一种多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片及其制备方法和应用
本发明属于荧光和电化学传感，具体涉及一种多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片及其制备方法和应用，即利用集成荧光纳米团簇传感阵列和电化学适配体传感器的功能芯片检测食品中多种重金属离子的应用。
背景技术：
1、在自然环境中，多种重金属离子的共存往往会导致复杂的相互作用，并影响其中每一种重金属的总体毒性水平和生物利用度。因此，开发将初步定性和精准定量相结合的新型传感方法可实现复杂基质中多种重金属离子的同时判别和检测，这对于评估其潜在风险并制定高效的应对策略至关重要。近年来，光学传感器被广泛应用于各个领域，其检测原理是根据体系颜色强度或色调的变化以确定特定物质是否存在并测定其浓度。许多由各种金属配合物组成的光学传感器阵列已被验证具有出色的检测和识别能力。
2、目前，复杂基质中多种目标物质的可靠鉴别是检测领域面临的重大挑战。研究表明，具有两种响应机制的双信号检测体系具有自校准和提高信号可靠性的能力。与比色法相比，荧光传感技术是在特定的激发光下，通过测定发光强度与待测物浓度之间的关系进行检测，具有较高的灵敏度和抗背景干扰能力。金属纳米团簇(mncs)中的配体类型会影响其电子结构和荧光特性。因此，可选择合适配体合成具有不同荧光特性的mncs作为目标检测物的传感信号分子，构建荧光传感器阵列，从而实现选择性地与多种重金属离子发生相互作用。与光学信号传感体系相比，电化学生物传感器以其方便、快速、特异性强等优点在重金属离子分析领域得到了广泛的应用。此外，随着对现场筛查便携式设备需求的不断增长，一种集成多种识别模式的小型操作平台——一体化微流控芯片，可作为实现重金属离子多模式监测集成化、快速化的有效手段。
技术实现思路
1、针对现有技术中的不足，本发明的第一方面提供一种多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法，以多种由不同配体稳定的mncs作为荧光信号分子，构建了一种基于模式识别技术的荧光传感器阵列，对不同重金属离子进行初步判别。为了保证检测结果的可靠性，将电化学定量与适配体特异性识别功能相结合构建电化学适配体传感平台，利用核酸外切酶辅助和dna扩增技术实现重金属离子的超灵敏特异性定量分析。为实现多种重金属的鉴别与定量，将上述两种体系集成，构建了多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片。
2、本发明的第二方面提供一种多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片，通过上述制备方法得到。
3、本发明的第三方面提供利用上述荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片进行多重金属检测的方法。
4、本发明的第四方面提供上述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的应用。
5、为达到上述目的，本发明的技术方案是：
6、本发明的第一方面提供一种多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法，包括如下步骤：
7、(1)制备不同配体稳定的荧光纳米团簇(bsa-au ncs@cnqd、gsh-auag ncs、pei-aupt ncs、mua-auag ncs)，构建荧光传感器阵列；
8、(2)电化学检测过程中生化反应在丝网印刷电极上进行，电极以聚对苯二甲酸乙二醇酯为衬底，通过丝网印刷在基底上固定工作电极、对电极和参比电极，其中所述工作电极和对电极由石墨和聚丙烯酸衍生物组成，所述参比电极由银/氯化银浆料组成；
9、(3)通过电化学循环伏安扫描进行金纳米粒子沉积，得到金纳米粒子修饰电极；
10、(4)巯基修饰的dna与电极表面的金纳米粒子通过金硫键进行共价偶联，得到dna修饰电极；
11、(5)以聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)为基材，通过激光雕刻制备集成荧光传感器阵列和电化学适配体传感器的一体化微流控芯片。
12、一些实施例中，步骤(1)中，所述bsa-au ncs@cnqd的制备方法包括：柠檬酸三钠、氯化铵加至20ml水中，反应后透析(5000da)，离心去除不溶性大颗粒，得到cnqds。在bsa中加入haucl4，搅拌均匀后加入naoh，搅拌反应，反应完成后得到bsa-au ncs。将上述制备的cnqd和bsa-au ncs混合，得到bsa-au ncs@cnqd。
13、一些实施例中，步骤(1)中，所述柠檬酸三钠添加量为0.3-0.4g，优选为0.4g；氯化铵添加量为2-2.5g，优选为2.12g；反应温度为160-200℃，优选为180℃，反应时间为3-5h，优选为4h；透析时间为24-48h，优选为24h。
14、一些实施例中，步骤(1)中，所述bsa添加量为4-5ml，优选为5ml，浓度为50-60mg/ml，优选为50mg/ml；haucl4添加量为4-5ml，优选为5ml，浓度为10-15mg/ml，优选为10mg/ml。
15、一些实施例中，步骤(1)中，所述naoh添加量为0.5-1ml，优选为0.5ml，浓度为0.5-1m，优选为1m；反应温度为35-40℃，优选为37℃，反应时间为20-30h，优选为24h。
16、一些实施例中，步骤(1)中，所述cnqd和bsa-au ncs体积比为1:4-1:6，优选为1:5。
17、一些实施例中，步骤(1)中，所述gsh-auag ncs的制备方法包括：将haucl4、agno3与gsh混合，搅拌反应。反应结束后将产物透析(3500kda)纯化得到gsh-auag ncs。
18、一些实施例中，步骤(1)中，所述haucl4添加量为4-5ml，优选为5ml，浓度为4-5mm，优选为4mm；agno3添加量为0.8-1ml，优选为1ml，浓度为4-5mm，优选为4mm；gsh添加量为5-6ml，优选为6ml，浓度为5-6mm，优选为6mm。
19、一些实施例中，步骤(1)中，所述反应温度为60-80℃，优选为70℃，反应时间为20-30h，优选为24h。
20、一些实施例中，步骤(1)中，所述透析时间为20-30h，优选为24h。
21、一些实施例中，步骤(1)中，所述pei-aupt ncs的制备方法包括：gsh、haucl4和h2ptcl6加至9.5ml水中，搅拌后，在体系中加入pei，继续搅拌，而后加入新鲜制备的抗坏血酸，搅拌均匀后逐滴加入hcl调节体系ph。将上述溶液转移至反应釜中反应，而后透析(3500da)得到pei-aupt ncs。
22、一些实施例中，步骤(1)中，所述gsh添加量为200-300μl，优选为250μl，浓度为80-120mm，优选为100mm；haucl4添加量为100-150μl，优选为125μl，浓度为8-12mm，优选为10mm；h2ptcl6添加量为100-150μl，优选为125μl，浓度为8-12mm，优选为10mm；搅拌时间为20-40min，优选为20min。
23、一些实施例中，步骤(1)中，所述pei添加量为20-30mg，优选为25mg；搅拌时间为1-2h，优选为2h；抗坏血酸添加量为200-300μl，优选为250μl，浓度为80-120mm，优选为100mm；hcl浓度为1-1.5m，优选为1m；ph范围为4-6，优选为5。
24、一些实施例中，步骤(1)中，所述反应温度为80-100℃，优选为90℃，反应时间为0.8-1.2h，优选为1h；透析时间为40-60h，优选为48h。
25、一些实施例中，步骤(1)中，所述mua-auag ncs的制备方法包括：通过超声处理将mua溶于naoh中。在磁力搅拌下依次加入haucl4和agno3，随后加入naoh和nabh4，于室温下搅拌后透析(14kda)，冷冻干燥，得到mua-auag ncs。
26、一些实施例中，步骤(1)中，所述mua添加量为10-15mg，优选为13.3mg；naoh添加量为10-15ml，优选为10ml，浓度为10-15mm，优选为15mm。
27、一些实施例中，步骤(1)中，所述haucl4添加量为4-5ml，优选为4ml，浓度为2-4mm，优选为3.25mm；agno3添加量为1-1.5ml，优选为1ml，浓度为2-4mm，优选为3.25mm。
28、一些实施例中，步骤(1)中，所述naoh添加量为30-50μl，优选为40μl，浓度为0.1-0.2mm，优选为0.15mm；nabh4添加量为60-80μl，优选为67μl，浓度为20-30mm，优选为26.4mm；
29、一些实施例中，步骤(1)中，所述搅拌时间为20-30h，优选为24h；透析时间为20-30h，优选为24h。
30、一些实施例中，步骤(2)中，所述丝网印刷电极的工作电极直径为3.5毫米。
31、一些实施例中，步骤(3)中，所述金纳米粒子修饰电极的制备方法包括：将氯金酸溶液和硫酸钾溶液等体积混合溶液滴加至工作电极上，电化学循环伏安扫描沉积金纳米粒子，冲洗晾干得到金纳米粒子修饰电极。
32、一些实施例中，步骤(3)中，所述氯金酸溶液的浓度为1-2mm，优选为1mm。
33、一些实施例中，步骤(3)中，所述硫酸钾溶液的浓度为10-20mm，优选为10mm。
34、一些实施例中，步骤(3)中，所述氯金酸和硫酸钾混合溶液的添加量为100-150μl，优选为100μl。
35、一些实施例中，步骤(3)中，所述cv扫描的扫描速率为0.05-0.2v/s，优选为0.05v/s，扫描圈数为20-30圈，优选为25圈。
36、一些实施例中，步骤(4)中，所述dna修饰电极的制备方法包括：在金纳米粒子修饰电极上滴加dna溶液，通过孵育将dna与金纳米粒子偶联；孵育反应后，用磷酸盐缓冲液冲洗除去未偶联的dna，而后将电极浸入巯基己醇溶液中浸泡以封闭非特异性结合位点，然后用磷酸盐缓冲液冲洗晾干，得到dna修饰电极。
37、一些实施例中，步骤(4)中，所述dna溶液的浓度为0.8-1.5μm，优选为1μm，滴加量为10-20μl，优选为10μl。
38、一些实施例中，步骤(4)中，所述dna溶液在电极上的孵育温度为20-30℃，优选为25℃，孵育时间为30-60min，优选为60min。
39、一些实施例中，步骤(4)中，所述巯基己醇溶液的浓度为1-2mm，优选为2mm，浸泡封闭时间为40-60min，优选为60min。
40、一些实施例中，步骤(5)中，所述一体化微流控芯片的制备方法包括：将pmma在异丙醇中超声处理，以去除表面的灰尘。利用软件设计芯片图案，并将其传送到激光雕刻机进行加工。雕刻完成后，用去离子水冲洗pmma基板以去除表面碎屑。将荧光探针和四通道丝网印刷电极分别置于荧光反应区和电化学反应区。最后，将多层聚甲基丙烯酸甲酯组装成集成芯片。
41、一些实施例中，步骤(5)中，所述异丙醇浓度为50-60％，优选为50％，处理时间为10-15min，优选为10min。
42、一些实施例中，步骤(5)中，所述荧光探针添加量为5-10μl，优选为5μl。
43、一些实施例中，步骤(5)中，所述加样口、样品出口和通道深度为0.8-1.5mm，优选为1mm。
44、一些实施例中，步骤(5)中，所述荧光反应区和电化学反应区深度为2-4mm，优选为2.5mm。
45、本发明的第二方面，提供一种多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片，其由上述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法得到。
46、本发明的第三方面，提供利用上述荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片进行多重金属检测的方法，是将待测物滴加至微流控芯片上，分别测定荧光信号和电化学信号，依次对重金属离子进行初步鉴别和精准定量。
47、一些实施例中，所述重金属离子的检测方法具体包括：待测溶液滴加至微流控芯片的进样口1，分别流至荧光反应区和电化学反应区。待测溶液在荧光反应区与荧光纳米团簇进行反应，在360nm激发光下测定荧光强度值；在电化学检测过程中，cdna/apt互补双链滴加至进样口2，与待测溶液混合后流至dna修饰电极，加入核酸外切酶和h1-h6核酸序列触发双支杂交链式反应，于室温下反应。其中h3、h4、h5、h6包含的富c序列作为模板稳定的agncs提供dpv电化学信号，实现靶标定量分析。
48、一些实施例中，所述dna的序列如seq id no：1、4和7所示，所述cdna的序列如seqid no：2、5和8所示，所述apt的序列seq id no：3和6所示，所述h1-h6的序列如seq id no：9-14所示。
49、一些实施例中，所述待测溶液的添加量为200-300μl，优选为200μl。
50、一些实施例中，所述待测溶液与荧光纳米团簇反应时间为10-15min，优选为10min。
51、一些实施例中，所述cdna/apt互补双链添加量为15-20μl，优选为20μl，浓度为2-3μm，优选为2μm。
52、一些实施例中，所述核酸外切酶添加量为20-35μl，优选为30μl，浓度为0.8-1.2u/μl，优选为1u/μl。
53、一些实施例中，所述h1-h6核酸序列添加量为25-30μl，优选为30μl，浓度为1.5-2.5μm，优选为2μm。
54、一些实施例中，所述双支杂交链式反应反应时间为30-60min，优选为30min。
55、本发明的第四方面，提供一种上述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片在检测食品多种重金属离子中的应用。
56、一些实施例中，检测茶叶和蔬菜中多种重金属离子的方法，通过所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片实现，包括如下步骤：
57、(a)配制不同浓度梯度的重金属离子标准溶液，滴在所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片上，测定其荧光响应信号以及电化学特征峰信号强度，拟合标准曲线；
58、(b)将茶叶和蔬菜经前处理，滴加至所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片上，根据线性模型测定重金属离子的浓度。
59、一些实施例中，步骤(a)中，在电化学检测体系中，pb2+、cd2+、hg2+的标准曲线拟合的方法：将pb2+、cd2+、hg2+标准品用超纯水稀释至不同浓度，将不同浓度的溶液滴加到所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片上，检测电化学反应区银纳米团簇的电化学dpv信号，通过dpv峰强度值进行标准曲线拟合。
60、一些实施例中，步骤(a)中，pb2+溶液的不同浓度为0ng/ml、0.005ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml和200ng/ml。
61、一些实施例中，步骤(a)中，cd2+溶液的不同浓度为0ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、100ng/ml和200ng/ml。
62、一些实施例中，步骤(a)中，hg2+溶液的不同浓度为0ng/ml、0.005ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和50ng/ml。
63、一些实施例中，步骤(b)中，在粉碎的茶叶粉末和蔬菜中加入硝酸和过氧化氢，然后于石墨消解炉中消解；消解完成后，用水定容，过滤除杂后作为检测所需溶液，滴加至所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片上，检测电化学信号，根据标准曲线计算茶叶和蔬菜中重金属离子pb2+、cd2+、hg2+的含量。
64、由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
65、一、本发明制备的bsa-au ncs@cnqd、gsh-auag ncs、pei-aupt ncs和mua-auagncs可作为传感元件构建了荧光传感器阵列，在365nm激发光下具有六个响应发射峰，可与pb2+、cd2+、hg2+、as3+、cr6+、cu2+六种重金属离子相互作用而发生不同程度的荧光强度变化，从而实现初步鉴定；构建的核酸外切酶exo iii催化辅助结合dhcr信号放大电化学适配体传感体系可在荧光阵列判别基础上，针对特定的靶标进行定量分析，针对pb2+、cd2+、hg2+可实现lod低至3.327pg/ml、7.975pg/ml和1.228pg/ml的快速灵敏检测。
66、二、本发明将建立的荧光传感器阵列和电化学适配体传感体系相结合，设计了一体化微流控芯片，可将多种重金属离子判别与定量分析功能集成，有效实现多种重金属离子的分选与可靠检测，具有制备简单、便携、快速等优点。
67、三、本发明为高灵敏度、高特异性、同时检测多种重金属的多信号功能核酸芯片的制备提供新的方法，且制备方法新颖，制备过程简单，可应用于食品检测行业，例如可以快速检测茶叶和蔬菜样品中多种重金属离子的含量，具有重要的实际应用价值。
技术特征：
1.一种多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述bsa-au ncs@cnqd的制备方法包括：柠檬酸三钠、氯化铵加至20ml水中，反应后用5000da透析袋透析，离心去除不溶性大颗粒，得到cnqds；在bsa中加入haucl4，搅拌均匀后加入naoh，搅拌反应，反应完成后得到bsa-au ncs；将上述制备的cnqd和bsa-au ncs混合，得到bsa-au ncs@cnqd；其中：
3.根据权利要求1所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述gsh-auag ncs的制备方法包括：将haucl4、agno3与gsh混合，搅拌反应；反应结束后将产物用3500kda透析袋透析纯化得到gsh-auag ncs；其中：
4.根据权利要求1所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述pei-aupt ncs的制备方法包括：gsh、haucl4和h2ptcl6加至9.5ml水中，搅拌后，在体系中加入pei，继续搅拌，而后加入新鲜制备的抗坏血酸，搅拌均匀后逐滴加入hcl调节体系ph。将上述溶液转移至反应釜中反应，而后用3500da透析袋透析得到pei-aupt ncs；其中：
5.根据权利要求1所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述mua-auag ncs的制备方法包括：通过超声处理将mua溶于naoh中；在磁力搅拌下依次加入haucl4和agno3，随后加入naoh和nabh4，于室温下搅拌后用14kda透析袋透析，冷冻干燥，得到mua-auag ncs；其中：
6.根据权利要求1所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述丝网印刷电极的工作电极直径为3.5毫米。
7.根据权利要求1所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述金纳米粒子修饰电极的制备方法包括：将氯金酸溶液和硫酸钾溶液等体积混合溶液滴加至工作电极上，电化学循环伏安扫描沉积金纳米粒子，冲洗晾干得到金纳米粒子修饰电极；其中：
8.根据权利要求1所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述dna修饰电极的制备方法包括：在金纳米粒子修饰电极上滴加dna溶液，通过孵育将dna与金纳米粒子偶联；孵育反应后，用磷酸盐缓冲液冲洗除去未偶联的dna，而后将电极浸入巯基己醇溶液浸泡以封闭非特异性结合位点，然后用磷酸盐缓冲液冲洗晾干，得到dna修饰电极；其中：
9.根据权利要求1所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述一体化微流控芯片的制备方法包括：将pmma在异丙醇中超声处理，以去除表面的灰尘；利用软件设计芯片图案，并将其传送到激光雕刻机进行加工。雕刻完成后，用去离子水冲洗pmma基板以去除表面碎屑；将荧光探针和四通道丝网印刷电极分别置于荧光反应区和电化学反应区；最后，将多层聚甲基丙烯酸甲酯组装成集成芯片；其中：
10.一种多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片，其特征在于，通过权利要求1至9任一项所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片的制备方法得到。
11.利用权利要求10所述的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片进行多重金属检测的方法，其特征在于，是将待测物滴加至微流控芯片上，分别测定荧光信号和电化学信号，依次对重金属离子进行初步鉴别和精准定量。
12.根据权利要求11所述的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片进行多重金属检测的方法，其特征在于，具体包括：待测溶液滴加至微流控芯片的进样口1，分别流至荧光反应区和电化学反应区；待测溶液在荧光反应区与荧光纳米团簇进行反应，在360nm激发光下测定荧光强度值；在电化学检测过程中，cdna/apt互补双链滴加至进样口2，与待测溶液混合后流至dna修饰电极，加入核酸外切酶和h1-h6核酸序列触发双支杂交链式反应，于室温下反应；其中h3、h4、h5、h6包含的富c序列作为模板稳定的ag ncs提供dpv电化学信号，实现靶标定量分析；其中：
13.权利要求10所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片在检测食品多种重金属离子中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，检测茶叶和蔬菜中多种重金属离子通过所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片实现，包括如下步骤：
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，步骤(a)中，在电化学检测体系中，pb2+、cd2+、hg2+的标准曲线拟合的方法：将pb2+、cd2+、hg2+标准品用超纯水稀释至不同浓度，将不同浓度的溶液滴加到所述多重金属检测的荧光传感阵列-电化学功能核酸芯片上，检测电化学反应区银纳米团簇的电化学dpv信号，通过dpv峰强度值进行标准曲线拟合；其中：
技术总结
本发明属于荧光和电化学传感技术领域，具体公开了一种多重金属检测的荧光传感阵列‑电化学功能核酸芯片及其制备方法和应用。本发明将各种配体稳定的荧光金属纳米团簇作为信号分子，用于基于模式识别响应的重金属离子的识别和分化；在荧光纳米簇识别的基础上，将电化学定量与适体识别相结合，利用核酸外切酶辅助和DNA扩增技术实现了重金属离子的特异超灵敏检测。其中，电化学检测体系由催化发夹组装模块和双支杂交链式反应组成，核酸序列上银纳米团簇提供电化学信号，其变化可实现对重金属离子Pb<supgt;2+</supgt;、Cd<supgt;2+</supgt;、Hg<supgt;2+</supgt;的特异性检测；根据上述荧光阵列和电化学定量体系，构建了一体化微流控芯片将两种检测体系有效结合以达到检测快速化、集成化的目的，可以有效实现多种重金属离子的鉴别和特异灵敏快速检测。
技术研发人员：魏新林,潘怡,王丽,陈守慧
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23