体或者经超声破碎后的细胞破碎液为催化剂，以六偏磷酸钠为底物，加入atp、mg2+、谷胱甘肽双功能合成酶、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸和ph7.0的缓冲液构成反应体系，在35℃反应完全，得到产物谷胱甘肽。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，湿菌体以全细胞计为1-5g/l，细胞破碎液以破碎前全细胞计为1-5g/l；谷胱甘肽双功能合成酶加入量5-20g/l，六偏磷酸钠加入量20-70mm，atp加入量1-20mm，mg2+加入量20-70mm，半胱氨酸30-90mm，甘氨酸60-100mm、谷氨酸60-100mm。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述催化剂按如下方法制备：将多聚磷酸激酶突变体重组基因工程菌接种到含有50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，37℃，180rpm培养过夜，随后以体积浓度2％的接种量转接到新鲜的含有50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，37℃，180rpm培养至菌体浓度od600为0.6～0.8，随后向培养基中加入终浓度为0.1mm的iptg，于28℃，180rpm诱导培养12h；将发酵液于4℃下8000rpm离心10min，收集湿菌体；湿菌体按10g/l的量，用50mm、ph＝7.5的tris-hcl缓冲液重悬，超声破碎，破碎功率为200w，每工作1s，歇2s，总工作时间10min，破碎后，得到细胞破碎液。

技术总结
本发明公开了一种多聚磷酸激酶突变体及其在催化合成谷胱甘肽中的应用，所述突变体是将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列第22位进行突变获得的。本发明提供了Cytophaga hutchinsonii来源的多聚磷酸激酶突变体，相较于改造前催化活性提升了2倍，其构成的ATP再生体系可以用于谷胱甘肽合成反应，在2h内产生超过19g的谷胱甘肽，产物生成率近90％。

技术研发人员：郑仁朝,张文玉,吴哲明,郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23