一种激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法与流程

本发明属于蛋白质组学检测，尤其涉及一种激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法。

背景技术：

1、近年来，随着激光显微切割技术和高分辨率液相色谱串联质谱技术的不断进步，使得蛋白质组学检测技术逐渐进入到微量样品检测和空间蛋白质组检测时代。组织样品的空间蛋白质组检测分析通常会对石蜡包埋he染色的组织切片进行显微镜观察，在显微镜下确定感兴趣的区域，然后利用激光捕获技术精确获取感兴趣区域的样品。这样的采样方式获取的样品的面积一般在0.5mm2以下，组织切片的厚度为5-10μm，这样的微量样品对样品制备过程中的蛋白提取、酶切等处理方法具有非常大的挑战性。

2、目前制备方法中采用的样品裂解液的蛋白变性剂无法从这样微量的样品中有效提取出蛋白，此外，现有方法中还存在操作体积过大，增加了被提取蛋白非特异粘附到离心管管壁的概率，容易造成提取蛋白的明显损失，完全不适合对微量样本的处理，因此有必要开发一种适用于石蜡包埋组织切片激光显微切割微量样品蛋白提取和酶切的方法。

技术实现思路

1、本发明实施例的目的在于提供一种激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

2、本发明实施例是这样实现的，一种激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，包括以下步骤：

3、（1）样品的转移与清洗：将显微切割样品转移到低蛋白吸附的离心管中，向留有样品的离心管中加入无水乙醇，吸除上清，负压抽干仪抽干残余液体；

4、（2）样品的复水与酶切：向样品离心管中加入裂解液，水浴加热，中间进行一次离心，并进行吹打混匀，使样品复水裂解，水浴结束后取出样品离心管进行离心，离心后进行吹打混匀，室温静置，使样品进一步充分复水和裂解；向样品离心管中加入dtt，加热，再自然冷却到室温并吹打混匀；向样品离心管中加入胰酶，吹打混匀，水浴过夜，第二天补加胰酶，继续酶切处理；

5、（3）样品脱盐：向酶切后的样品加入质谱级甲酸并混匀，离心后取上清；将c18脱盐柱放到离心适配器上，并向脱盐柱中加入质谱级乙腈，离心后弃离心液，重复操作；向c18脱盐柱加入甲酸，离心后弃离心液，重复操作；将样品的上清加入脱盐柱中，离心后弃离心液；用甲酸清洗上样后的脱盐柱，离心后弃离心液，重复操作；将脱盐柱用洗脱液洗脱样品、离心操作，吸除上清，抽干残留液体。

6、优选地，步骤（1）中，所述将显微切割样品转移到低蛋白吸附的离心管中的步骤，具体为：用无水乙醇吹打吸取粘附在硅胶表面的显微切割样品并转移到低蛋白吸附的离心管中，重复10次将硅胶表面的切割样品取干净，再短暂离心使管中的显微切割样品汇集到管底，吸除上清。

7、优选地，步骤（1）中，所述负压抽干仪抽干残余液体时，温度为45℃，速率为1500rpm/min，时间为20min。

8、优选地，步骤（2）中，所述水浴加热为65℃水浴24；所述水浴过夜为37℃水浴过夜。

9、优选地，步骤（2）中，所述向样品离心管中加入dtt，加热的步骤，加热具体为100℃加热1h。

10、优选地，步骤（3）中，所述洗脱液为乙腈和甲酸的混合物。

11、优选地，步骤（3）中，所述向酶切后的样品加入质谱级甲酸并混匀，离心后取上清的步骤，离心的参数为16000g离心10min；所述向脱盐柱中加入质谱级乙腈，离心后弃离心液的步骤，离心的参数为4000g离心3min；所述向c18脱盐柱加入甲酸，离心后弃离心液的步骤，离心的参数为5000g离心3min；所述将样品的上清加入脱盐柱中，离心后弃离心液的步骤，离心的参数为5000g离心3min；所述用甲酸清洗上样后的脱盐柱，离心后弃离心液的步骤，离心的参数为4000g离心3min；所述将脱盐柱用洗脱液洗脱样品、离心操作的步骤，离心的参数为5000g离心3min。

12、优选地，步骤（3）中，所述抽干残留液体的步骤采用负压抽干仪，温度为45℃，速率为1500rpm/min，时间为2h。

13、本发明实施例提供的一种激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，与现有技术相比蛋白提取效率明显提高，样品制备的体积从300微升缩小到30微升，以激光显微切割大鼠肾小球样品为例，利用现有技术提取中的蛋白并进行酶切后通过液相色谱串联质谱检测检测，每个样品的蛋白鉴定数在1000左右，而用本方法蛋白鉴定数可达2000-3000。

技术特征：

1.一种激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述将显微切割样品转移到低蛋白吸附的离心管中的步骤，具体为：用无水乙醇吹打吸取粘附在硅胶表面的显微切割样品并转移到低蛋白吸附的离心管中，重复10次将硅胶表面的切割样品取干净，再短暂离心使管中的显微切割样品汇集到管底，吸除上清。

3.根据权利要求1所述的激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述负压抽干仪抽干残余液体时，温度为45℃，速率为1500rpm/min，时间为20min。

4.根据权利要求1所述的激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述水浴加热为65℃水浴24；所述水浴过夜为37℃水浴过夜。

5.根据权利要求1所述的激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述向样品离心管中加入dtt，加热的步骤，加热具体为100℃加热1h。

6.根据权利要求1所述的激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述洗脱液为乙腈和甲酸的混合物。

7.根据权利要求1所述的激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述向酶切后的样品加入质谱级甲酸并混匀，离心后取上清的步骤，离心的参数为16000g离心10min；所述向脱盐柱中加入质谱级乙腈，离心后弃离心液的步骤，离心的参数为4000g离心3min；所述向c18脱盐柱加入甲酸，离心后弃离心液的步骤，离心的参数为5000g离心3min；所述将样品的上清加入脱盐柱中，离心后弃离心液的步骤，离心的参数为5000g离心3min；所述用甲酸清洗上样后的脱盐柱，离心后弃离心液的步骤，离心的参数为4000g离心3min；所述将脱盐柱用洗脱液洗脱样品、离心操作的步骤，离心的参数为5000g离心3min。

8.根据权利要求1所述的激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述抽干残留液体的步骤采用负压抽干仪，温度为45℃，速率为1500rpm/min，时间为2h。

技术总结
本发明适用于蛋白质组学检测技术领域，提供了一种激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，包括以下步骤：样品的转移与清洗；样品的复水与酶切；样品脱盐。本发明实施例提供的一种激光显微切割样品的蛋白质组学制备方法，与现有技术相比蛋白提取效率明显提高，样品制备的体积从300微升缩小到30微升，以激光显微切割大鼠肾小球样品为例，利用现有技术提取中的蛋白并进行酶切后通过液相色谱串联质谱检测检测，每个样品的蛋白鉴定数在1000左右，而用本方法蛋白鉴定数可达2000‑3000。

技术研发人员：冷文川
受保护的技术使用者：北京正达康健生物医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23