一种产PQQ的甲基营养型菌株复壮培养基及复壮方法与流程

本发明属于生物工程，具体涉及一种产pqq的甲基营养型菌株复壮培养基及复壮方法。

背景技术：

1、吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone，pqq)为红褐色的具有强氧化还原活性的芳香三环邻位醌类化合物，是一种热稳定的小分子水溶性化合物，是继黄素核苷酸(fmn/fad)和吡啶核苷酸(nad/nadp)之后发现的第3种氧化还原酶辅因子。pqq的生产方法分化学合成法和生物合成法，其中生物合成法具有成本低、步骤少、分离更为容易的优点，是当前研究的主要方向。文献报道，甲基营养菌的pqq合成水平高且成本低廉，是一种非常有潜能的pqq生产菌株。甲基营养菌是一类能够利用一碳化合物，如甲烷、甲醇、甲酸、甲基胺类等作为唯一碳源和能源进行生长的代谢独特的微生物；根据其功能进行区分，甲基营养菌可以分为甲烷利用菌，和另一类不能利用甲烷，但能够利用甲醇和其他甲基化合物的微生物，包括生丝微菌属、假单胞菌属和精朊杆菌属的某些种。

2、由于微生物有变异的特性，菌种在生产和保藏过程中会不断地发生变异，引起衰退。目前，pqq生物发酵合成pqq中对菌种的研究多集中于高产菌株的筛选、诱变、工程菌株构建方面。工程菌株构建手段还不成熟，产量低。而在菌种选择方面多依赖筛选和驯化，存在菌种筛选周期长、工作量大、筛选困难和性状丢失不好恢复的问题。为了提高菌株的生长及生产性能，稳定pqq发酵生产，使已经衰退的菌种或尚未表现出衰退的菌种稳定原有的性能，必须定期进行菌种的复壮，因此建立一种产pqq的甲基营养型菌株复壮方法十分有必要。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种产pqq的甲基营养型菌株复壮培养基及复壮方法。本发明的甲基营养型菌株复壮培养基包括菌株耐受筛选上层固体培养基、菌株耐受筛选下层固体培养基、甲醇定向驯化上层固体培养基和甲醇定向驯化底层固体培养基。本发明通过改变培养基成分，特别是添加发酵稳定期中后期的发酵液上清以及甜菜碱、苹果酸，可刺激菌体生长，提高菌体生长速率。以及采用梯度平板筛选法，可以在较短时间内获得耐受高浓度甲醇及pqq产量高的菌株。

2、本发明的第一个目的是提供一种产pqq的甲基营养型菌株复壮培养基，其特征是，包括菌株耐受筛选上层固体培养基、菌株耐受筛选下层固体培养基、甲醇定向驯化上层固体培养基和甲醇定向驯化底层固体培养基；

3、所述菌株耐受筛选上层固体培养基组成为：琼脂10～20g/l、发酵中后期的发酵液上清10～90％(体积比)，甲醇5～10g/l；

4、所述菌株耐受筛选底层固体培养基组成为：(nh)2so4 3～5g/l、kh2po4 1～1.5g/l、na2hpo4.12h2o 7～8g/l、mgso4.7h2o 0.3～0.5g/l、feso4.7h2o 0.5～1ml/l、苹果酸2～3g/l、甜菜碱1～2g/l、丙二酸1～2g/l、微量元素0.5～1ml/l、琼脂10～20g/l。其中微量元素组成：znso4.h2o 20～25g/l、mnso4.5h2o 4～5g/l、cuso4.7h2o 0.7～0.8g/l、nacl 1～2g/l、ki 25～35mg/l、cocl2.6h2o 25～35mg/l、cacl2.6h2o 25～35g/l、(nh4)6mo7o24.4h2o 25～35mg/l、h3bo3 25～35g/l。

5、所述甲醇定向驯化上层固体培养基组成：琼脂0～20g/l，甲醇10～20g/l；

6、所述甲醇定向驯化底层固体培养基：同上述菌株耐受筛选底层固体培养基。

7、本发明的第二个目的是提供上述产pqq的甲基营养型菌株复壮方法，其特征是，

8、1)菌株耐受筛选复壮方法：

9、先倒入菌株耐受筛选底层固体培养基，把培养板斜放，凝固后将平板平放，再倒入0.8-1.2倍体积的菌株耐受筛选上层固体培养基，这样便可得到发酵液上清浓度从一边到另一边逐渐降低的梯度平板；

10、在此平板上涂布需复壮的菌株，经培养后，在发酵上清浓度比较高的部位长出的菌落中可分离到高耐受恶劣发酵环境的菌株；

11、2)甲醇定向驯化复壮方法：

12、先倒入甲醇定向驯化底层固体培养基，把培养板斜放，凝固后将平板平放，再倒入0.8-1.2倍体积的甲醇定向驯化上层固体培养基，这样便可得到甲醇浓度从一边到另一边逐渐降低的梯度平板；

13、在此平板上涂布步骤1)筛选得到的高耐受恶劣发酵环境的菌株，经培养后，在甲醇浓度比较高的部位长出的菌落中可分离到即耐受恶劣发酵环境又耐受高甲醇浓度的菌株。

14、本发明还提供了上述复壮菌株的验证及进一步筛选效价较高菌株的方法：将上述复壮筛选得到的即耐受恶劣发酵环境又耐受高甲醇浓度的菌株涂布于产物固体培养基中，选择5～10颗生长圆润、饱满、较大的单菌落，每颗点种2～4粒，28～32℃培养6～10天，得到点种单菌落；取点种单菌落，加入无菌水打散混匀，接种到产物液体培养基种瓶中做菌种验证培养，5天后检测效价，选择效价较高的菌株进行菌株保藏。

15、上述产物固体培养基组成为：(nh)2so4 3～5g/l、kh2po4 1～1.5g/l、na2hpo4.12h2o7～8g/l、mgso4.7h2o 0.3～0.5g/l、feso4.7h2o 0.5～1ml/l、苹果酸2～3g/l、甜菜碱1～2g/l、丙二酸1～2g/l、谷氨酸0.3～1g/l、酪氨酸0.3～1g/l、sds 0.02～0.06g/l、微量元素0.5～1ml/l、10～20g/l的琼脂。

16、上述产物液体培养基与产物固体培养基成分相同，但是不添加10-20g/l的琼脂。

17、本发明的有益效果是：

18、1、菌株衰退对发酵中后期的影响最大，衰退的菌株在发酵稳定期中后期性能会显著下降；复壮培养基中利用发酵稳定期中后期的发酵上清作为培养基基质配置菌株耐受筛选培养基可以提高菌株在发酵中后期发酵环境中生长和生产稳定性；

19、2、利用高浓度甲醇进行拮抗驯化，细胞应激合成具有完整功能的甲醇脱氢酶以加快甲醇的氧化消耗，从而促使菌株生长并进一步提高pqq合成；

20、3、在复壮培养基中添加甜菜碱经过转甲基后生成含两个甲基的二甲基甘氨酸，这两个甲基最终以一碳单位的形式参与四氢叶酸的合成，可为丝氨酸合成提供前体(丝氨酸循环是菌体生长过程中参与碳固定的作用)；苹果酸和丙二酸可以参与tca循环与丝氨酸循环，为菌体生长代谢提供还原力和碳固定，并且甘氨酸还参与丝氨酸循环进行碳固定；

21、4、在pqq生产中，添加谷氨酸和酪氨酸为pqq的合成提供前体物质；sds添加可增加细胞膜通透性，增加细胞对氨基酸物质的摄取。上述方法可重新获得生长性能优良和pqq产量相对高的菌株。

技术特征：

1.一种产pqq的甲基营养型菌株复壮培养基，其特征是，包括菌株耐受筛选上层固体培养基、菌株耐受筛选下层固体培养基、甲醇定向驯化上层固体培养基和甲醇定向驯化底层固体培养基；

2.如权利要求1所述的一种产pqq的甲基营养型菌株复壮培养基，其特征是，所述微量元素组成为：znso4.h2o 20～25g/l、mnso4.5h2o 4～5g/l、cuso4.7h2o 0.7～0.8g/l、nacl 1～2g/l、ki 25～35mg/l、cocl2.6h2o 25～35mg/l、cacl2.6h2o 25～35g/l、(nh4)6mo7o24.4h2o25～35mg/l、h3bo3 25～35g/l。

3.采用权利要求1或2所述的复壮培养基进行产pqq的甲基营养型菌株的复壮方法，其特征是，

4.如权利要求3所述的复壮方法，其特征是，在步骤2)的基础上，进行复壮菌株的验证及进一步筛选效价较高菌株，具体为：将筛选到的复壮菌株涂布于产物固体培养基中，选择5～10颗生长圆润、饱满、较大的单菌落，每颗点种2～4粒，28～32℃培养6～10天，得到点种单菌落；取点种单菌落，加入无菌水打散混匀，接种到产物液体培养基种瓶中做菌种验证培养，5天后检测效价，选择效价较高的菌株进行菌株保藏。

5.如权利要求4所述的复壮方法，其特征是，所述产物固体培养基组成为：(nh)2so43～5g/l、kh2po4 1～1.5g/l、na2hpo4.12h2o 7～8g/l、mgso4.7h2o 0.3～0.5g/l、feso4.7h2o0.5～1ml/l、苹果酸2～3g/l、甜菜碱1～2g/l、丙二酸1～2g/l、谷氨酸0.3～1g/l、酪氨酸0.3～1g/l、sds 0.02～0.06g/l、微量元素0.5～1ml/l、10～20g/l的琼脂。

6.如权利要求4所述的复壮方法，其特征是，所述产物液体培养基组成为：(nh)2so43～5g/l、kh2po4 1～1.5g/l、na2hpo4.12h2o 7～8g/l、mgso4.7h2o 0.3～0.5g/l、feso4.7h2o0.5～1ml/l、苹果酸2～3g/l、甜菜碱1～2g/l、丙二酸1～2g/l、谷氨酸0.3～1g/l、酪氨酸0.3～1g/l、sds 0.02～0.06g/l、微量元素0.5～1ml/l。

技术总结
本发明公开了一种产PQQ的甲基营养型菌株复壮培养基及复壮方法。本发明的甲基营养型菌株复壮培养基包括菌株耐受筛选上层固体培养基、菌株耐受筛选下层固体培养基、甲醇定向驯化上层固体培养基和甲醇定向驯化底层固体培养基。本发明通过改变培养基成分，特别是添加发酵稳定期中后期的发酵液上清以及甜菜碱、苹果酸等，可刺激菌体生长，提高菌体生长速率。以及采用梯度平板筛选法，可以在较短时间内获得耐受高浓度甲醇及PQQ产量高的菌株。

技术研发人员：刘灿珍,张晓君,刘凯,王硕,马志婷
受保护的技术使用者：广西天铭药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23