一种用于检测泌尿系感染中病原菌的检测试剂盒

本发明涉及一种用于检测泌尿系感染中病原菌的检测试剂盒，属于分子生物学。

背景技术：

1、泌尿系感染(urinary tract infection,uti)是指一系列由微生物引发的泌尿系器官的疾病，涉及肾脏、输尿管、膀胱、尿道等器官，是人类最常见的感染类型之一，好发于女性，超过60％的女性一生中至少发生一次泌尿系感染，其中20～30％会在6个月内复发。泌尿系感染的常见症状为尿急、尿频、尿失禁、排尿困难、菌尿、脓尿、夜尿症等。下尿路感染常有排尿时疼痛，尿频、耻骨上区疼痛或肉眼血尿等表现。上尿路感染常有发热、腰痛、寒战、呕吐、肋脊角压痛、恶心等表现。目前，已经有许多技术可以检测泌尿系感染，例如尿常规检查(urinalysis)、尿培养、分子生物学方法和药敏试验等。尿常规是检测泌尿系感染最常见的手段，但是，尿常规检查中的白细胞、亚硝酸盐等指标仅对泌尿系感染有提示作用，无法确定病原菌种类。泌尿系感染的实验室诊断则主要依靠尿培养及后续的分子生物学方法和药敏试验，然而，尿培养耗时长，通常3～4天出结果，在此之前已启动经验性抗菌治疗。

2、泌尿系感染最主要的病原菌是尿路致病性大肠埃希菌(占比约为50～80％)，除此以外，肠球菌属、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌等病原菌也会引起泌尿系感染。由于引起泌尿系感染的不同种类病原菌(包括肠杆菌科细菌、非发酵菌、肠球菌、真菌等)的经验性抗菌药物选择方案明显不同，门诊、急诊患者如果在就诊时能快速确定泌尿系感染病原菌的具体种类，则初始经验用药会更加精准，可缩短患者抗生素使用周期，减少抗生素不合理使用，延缓细菌耐药，具有巨大的经济和社会意义。现阶段，尚无商品化的针对泌尿系感染常见病原菌的多重、快速筛查试剂盒。尽管基于多重荧光pcr和二代测序(nextgeneration sequencing,ngs)技术可以实现针对泌尿系感染常见病原菌的检测，但是，这两种方法均成本较高且检测门槛较高，需要昂贵的仪器、专门的实验室场地、有pcr检测资质的操作人员，并且，这两种方法的检测步骤均十分繁琐，严重限制了其在快速检测领域的发展和在基层医院实验室的应用。

3、“重组酶介导的等温核酸扩增技术”(recombinase aidedamplification,raa)是在等温条件下的核酸快速扩增技术，它使用重组酶、单链结合蛋白和dna结合酶代替了传统pcr的热循环解链过程，实现了37～39℃恒温下的核酸快速扩增，有望取代传统的热循环pcr技术。“重组酶介导的等温核酸扩增技术”具有耗时短、扩增效率高、检出限低的优点，在30分钟内即可实现扩增产物指数级扩增，并且，该方法不需要昂贵的仪器设备和专门的pcr实验室，同时，该方法操作简便，实现了加样后一管便携式检测，无需再次开盖避免了扩增产物污染，适用于基层医院实验室快速监测的场景。若能基于“重组酶介导的等温核酸扩增技术”开发针对泌尿系感染常见病原菌的检测技术有望实现克服多重荧光pcr和二代测序技术成本较高且检测门槛较高的缺陷，实现针对泌尿系感染常见病原菌的多重、快速筛查。然而，当前，基于“重组酶介导的等温核酸扩增技术”的针对泌尿系感染常见病原菌的检测技术尚未见报道。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种用于检测泌尿系感染中病原菌的引物探针组，所述引物探针组包括靶向大肠埃希菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向肺炎克雷伯菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向铜绿假单胞菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向鲍曼不动杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向阴沟肠杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向奇异变形杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向屎肠球菌特异性靶标基因的引物探针组和/或靶向粪肠球菌特异性靶标基因的引物探针组。

2、在本发明的一种实施方式中，所述大肠埃希菌特异性靶标基因包括大肠埃希菌chua基因的核心片段；所述肺炎克雷伯菌特异性靶标基因包括肺炎克雷伯菌rcsa基因的核心片段；所述铜绿假单胞菌特异性靶标基因包括铜绿假单胞菌oprl基因的核心片段；所述鲍曼不动杆菌特异性靶标基因包括鲍曼不动杆菌pgad基因的核心片段；所述阴沟肠杆菌特异性靶标基因包括阴沟肠杆菌ompx基因的核心片段；所述奇异变形杆菌特异性靶标基因包括奇异变形杆菌urer基因的核心片段；所述屎肠球菌特异性靶标基因包括屎肠球菌glup基因的核心片段；所述粪肠球菌特异性靶标基因包括粪肠球菌rpoa基因的核心片段。

3、在本发明的一种实施方式中，所述大肠埃希菌chua基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述肺炎克雷伯菌rcsa基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述铜绿假单胞菌oprl基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述鲍曼不动杆菌pgad基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述阴沟肠杆菌ompx基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述奇异变形杆菌urer基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述屎肠球菌glup基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述粪肠球菌rpoa基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.8所示。

4、在本发明的一种实施方式中，所述靶向大肠埃希菌chua基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.9～seq id no.11任一项所示的上游引物chua-f、核苷酸序列如seqid no.12～seq id no.14所示的下游引物chua-r和核苷酸序列如seq id no.15所示的探针chua-p；

5、所述靶向肺炎克雷伯菌rcsa基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.16～seq id no.18任一项所示的上游引物rcsa-f、核苷酸序列如seq id no.19～seq idno.21所示的下游引物rcsa-r和核苷酸序列如seq id no.22所示的探针rcsa-p；

6、所述靶向铜绿假单胞菌oprl基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.23～seq id no.24任一项所示的上游引物oprl-f、核苷酸序列如seq id no.25～seq idno.26所示的下游引物oprl-r和核苷酸序列如seq id no.27所示的探针oprl-p；

7、所述靶向鲍曼不动杆菌pgad基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.28～seq id no.29任一项所示的上游引物pgad-f、核苷酸序列如seq id no.30～seq idno.31所示的下游引物pgad-r和核苷酸序列如seq id no.32所示的探针pgad-p；

8、所述靶向阴沟肠杆菌ompx基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.33～seq id no.35任一项所示的上游引物ompx-f、核苷酸序列如seq id no.36～seq id no.38所示的下游引物ompx-r和核苷酸序列如seq id no.39所示的探针ompx-p；

9、所述靶向奇异变形杆菌urer基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.40～seq id no.42任一项所示的上游引物urer-f、核苷酸序列如seq id no.43～seq idno.45所示的下游引物urer-r和核苷酸序列如seq id no.46所示的探针urer-p；

10、所述靶向屎肠球菌glup基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.47～seqid no.48任一项所示的上游引物glup-f、核苷酸序列如seq id no.49～seq id no.50所示的下游引物glup-r和核苷酸序列如seq id no.51所示的探针glup-p；

11、所述靶向粪肠球菌rpoa基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.52～seqid no.53任一项所示的上游引物rpoa-f、核苷酸序列如seq id no.54～seq id no.55所示的下游引物rpoa-r和核苷酸序列如seq id no.56所示的探针rpoa-p。

12、在本发明的一种实施方式中，所述探针chua-p、探针rcsa-p、探针oprl-p、探针pgad-p、探针ompx-p、探针urer-p、探针glup-p和探针rpoa-p上标记有荧光基团和荧光淬灭基团。

13、在本发明的一种实施方式中，所述荧光基团包括fam、vic、cy5、rox、hex、joe、ned、texas red和cy3中的一种或一种以上。

14、在本发明的一种实施方式中，所述荧光淬灭基团包括bhq-1、bhq-2和bhq-3中的一种或一种以上。

15、本发明还提供了一种用于检测泌尿系感染中病原菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述引物探针组。

16、在本发明的一种实施方式中，所述检测试剂盒还包括raa(重组酶介导的等温核酸扩增技术)反应所需试剂。

17、在本发明的一种实施方式中，所述检测试剂盒还包括缓冲液和醋酸镁。

18、本发明还提供了一种用于检测泌尿系感染中病原菌的方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，所述方法包括：使用上述引物探针组或上述检测试剂盒对待测样本进行检测。

19、在本发明的一种实施方式中，所述方法包含如下步骤：

20、核酸提取步骤：对待测样本进行核酸提取，得到核酸提取液；

21、检测步骤：使用上述引物探针组或上述检测试剂盒将核酸提取液配置成基于raa(重组酶介导的等温核酸扩增技术)的反应体系；以不含待测样本的反应体系作为空白对照，对反应体系进行等温扩增，并根据等温扩增所得荧光扩增曲线判断待测样本中是否存在所检测的泌尿系感染病原菌；若等温扩增所得荧光扩增曲线与空白对照相比升高了10％以上，则待测样本中存在泌尿系感染病原菌，若等温扩增所得荧光扩增曲线与空白对照相比不升高，则待测样本中不存在所检测的泌尿系感染病原菌。

22、在本发明的一种实施方式中，所述反应体系的成分包含12.5～25μlraa反应所需试剂、7～14μl去离子水、1～2μl上游引物、1～2μl下游引物、1～2μl核酸提取液、1～2μl探针和2～3μl醋酸镁溶液。

23、在本发明的一种实施方式中，所述上游引物的浓度为10～20μm，所述下游引物的浓度为10～20μm，所述探针的浓度为10～20μm，所述醋酸镁溶液的浓度为40～60mg/ml。

24、在本发明的一种实施方式中，反应体系的成分由25μl raa反应所需试剂、14μl去离子水、2μl上游引物、2μl下游引物、2μl核酸提取液、2μl探针和2.5μl醋酸镁溶液组成。

25、在本发明的一种实施方式中，所述上游引物的浓度为10μm，所述下游引物的浓度为10μm，所述探针的浓度为10μm，所述醋酸镁溶液的浓度为50mg/ml。

26、在本发明的一种实施方式中，所述raa反应所需试剂的成分包含冻干raa反应原料以及缓冲液。

27、在本发明的一种实施方式中，所述等温扩增的温度为37～39℃、时间为20～30min。

28、本发明还提供了上述引物探针组或上述检测试剂盒或上述检测方法在泌尿系感染病原菌检测中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。

29、本发明技术方案，具有如下优点：

30、1、本发明提供了一种用于检测泌尿系感染中病原菌的引物探针组，所述引物探针组包括靶向大肠埃希菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向肺炎克雷伯菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向铜绿假单胞菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向鲍曼不动杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向阴沟肠杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向奇异变形杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向屎肠球菌特异性靶标基因的引物探针组和/或靶向粪肠球菌特异性靶标基因的引物探针组。针对北京大学第一医院泌尿系感染病原菌分布情况进行了十余年大样本量的回顾性研究(参见文献“front microbiol,2022,12:813145”)，并参考《全国细菌耐药监测网2014-2019年尿标本细菌耐药监测报告》，结果表明大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌八种常见细菌可占不同年龄段泌尿系感染患者病原菌分布的85～90％。而本发明的引物探针组正是靶向大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌这八种泌尿系感染常见细菌，因此，本发明的引物探针组能够达到快速筛查泌尿系感染常见病原菌的目的，可帮助临床确定85～90％的常见病原菌，对临床经验性抗生素治疗具有重要意义。

31、进一步地，所述大肠埃希菌特异性靶标基因包括大肠埃希菌chua基因的核心片段，且所述大肠埃希菌chua基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述肺炎克雷伯菌特异性靶标基因包括肺炎克雷伯菌rcsa基因的核心片段，且所述肺炎克雷伯菌rcsa基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述铜绿假单胞菌特异性靶标基因包括铜绿假单胞菌oprl基因的核心片段，且所述铜绿假单胞菌oprl基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述鲍曼不动杆菌特异性靶标基因包括鲍曼不动杆菌pgad基因的核心片段，且所述鲍曼不动杆菌pgad基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述阴沟肠杆菌特异性靶标基因包括阴沟肠杆菌ompx基因的核心片段，且所述阴沟肠杆菌ompx基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述奇异变形杆菌特异性靶标基因包括奇异变形杆菌urer基因的核心片段，且所述奇异变形杆菌urer基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述屎肠球菌特异性靶标基因包括屎肠球菌glup基因的核心片段，且所述屎肠球菌glup基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述粪肠球菌特异性靶标基因包括粪肠球菌rpoa基因的核心片段，且所述粪肠球菌rpoa基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.8所示。本发明引物探针组使用的特异性靶标基因是使用软件(例如在线软件https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/)通过多序列比对获得的保守性最好的核心片段，使用此特异性靶标基因能够显著提高检测灵敏度和特异性。

32、进一步地，所述靶向大肠埃希菌chua基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq idno.9～seq id no.11任一项所示的上游引物chua-f、核苷酸序列如seq id no.12～seq idno.14所示的下游引物chua-r和核苷酸序列如seq id no.15所示的探针chua-p；所述靶向肺炎克雷伯菌rcsa基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.16～seq id no.18任一项所示的上游引物rcsa-f、核苷酸序列如seq id no.19～seq id no.21所示的下游引物rcsa-r和核苷酸序列如seq id no.22所示的探针rcsa-p；所述靶向铜绿假单胞菌oprl基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.23～seq id no.24任一项所示的上游引物oprl-f、核苷酸序列如seq id no.25～seq id no.26所示的下游引物oprl-r和核苷酸序列如seq id no.27所示的探针oprl-p；所述靶向鲍曼不动杆菌pgad基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.28～seq id no.29任一项所示的上游引物pgad-f、核苷酸序列如seq id no.30～seq id no.31所示的下游引物pgad-r和核苷酸序列如seq id no.32所示的探针pgad-p；所述靶向阴沟肠杆菌ompx基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq idno.33～seq id no.35任一项所示的上游引物ompx-f、核苷酸序列如seq id no.36～seqid no.38所示的下游引物ompx-r和核苷酸序列如seq id no.39所示的探针ompx-p；所述靶向奇异变形杆菌urer基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.40～seq id no.42任一项所示的上游引物urer-f、核苷酸序列如seq id no.43～seq id no.45所示的下游引物urer-r和核苷酸序列如seq id no.46所示的探针urer-p；所述靶向屎肠球菌glup基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.47～seq id no.48任一项所示的上游引物glup-f、核苷酸序列如seq id no.49～seq id no.50所示的下游引物glup-r和核苷酸序列如seqid no.51所示的探针glup-p；所述靶向粪肠球菌rpoa基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.52～seq id no.53任一项所示的上游引物rpoa-f、核苷酸序列如seq id no.54～seq id no.55所示的下游引物rpoa-r和核苷酸序列如seq id no.56所示的探针rpoa-p。本发明引物探针组使用的引物和探针序列是基于特异性靶标基因的保守序列设计得到的，使用此引物和探针序列能够获得更强的扩增信号，有助于提高检测灵敏度和特异性。

33、2、本发明提供了一种用于检测泌尿系感染中病原菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括引物探针组；所述引物探针组包括靶向大肠埃希菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向肺炎克雷伯菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向铜绿假单胞菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向鲍曼不动杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向阴沟肠杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向奇异变形杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向屎肠球菌特异性靶标基因的引物探针组和/或靶向粪肠球菌特异性靶标基因的引物探针组。针对北京大学第一医院泌尿系感染病原菌分布情况进行了十余年大样本量的回顾性研究(参见文献“front microbiol,2022,12:813145”)，并参考《全国细菌耐药监测网2014-2019年尿标本细菌耐药监测报告》，结果表明大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌八种常见细菌可占不同年龄段泌尿系感染患者病原菌分布的85～90％。而本发明的检测试剂盒正是靶向大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌这八种泌尿系感染常见细菌，因此，本发明的检测试剂盒能够达到快速筛查泌尿系感染常见病原菌的目的，可帮助临床确定85～90％的常见病原菌，对临床经验性抗生素治疗具有重要意义。

34、进一步地，所述大肠埃希菌特异性靶标基因包括大肠埃希菌chua基因的核心片段，且所述大肠埃希菌chua基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述肺炎克雷伯菌特异性靶标基因包括肺炎克雷伯菌rcsa基因的核心片段，且所述肺炎克雷伯菌rcsa基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述铜绿假单胞菌特异性靶标基因包括铜绿假单胞菌oprl基因的核心片段，且所述铜绿假单胞菌oprl基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述鲍曼不动杆菌特异性靶标基因包括鲍曼不动杆菌pgad基因的核心片段，且所述鲍曼不动杆菌pgad基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述阴沟肠杆菌特异性靶标基因包括阴沟肠杆菌ompx基因的核心片段，且所述阴沟肠杆菌ompx基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述奇异变形杆菌特异性靶标基因包括奇异变形杆菌urer基因的核心片段，且所述奇异变形杆菌urer基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述屎肠球菌特异性靶标基因包括屎肠球菌glup基因的核心片段，且所述屎肠球菌glup基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述粪肠球菌特异性靶标基因包括粪肠球菌rpoa基因的核心片段，且所述粪肠球菌rpoa基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.8所示。本发明检测试剂盒使用的特异性靶标基因是使用软件(例如在线软件https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/)通过多序列比对获得的保守性最好的核心片段，使用此特异性靶标基因能够显著提高检测准确度、灵敏度和特异性。

35、进一步地，所述靶向大肠埃希菌chua基因的引物探针组包括核苷酸序列如seqidno.9～seq id no.11任一项所示的上游引物chua-f、核苷酸序列如seq id no.12～seqid no.14所示的下游引物chua-r和核苷酸序列如seq id no.15所示的探针chua-p；所述靶向肺炎克雷伯菌rcsa基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.16～seq id no.18任一项所示的上游引物rcsa-f、核苷酸序列如seq id no.19～seq id no.21所示的下游引物rcsa-r和核苷酸序列如seq id no.22所示的探针rcsa-p；所述靶向铜绿假单胞菌oprl基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.23～seq id no.24任一项所示的上游引物oprl-f、核苷酸序列如seq id no.25～seq id no.26所示的下游引物oprl-r和核苷酸序列如seq id no.27所示的探针oprl-p；所述靶向鲍曼不动杆菌pgad基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.28～seq id no.29任一项所示的上游引物pgad-f、核苷酸序列如seq id no.30～seq id no.31所示的下游引物pgad-r和核苷酸序列如seq id no.32所示的探针pgad-p；所述靶向阴沟肠杆菌ompx基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq idno.33～seq id no.35任一项所示的上游引物ompx-f、核苷酸序列如seq id no.36～seqid no.38所示的下游引物ompx-r和核苷酸序列如seq id no.39所示的探针ompx-p；所述靶向奇异变形杆菌urer基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.40～seq id no.42任一项所示的上游引物urer-f、核苷酸序列如seq id no.43～seq id no.45所示的下游引物urer-r和核苷酸序列如seq id no.46所示的探针urer-p；所述靶向屎肠球菌glup基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.47～seq id no.48任一项所示的上游引物glup-f、核苷酸序列如seq id no.49～seq id no.50所示的下游引物glup-r和核苷酸序列如seqid no.51所示的探针glup-p；所述靶向粪肠球菌rpoa基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.52～seq id no.53任一项所示的上游引物rpoa-f、核苷酸序列如seq id no.54～seq id no.55所示的下游引物rpoa-r和核苷酸序列如seq id no.56所示的探针rpoa-p。本发明检测试剂盒使用的引物和探针序列是基于特异性靶标基因的保守序列设计得到的，使用此引物和探针序列能够获得更强的扩增信号，有助于提高检测准确度、灵敏度和特异性。

36、进一步地，所述检测试剂盒还包括raa(重组酶介导的等温核酸扩增技术)反应所需试剂。本发明的检测试剂盒基于“重组酶介导的等温核酸扩增技术”设计，可在30分钟内出结果，尤其适用于门诊、急诊患者，可实现泌尿系感染中病原菌的快速筛查试验，并且，基于“重组酶介导的等温核酸扩增技术”的检测试剂盒在实施检测时具有操作简便、成本低和适用场景广的优势，此外，基于“重组酶介导的等温核酸扩增技术”的检测试剂盒在实施检测时既可以使用昂贵的定量pcr仪，也可以使用其他相对便宜的荧光检测装置(例如，荧光检测器)，成本更低。

37、3、本发明提供了一种用于检测泌尿系感染中病原菌的方法，所述方法包括：使用上述检测试剂盒对待测样本进行检测所述检测试剂盒包括引物探针组；所述引物探针组包括靶向大肠埃希菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向肺炎克雷伯菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向铜绿假单胞菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向鲍曼不动杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向阴沟肠杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向奇异变形杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向屎肠球菌特异性靶标基因的引物探针组和/或靶向粪肠球菌特异性靶标基因的引物探针组。针对北京大学第一医院泌尿系感染病原菌分布情况进行了十余年大样本量的回顾性研究(参见文献“front microbiol,2022,12:813145”)，并参考《全国细菌耐药监测网2014-2019年尿标本细菌耐药监测报告》，结果表明大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌八种常见细菌可占不同年龄段泌尿系感染患者病原菌分布的85～90％。而本发明的方法正是靶向大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌这八种泌尿系感染常见细菌，因此，本发明的检测试剂盒能够达到快速筛查泌尿系感染常见病原菌的目的，可帮助临床确定85～90％的常见病原菌，对临床经验性抗生素治疗具有重要意义。

38、进一步地，所述大肠埃希菌特异性靶标基因包括大肠埃希菌chua基因的核心片段，且所述大肠埃希菌chua基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述肺炎克雷伯菌特异性靶标基因包括肺炎克雷伯菌rcsa基因的核心片段，且所述肺炎克雷伯菌rcsa基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述铜绿假单胞菌特异性靶标基因包括铜绿假单胞菌oprl基因的核心片段，且所述铜绿假单胞菌oprl基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述鲍曼不动杆菌特异性靶标基因包括鲍曼不动杆菌pgad基因的核心片段，且所述鲍曼不动杆菌pgad基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述阴沟肠杆菌特异性靶标基因包括阴沟肠杆菌ompx基因的核心片段，且所述阴沟肠杆菌ompx基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述奇异变形杆菌特异性靶标基因包括奇异变形杆菌urer基因的核心片段，且所述奇异变形杆菌urer基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述屎肠球菌特异性靶标基因包括屎肠球菌glup基因的核心片段，且所述屎肠球菌glup基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述粪肠球菌特异性靶标基因包括粪肠球菌rpoa基因的核心片段，且所述粪肠球菌rpoa基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.8所示。本发明方法使用的特异性靶标基因是使用软件(例如在线软件https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/)通过多序列比对获得的保守性最好的核心片段，使用此特异性靶标基因能够显著提高检测准确度、灵敏度和特异性。

39、进一步地，所述靶向大肠埃希菌chua基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq idno.9～seq id no.11任一项所示的上游引物chua-f、核苷酸序列如seq id no.12～seq idno.14所示的下游引物chua-r和核苷酸序列如seq id no.15所示的探针chua-p；所述靶向肺炎克雷伯菌rcsa基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.16～seq id no.18任一项所示的上游引物rcsa-f、核苷酸序列如seq id no.19～seq id no.21所示的下游引物rcsa-r和核苷酸序列如seq id no.22所示的探针rcsa-p；所述靶向铜绿假单胞菌oprl基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.23～seq id no.24任一项所示的上游引物oprl-f、核苷酸序列如seq id no.25～seq id no.26所示的下游引物oprl-r和核苷酸序列如seq id no.27所示的探针oprl-p；所述靶向鲍曼不动杆菌pgad基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.28～seq id no.29任一项所示的上游引物pgad-f、核苷酸序列如seq id no.30～seq id no.31所示的下游引物pgad-r和核苷酸序列如seq id no.32所示的探针pgad-p；所述靶向阴沟肠杆菌ompx基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq idno.33～seq id no.35任一项所示的上游引物ompx-f、核苷酸序列如seq id no.36～seqid no.38所示的下游引物ompx-r和核苷酸序列如seq id no.39所示的探针ompx-p；所述靶向奇异变形杆菌urer基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.40～seq id no.42任一项所示的上游引物urer-f、核苷酸序列如seq id no.43～seq id no.45所示的下游引物urer-r和核苷酸序列如seq id no.46所示的探针urer-p；所述靶向屎肠球菌glup基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.47～seq id no.48任一项所示的上游引物glup-f、核苷酸序列如seq id no.49～seq id no.50所示的下游引物glup-r和核苷酸序列如seqid no.51所示的探针glup-p；所述靶向粪肠球菌rpoa基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.52～seq id no.53任一项所示的上游引物rpoa-f、核苷酸序列如seq id no.54～seq id no.55所示的下游引物rpoa-r和核苷酸序列如seq id no.56所示的探针rpoa-p。本发明方法使用的引物和探针序列是基于特异性靶标基因的保守序列设计得到的，使用此引物和探针序列能够获得更强的扩增信号，有助于提高检测准确度、灵敏度和特异性。

40、进一步地，所述检测试剂盒还包括raa(重组酶介导的等温核酸扩增技术)反应所需试剂。本发明的方法基于“重组酶介导的等温核酸扩增技术”设计，可在30分钟内出结果，尤其适用于门诊、急诊患者，可实现泌尿系感染中病原菌的快速筛查试验，并且，基于“重组酶介导的等温核酸扩增技术”的检测方法具有操作简便、成本低和适用场景广的优势，此外，基于“重组酶介导的等温核酸扩增技术”的方法既可以使用昂贵的定量pcr仪，也可以使用其他相对便宜的荧光检测装置(例如，荧光检测器)，成本更低。

41、进一步地，所述方法包含核酸提取步骤和检测步骤；其中，核酸提取步骤为：对待测样本进行核酸提取，得到核酸提取液；检测步骤为：使用上述引物探针组或上述检测试剂盒将核酸提取液配置成基于raa(重组酶介导的等温核酸扩增技术)的反应体系；以不含待测样本的反应体系作为空白对照，对反应体系进行等温扩增，并根据等温扩增所得荧光扩增曲线判断待测样本中是否存在所检测的泌尿系感染病原菌；检测步骤中，所述反应体系的成分包含12.5～25μlraa反应所需试剂、7～14μl去离子水、1～2μl上游引物、1～2μl下游引物、1～2μl核酸提取液、1～2μl探针和2～3μl醋酸镁溶液；所述上游引物的浓度为10～20μm，所述下游引物的浓度为10～20μm，所述探针的浓度为10～20μm，所述醋酸镁溶液的浓度为40～60mg/ml。使用本发明的反应体系进行检测时，能够获得更强的扩增信号，有助于提高检测准确度、灵敏度和准确度。

42、进一步地，检测步骤中，所述等温扩增的温度为37～39℃、时间为20～30min。使用本发明的荧光定量pcr条件进行检测时，能够获得更强的扩增信号，有助于提高检测准确度、灵敏度和准确度。

技术特征：

1.一种用于检测泌尿系感染中病原菌的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括靶向大肠埃希菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向肺炎克雷伯菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向铜绿假单胞菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向鲍曼不动杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向阴沟肠杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向奇异变形杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向屎肠球菌特异性靶标基因的引物探针组和/或靶向粪肠球菌特异性靶标基因的引物探针组。

2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述大肠埃希菌特异性靶标基因包括大肠埃希菌chua基因的核心片段；所述肺炎克雷伯菌特异性靶标基因包括肺炎克雷伯菌rcsa基因的核心片段；所述铜绿假单胞菌特异性靶标基因包括铜绿假单胞菌oprl基因的核心片段；所述鲍曼不动杆菌特异性靶标基因包括鲍曼不动杆菌pgad基因的核心片段；所述阴沟肠杆菌特异性靶标基因包括阴沟肠杆菌ompx基因的核心片段；所述奇异变形杆菌特异性靶标基因包括奇异变形杆菌urer基因的核心片段；所述屎肠球菌特异性靶标基因包括屎肠球菌glup基因的核心片段；所述粪肠球菌特异性靶标基因包括粪肠球菌rpoa基因的核心片段。

3.如权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述大肠埃希菌chua基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述肺炎克雷伯菌rcsa基因核心片段的核苷酸序列如seqid no.2所示；所述铜绿假单胞菌oprl基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述鲍曼不动杆菌pgad基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述阴沟肠杆菌ompx基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述奇异变形杆菌urer基因核心片段的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述屎肠球菌glup基因核心片段的核苷酸序列如seqid no.7所示；所述粪肠球菌rpoa基因核心片段的核苷酸序列如seq idno.8所示。

4.如权利要求3所述的引物探针组，其特征在于，所述靶向大肠埃希菌chua基因的引物探针组包括核苷酸序列如seq id no.9～seq id no.11任一项所示的上游引物chua-f、核苷酸序列如seq id no.12～seq id no.14所示的下游引物chua-r和核苷酸序列如seq idno.15所示的探针chua-p；

5.如权利要求4所述的引物探针组，其特征在于，所述探针chua-p、探针rcsa-p、探针oprl-p、探针pgad-p、探针ompx-p、探针urer-p、探针glup-p和探针rpoa-p上标记有荧光基团和荧光淬灭基团。

6.一种用于检测泌尿系感染中病原菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1～5任一项所述的引物探针组。

7.一种用于检测泌尿系感染中病原菌的方法，其特征在于，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，所述方法包括：使用权利要求1～5任一项所述的引物探针组或权利要求6所述的检测试剂盒对待测样本进行检测。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述反应体系的成分包含12.5～25μlraa反应所需试剂、7～14μl去离子水、1～2μl上游引物、1～2μl下游引物、1～2μl核酸提取液、1～2μl探针和2～3μl醋酸镁溶液。

10.权利要求1～5任一项所述的引物探针组或权利要求6所述的检测试剂盒或权利要求7～9任一项所述的方法在泌尿系感染病原菌检测中的应用，其特征在于，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。

技术总结
本发明涉及一种用于检测泌尿系感染中病原菌的检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种用于检测泌尿系感染中病原菌的检测试剂盒，检测试剂盒包括引物探针组；引物探针组包括靶向大肠埃希菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向肺炎克雷伯菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向铜绿假单胞菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向鲍曼不动杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向阴沟肠杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向奇异变形杆菌特异性靶标基因的引物探针组、靶向屎肠球菌特异性靶标基因的引物探针组和/或靶向粪肠球菌特异性靶标基因的引物探针组。本发明提供的检测试剂盒能够达到快速筛查泌尿系感染常见病原菌的目的。

技术研发人员：黄磊,刘雪萍,孙浩,孙立颖
受保护的技术使用者：北京大学第一医院（北京大学第一临床医学院）
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23