一种宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽及制备方法、鉴定方法

本发明涉及抗氧化肽，具体领域为一种抗氧化肽及制备方法、鉴定方法。

背景技术：

1、宁夏作为我国西北肉牛养殖主产区，当地肉牛具有肉质紧实、肉色鲜红、营养价值高等优点。研究表明，牛血富含血红蛋白，经酶解后可产生多种具有潜在生物活性的多肽，如抗氧化肽、抗菌肽和ace抑制肽。以上牛血源生物活性肽的制备、利用有助于加快食品工业的新质生产力的发展。

2、抗氧化肽是一类低分子量的生物活性肽，因广泛的来源、活性高和易吸收性而备受关注。该类型肽不仅可以替代人工抗氧化剂，而且具有无毒、低成本和环保等优点。抗氧化肽有助于防止或减缓由氧化应激引起的细胞损害和退行性疾病的风险。研究表明，动物源蛋白较植物源蛋白含有更多的必须氨基酸(如甲基组氨酸和羟甲基赖氨酸)，被认为是获得抗氧化肽的重要来源。因此，包括牛血在内的动物源抗氧化肽具有营养价值强和生物利用度高的优点。

3、传统方法一般通过酶解/发酵、分离纯化和鉴定等步骤来获取新型抗氧化肽，然而传统的分离纯化过程耗时长、成本高、产量低。近年来，随着生物信息学的迅猛发展，数据库辅助的计算机方法被应用于预测和设计各种活性肽，包括抗氧化肽、dpp-iv抑制肽、ace抑制肽和鲜味肽等。此外，分子模拟已广泛应用于目标肽-自由基结合模式及相互作用的预测，成为揭示抗氧化肽作用机理的有效工具。和传统方法相比，计算机分析和分子模拟在新型生物活性肽筛选和评估过程中能够更加高效、节约成本。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽及制备方法、鉴定方法。

2、具体而言，本发明提供如下技术方案：

3、一种宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽，其氨基酸序列为以下序列的至少一种：

4、氨基酸序列自c端至n端为：

5、asp-gly-trp-his-ser-trp；

6、val-phe-tyr-pro-trp；

7、gly-thr-gly-trp；

8、thr-tyr-phe-pro-his-phe。其序列分别如seq id no：1-4所示。

9、本发明所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法：从宁夏肉牛血红蛋白中酶解提出多肽粗提物，使用超滤杯超滤得到分子量<3kda的粗提物中获得。

10、具体包括下列步骤：

11、(1)新鲜牛血中加入柠檬酸钠并混合均匀，经纱布过滤除掉杂质，3000g和4℃条件下离心15min；取沉淀与去离子水按1：1比例缓慢晃动5min，使血细胞溶胀破碎释放血红蛋白；使用超声细胞粉碎机破碎血细胞，3500g和4℃条件下离心15min后取上清液冷冻干燥备用，干燥后得到牛红蛋白粉；

12、(2)将步骤(1)制得的牛红蛋白粉复溶配置成牛红蛋白去离子溶液，依此添加0.6％(w/w)的碱性蛋白酶、1.0％(w/w)的胃蛋白酶和2.0％(w/w)胰蛋白酶进行酶解；95℃水浴灭酶，冷却至室温，离心取上清液；取部分上清液采用膜分离技术进行分离，截留分子量<3kda粗提物为e3；将不同分子量的血红蛋白酶解液进行冷冻干燥后，得到抗氧化肽；

13、(3)选取体外抗氧化活性最好的组分e3进行高分辨质谱鉴定，所述组分的氨基酸序列为dgwhsw、vfypw、gtgw和tyfphf中的至少一种，分别如seq id no：1-4所示。

14、其中，所述步骤(1)中，柠檬酸钠的浓度为1.5％w/v。

15、其中，所述步骤(1)中，超声细胞粉碎机破碎血细胞的功率为300w，时间为20min，间歇比为2：3。

16、其中，所述步骤(2)中，牛红蛋白去离子溶液的浓度为10％w/v。

17、其中，所述步骤(2)中，离心速率为10000g，离心时间为20min。

18、本发明所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的鉴定方法，包括以下步骤：

19、1)使用web ofscience数据库检索，筛选分子量在300-1000da短肽，含有2-9个氨基酸残基；

20、2)使用肽段活性预测工具peptide ranker对步骤1)筛选出的活性肽进行预测；

21、3)使用等电点预测工具https://web.expasy.org/compute pi/对多肽等电点进行预测；

22、4)使用毒性预测工具https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred筛选无毒性的多肽；

23、5)使用anoxpepred预测工具https://services.healthtech.dtu.dk/services/anoxpepred-1.0/筛选出具有自由基清除能力的多肽；

24、6)在biopep数据库katedra biochemii(uwm.edu.pl)预测得到抗氧化肽活性片段；最终选择综合模拟评分排名靠前的18种肽。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

26、本发明利用酶解、超滤和lc-ms/ms技术从宁夏肉牛血红蛋白中高效筛选和鉴定新型抗氧化肽；采用计算机分析筛选生物活性肽，并通过体外实验验证；通过分子模拟揭示目标抗氧化肽的作用位点和机制。实验室验证和通过应用有效数据库相结合以及分子对接模拟抗氧化活性肽的主要作用靶点，有望实现快速，高效的抗氧化肽鉴定。

27、本发明筛选出的抗氧化肽具有较强抗氧化活性，具有高效、制备方法简单和重复性好的特点，在食品、医药等领域有广阔前景，为宁夏肉牛血红蛋白源功能性多肽产品的开发提供一种高效途径。

技术特征：

1.一种宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽，其特征在于：其氨基酸序列为dgwhsw、vfypw、gtgw和tyfphf中的至少一种，分别如seq id no：1-4所示。

2.权利要求1所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：从宁夏肉牛血红蛋白中酶解提出多肽粗提物，使用超滤杯超滤得到分子量<3kda的粗提物中获得。

3.根据权利要求2所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：

4.根据权利要求3所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，柠檬酸钠的浓度为1.5％w/v。

5.根据权利要求3所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，超声细胞粉碎机破碎血细胞的功率为300w，时间为20min，间歇比为2：3。

6.根据权利要求3所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，牛红蛋白去离子溶液的浓度为10％w/v。

7.根据权利要求6所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，离心速率为10000g，离心时间为20min。

8.权利要求1所述的宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明涉及抗氧化肽技术领域，尤其是一种宁夏肉牛血红蛋白源抗氧化肽及制备方法、鉴定方法，所述抗氧化肽的氨基酸序列为DGWHSW、VFYPW、GTGW和TYFPHF中的至少一种。本发明的抗氧化肽是从宁夏肉牛血红蛋白中酶解提出多肽粗提物，使用超滤杯超滤得到分子量<3kDa的粗提物中获得。本发明筛选出的抗氧化肽具有较强抗氧化活性，具有高效、制备方法简单和重复性好的特点，表明宁夏肉牛血红蛋白是食源性抗氧化肽的潜在来源，并且本发明方法可以用来快速筛选牛血中的活性肽。

技术研发人员：徐斐然,王玉,徐宝才,王兆明,蔡克周,周辉,章宝,周凯,马飞,崔伟
受保护的技术使用者：合肥工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23