一种一管式光控CRISPRCas核酸检测方法

本发明涉及生物检测，具体涉及一种一管式光控crispr/cas核酸检测方法。

背景技术：

1、crispr/cas系统由成簇、规则间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，crispr)和crispr相关蛋白(crispr-associated protein，cas)组成，是一种广泛存在于多数细菌和古细菌中的适应性免疫系统。2011年，makarova等揭示了crispr/cas系统通过适应、表达和干扰3个阶段介导的免疫机理，在适应阶段，与病毒或质粒序列同源的短dna片段会被整合到crispr自身的间隔区；在表达阶段，crispr基因序列的一级转录本pre-crrna产生，并被加工成crrna，crrna与病毒或质粒的靶序列匹配；在干扰阶段，crrna将cas蛋白引导至与间隔区匹配的病毒或质粒靶序列处形成效应复合物，并利用cas蛋白切割靶序列。利用crispr/cas系统特异的序列识别及切割活性，将其应用于核酸检测中，为提高检测灵敏度及特异性等性能指标提供了一种新思路。

2、基于crispr/cas系统的检测技术主要是利用crispr/cas系统原有的适应、表达和干扰3个阶段，进行针对性的改造以实现特异性靶标的检测。通过人工设计向导rna(single-guide rna，sgrna)，使其特异性识别靶序列后，cas蛋白裂解靶序列从而形成特异性的双链断裂(double strand breaks，dsb)。不同的cas蛋白应用于核酸检测中的机制存在差异，基于cas9的核酸检测主要依赖于特异性识别靶序列的能力，其不具备反式切割活性；基于cas12、cas13及cas14的核酸检测方法依赖于cas蛋白的反式切割活性，当cas蛋白与sgrna、靶序列形成效应复合物时，其反式切割活性被激活，对已被标记的ssrna或ssdna报告基因进行切割，从而释放出信号达到检测效果。因此，将crispr/cas技术结合核酸等温扩增方法，如重组酶聚合酶扩增(rpa)或环介导等温扩增(lamp)，可以实现灵敏检测。

3、然而，这些结合方法仍然面临着一些挑战和瓶颈，crispr/cas技术在核酸检测中主要应用于核酸扩增后信号进一步放大和信号转化及输出，通常将核酸扩增和核酸检测分开进行，这不仅增加了检测过程的复杂性，而且还可能被气溶胶污染，导致假阳性结果。而一管中同时进行等温扩增反应与crispr/cas反应时，crispr/cas切割反应会裂解核酸扩增模板和扩增引物，从而影响扩增效率和检测灵敏度。

4、menglu hu等开发了一种光控crispr检测技术，通过设计沉默核苷酸与引导rna互补，从而阻断crispr体系的识别切割功能。同时，该沉默核苷酸链由可被紫外光断裂的连接子偶联。当将这种失活的crispr检测体系与核酸等温扩增技术结合到一管内反应时，核酸模板不会被crispr所切割，所以扩增效率不受影响。当核酸扩增完成以后，用光激活crispr启动检测过程。光控crispr方法将核酸扩增和crispr检测在时间维度上分开，实现了无需开盖转移试剂的封闭式核酸检测(photocontrolled crrna activation enables robustcrispr-cas12adiagnostics.proc natl acad sci u s a,2022,119(26):e2202034119.)。然而，这些方法存在方法不通用、需要预杂交步骤、设计复杂等缺陷，限制了在核酸检测中的广泛应用。

5、因此，开发简单、通用的一管式光控crispr/cas检测方法是本领域技术人员需要解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种简单、通用的非诊断为目的的核酸检测方法，通过在一个反应管中将等温扩增反应和crispr/cas检测反应在时间维度上分开，既有效提高了检测灵敏度，又可避免开盖检测导致的气溶胶污染。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供了一种一管式光控crispr/cas核酸检测方法，包括以下步骤：

4、(1)将待测核酸样本、沉默dna、具有反式切割活性的cas蛋白、用于识别核酸靶序列的sgrna、报告探针加入到核酸等温扩增反应体系中构建crispr/cas-等温扩增反应体系；所述沉默dna为随机脱氧核苷酸组成的单链dna片段，序列中间由光可断裂的连接子连接，其中dna骨架上的若干磷酸酯键被硫代磷酸酯键取代；

5、(2)将所述crispr/cas-等温扩增反应体系置于恒温条件下进行等温扩增反应，然后经光照射处理后置于cas蛋白反式切割条件下进行反应，最后检测报告探针释放的探针信号，进而判断待测核酸样本中是否存在靶序列或者对靶序列进行定量分析。

6、本发明的检测原理如下：

7、本发明采用的cas蛋白既具有特异性识别并剪切双链dna(dsdna)活性，又具有非特异性切割单链dna(ssdna)活性。cas蛋白与sgrna结合形成核酸蛋白复合体，识别并切割靶标核酸，同时激活cas蛋白的反式切割活性，非特异性切割周围的报告探针，释放可被检测的信号。

8、本发明设计的通用沉默dna可以抑制cas蛋白切割活性，从而阻断对报告探针的切割。同时，设计的沉默dna由光敏分子连接，利用光照处理即可使得沉默dna发生断裂，从而恢复cas蛋白活性。

9、当将沉默的crispr/cas检测反应与核酸扩增反应结合到一管反应时，核酸扩增反应的模板和引物不会被crispr/cas所切割，从而保障扩增效率不受影响。当核酸扩增完成后，可用光照射处理裂解沉默dna，使其裂解成两个片段，cas蛋白切割活性恢复，从而恢复crispr/cas检测。

10、这种检测方式将核酸扩增反应与crispr/cas检测反应在时间维度上分开，不仅可以实现高检测灵敏度，还不需要额外的预杂交步骤，是一种简单、通用的光控crispr/cas检测方法。

11、本发明采用的沉默dna为具有硫代磷酸酯(phosphorothioates,ps)修饰的单链dna片段，其具有抑制cas蛋白切割活性。所述硫代磷酸酯修饰是指被硫代磷酸酯化的核苷酸间键修饰，即dna骨架上若干磷酸二酯键上的一个非桥连的氧原子被硫原子取代。

12、本发明研究表明，所述沉默dna抑制cas蛋白切割活性与dna序列组成以及硫代磷酸酯(ps)修饰模式(是否连续修饰或间隔修饰)无关，但与硫代磷酸酯(ps)键个数以及反应体系中作用浓度有关。

13、所述沉默dna为随机脱氧核苷酸(a\c\g\t)组成的单链dna片段，序列长度可以为3-30nt，其中硫代磷酸酯键修饰占比30％-100％。光可断裂的连接子插入在序列中间段的任意位置。

14、作为优选，所述沉默dna由18-20个随机脱氧核苷酸组成。具体的，单链dna片段的脱氧核苷酸组成可以为但不限于：aaaaccccggggttttacgt；cgcgttccgcaacacatagc。

15、作为优选，所述光可断裂的连接子插入在第8-12位的任意两核苷酸之间。具体的，连接子的插入位点为第8位和第9位、第9位和第10位、第10位和第11位、或者第11位和第12位的核苷酸之间。

16、作为优选，所述光可断裂的连接子为pc(photo-cleavable)连接子。pc连接子是一种非核苷分子，可以通过一个短的、uv光可切割的c3间隔臂连接两个核苷酸序列，即pclinker通过与核苷酸形成磷酸二酯键插入在核苷酸序列上。在紫外光(uv 365nm)下，pc连接子会裂解成一个5'-磷酸化低聚物和一个3'-磷酸化低聚物。本发明可采用的光可断裂的连接子并不局限于此。

17、作为优选，所述沉默dna中含有6-19个连续或非连续修饰的硫代磷酸酯键。更为优选，17个及以上硫代磷酸酯(ps)键，抑制率可达95％以上。

18、作为本发明的一种具体实施方式，所述沉默dna的核苷酸序列如seq id no.1所示。

19、作为优选，反应体系中，沉默dna的浓度为≥50nm。更为优选，反应体系中沉默dna的浓度为100～250nm，该浓度条件下对cas蛋白切割活性抑制率>90％。

20、作为优选，所述cas蛋白为以dna(dsdna或ssdna)为靶标的cas12蛋白，该蛋白不仅具有顺式切割活性，还具有反式切割活性。其中，反式切割活性可以切割随机ssdna。本发明也可以采用其他相似的cas蛋白。

21、作为优选，反应体系中，cas蛋白终浓度可为50-80nm。

22、本发明中，单链介导rna(sgrna)是根据靶标序列设计的rna链，由crispr rna(crrna)链和反式激活crrna(tracrrna)链嵌合构成，其间隔区(spacer sequence)为特异性识别靶标区域，sgrna可与cas蛋白结合形成核酸蛋白复合体，引导核酸蛋白复合体识别并切割靶标核酸。

23、作为优选，反应体系中sgrna终浓度可为250-400nm，确保cas蛋白与sgrna充分形成核酸蛋白复合体以识别和切割靶标核酸。

24、本发明中报告探针可以采用但不限于荧光报告探针。优选的，所述报告探针为两端分别修饰有荧光基团和淬灭基团的富含尿嘧啶的ssrna或富含脱氧胸腺嘧啶的ssdna片段。荧光报告探针一端连接荧光基团，另一端连接淬灭基团，其被切割后可产生荧光信号。所述荧光基团可以采用但不限于羧基荧光素(fam)，淬灭基团可以采用但不限于bhq1。优选的，报告探针序列为：fam-ttttt-bhq1。

25、作为优选，反应体系中报告探针终浓度为1μm，以保证反应体系中存在充足的报告探针可被切割。

26、本发明中，所述等温扩增反应可以为但不限于环介导等温扩增反应或重组酶聚合酶扩增反应或滚环扩增反应。

27、所述等温扩增反应体系中的等温扩增引物是根据靶标序列设计的ssdna核酸链。

28、作为优选，环介导等温扩增反应体系的组成包括：lamp缓冲液、bst3.0dna聚合酶、dntp、扩增引物、l-脯氨酸。

29、bst 3.0dna聚合酶是一种lamp扩增常用的高效dna聚合酶。反应体系中，bst3.0dna聚合酶终浓度为0.16u/μl，以保证核酸扩增反应高效进行并产生大量扩增产物。

30、l-脯氨酸是一种化学反应助剂，可以减少cas蛋白在不利的胁迫或条件下的活性损失。

31、环介导等温扩增反应温度一般为60-65℃。crispr/cas反应的温度条件一般为60-65℃。作为优选，步骤(2)中，反应温度为62℃，以保证核酸扩增反应和cas蛋白切割反应的高效进行。

32、作为优选，所述等温扩增的反应时间为45min，所述uv 365nm光裂解时间为3min，所述crispr/cas检测时间为42min。

33、本发明具备的有益效果：

34、(1)相较于使用靶向sgrna的保护性核苷酸或沉默核苷酸光控体系，本发明提供的沉默dna直接靶向cas蛋白，无需随检测靶标的改变而调整，无需预杂交沉默dna与sgrna，具有通用性和简便性。

35、(2)相较于分步反应体系，本发明的一管式检测方法无需开盖操作，不仅避免了气溶胶污染的产生，还简化了实验步骤。

技术特征：

1.一种一管式光控crispr/cas核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一管式光控crispr/cas核酸检测方法，其特征在于，所述沉默dna由18-20个随机脱氧核苷酸组成。

3.如权利要求2所述的一管式光控crispr/cas核酸检测方法，其特征在于，所述光可断裂的连接子插入在第8-12位的任意两核苷酸之间。

4.如权利要求1或3所述的一管式光控crispr/cas核酸检测方法，其特征在于，所述光可断裂的连接子为pc连接子。

5.如权利要求1或2所述的一管式光控crispr/cas核酸检测方法，其特征在于，所述沉默dna中含有6-19个连续或非连续修饰的硫代磷酸酯键。

6.如权利要求1或2所述的一管式光控crispr/cas核酸检测方法，其特征在于，反应体系中，沉默dna的浓度为≥50nm。

7.如权利要求1所述的一管式光控crispr/cas核酸检测方法，其特征在于，所述cas蛋白为cas12蛋白。

8.如权利要求1所述的一管式光控crispr/cas核酸检测方法，其特征在于，所述报告探针为两端分别修饰有荧光基团和淬灭基团的ssrna或ssdna片段。

9.如权利要求1所述的一管式光控crispr/cas核酸检测方法，其特征在于，所述等温扩增反应为环介导等温扩增反应、重组酶聚合酶扩增反应或滚环扩增反应。

技术总结
本发明公开了一种一管式光控CRISPR/Cas核酸检测方法，属于生物检测技术领域。所述检测方法包括：(1)将待测核酸样本、沉默DNA、Cas蛋白、sgRNA、报告探针加入到核酸等温扩增反应体系中，所述沉默DNA为随机脱氧核苷酸组成的单链DNA片段，序列中间由光可断裂的连接子连接，其中DNA骨架上的若干磷酸酯键被硫代磷酸酯键取代；(2)将反应体系置于恒温条件下进行等温扩增反应，然后经光照射处理后进行CRISPR/Cas反应，最后检测报告探针释放的探针信号。本发明所用的沉默DNA直接靶向Cas蛋白，无需随检测靶标的改变而调整，无需预杂交沉默DNA与sgRNA，具有通用性和简便性。

技术研发人员：林星宇,张超,罗自生,徐艳群,李栋
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23